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- Carsten K. Rath

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Zentrum für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie
Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Standort Marburg
Praktikum der Medizinischen Mikrobiologie
und Immunologie
für Studierende der Humanmedizin
Altes Hygieneinstitut am Pilgrimstein
Studienjahr Wintersemester 2014-15 – Sommersemester 2015
Teil 1: Wintersemester 2014-2015
1
Inhaltsverzeichnis
Seite
Kursplan
3
Allgemeine Regeln
4
Kursteil 1:
Materialgewinnung
8
Kursteil 2:
Lebendbeobachtung von Bakterien
Kultivierung von Bakterien
9
12
Kursteil 3:
Färbung von Bakterien
Einfache Differenzierungen
Identifizierung von Bakterien
14
17
19
Kursteil 4:
(Hygiene)
Temperaturempfindlichkeit von Bakterien
Nachweis von Keimen im Trinkwasser
Mikrobielle Besiedlung der Hände
22
24
31
Kursteil 5:
Auswertung Kursteil 4 (Hygiene)
Urinkultur I
Rachenabstrich I
22-35
36
38
Kursteil 6:
Antibiotikaaustestung I
Urinkultur II
Rachenabstrich II
Corynebakterien
39
40
41
42
Kursteil 7:
Antibiotikaaustestung II
Anaerobier I
Blutkultur I
Darmpathogene Keime I
44
46
48
49
Kursteil 8:
Anaerobier II
Blutkultur II
Darmpathogene Keime II
50
50
51
Kursteil 9:
Mykologie
52
Kursteil 10:
Mykobakterien
Differenzialdiagnosen I + II
61
65
Kursteil 11:
Differentialdiagnose einiger dringender
mikrobiologischer Krankheitsbilder
66
Sicherheitsbelehrung nach UVV Biotechnologie, Arbeitssicherheit,
Unfallverhütung
und Hygieneunterweisung
Der/die Beschäftigte bestätigt mit seiner/ihrer Unterschrift auf der
Anwesenheitsliste die Teilnahme an der Unterweisung
2
WS 2014-15
Med. Mikrobiologie für Studierende der Humanmedizin / 1. klinisches Studienjahr
Praktikumstermine
SW
Datum
Ort
Zeit
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
13
Fr. 17.10.14
Di 21.10.14
Di 28.10.14
Di 04.11.14
Di 11.11.14
Di 18.11.14
Di 25.11.14
Di 02.12.14
Di 09.12.14
Di 20.01.15
Di 27.01.15
HS II Klinikum/Lb.
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
12:00-13:45
10:00-11:30
10:00-11:30
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
Kohorten /
Gruppen
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
Innere 1-6
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
13
Fr. 17.10.14
Mi 22.10.14
Mi 29.10.14
Mi 05.11.14
Mi 12.11.14
Mi 19.11.14
Mi 26.12.14
Mi 03.12.14
Mi 10.12.14
Mi 21.01.15
Mi 28.01.15
HS II Klinikum/Lb.
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
12:00-13:45
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
13
Fr. 17.10.14
Do 23.10.14
Do 30.10.14
Do 06.11.14
Do 13.11.14
Do 20.11.14
Do 27.11.14
Do 04.12.14
Do 11.12.14
Do 22.01.15
Do 29.01.15
HS II Klinikum/Lb.
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
13
Fr. 17.10.14
Fr 24.10.14
Fr 31.10.14
Fr 07.11.14
Fr 14.11.14
Fr 21.11.14
Fr 28.12.14
Fr 05.12.14
Fr 12.12.14
Fr 23.01.15
Fr 30.01.15
HS II Klinikum/Lb.
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Kurssaal/Bmfz
Dozenten
Themen
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Mutters
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Einführung
Bakteriologie
Bakteriologie
Hygiene
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Mykologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Chir. 1-6
Chir. 1-6
Chir. 1-6
Chir. 7-12
Chir. 1-6
Chir. 7-12
Chir. 1-6
Chir. 7-12
Chir. 1-6
Chir. 1-6
Chir. 7-12
Lohoff
Sommer
Sommer
Mutters
Sommer
Kerwat
Sommer
Kerwat
Sommer
Sommer
Kerwat
Einführung
Bakteriologie
Bakteriologie
Hygiene
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Mykologie
Bakteriologie
Bakteriologie
12:00-13:45
10:00-11:30
10:00-11:30
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Innere 7-12
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Mutters
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Lohoff
Einführung
Bakteriologie
Bakteriologie
Hygiene
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Mykologie
Bakteriologie
Bakteriologie
12:00-13:45
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
8:30-10:00
Chir. 7-12
Chir. 7-12
Chir. 7-12
Chir. 1-6
Chir. 7-12
Chir. 1-6
Chir. 7-12
Chir. 1-6
Chir. 7-12
Chir. 7-12
Chir. 1-6
Lohoff
Kerwat
Kerwat
Mutters
Kerwat
Sommer
Kerwat
Sommer
Kerwat
Kerwat
Sommer
Einführung
Bakteriologie
Bakteriologie
Hygiene
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Bakteriologie
Mykologie
Bakteriologie
Bakteriologie
3
Kriterien für die Scheinvergabe
Am ersten Praktikumstag müssen alle Teilnehmerinnen im Besitz des aktuellen Kursskripts sein (pdf-File,
Homepage Institut Med. Mikrobiologie). Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen werden in
den Protokollblättern im Kursskript dokumentiert, diese können am Ende des Kurses für die Erteilung des
Scheines herangezogen werden.
Die Teilnahme am Praktikum wird durch Anwesenheitskontrolle überprüft. Bei Versäumnis von mehr als
10% kann von einer regelmäßigen Teilnahme nicht mehr ausgegangen werden und die Scheinvergabe
ist in Frage gestellt. In Einzelfällen kann der versäumte Unterricht nachgeholt werden.
Vorraussetzung für eine Scheinvergabe ist das Bestehen einer mündlichen Prüfung am Ende des Kurses,
dabei wird der Themenkomplex Medizinische Mikrobiologie (d.h. Bakteriologie, Mykologie und
Immunologie) sowie die praktischen Kenntnisse, die während des Kurses erworben wurden, geprüft. Die
mündliche Prüfung kann zweimal wiederholt werden, danach ist eine erneute Teilnahme am gesamten
Kurs im folgenden Semester notwendig.
Die schriftliche Prüfung findet in der Regel zu Beginn des folgenden Sommersemesters statt.
Allgemeine Regeln
Maßnahmen bei Zwischenfällen:
Immer: Zwischenfall dem/der Kursassistenten(in) melden!
Vorgehen bei:
Hautkontakt mit Mikroorganismen:
Kontaminierte Bereiche mit Hautdesinfektionsmitteln behandeln (Sterilium).
Bei Verletzungen und nach Inkorporation von Mikroorganismen (Verschlucken, Einatmen
von Aerosolen, Kontakt mit Schleimhäuten) ist der Betroffene nach einer eventuell erforderlichen
Erste-Hilfe-Behandlung dem Betriebsarzt vorzustellen.
Kontamination der Kleidung oder des Arbeitsplatzes:
Sofort mit Desinfektionslösung dekontaminieren (siehe Hygieneplan)
Im Gefahrenfall ist analog der Brandschutzverordnung (Notfallplan) zu verfahren.
Notfallplan
•
Ruhe bewahren
•
Brand bzw. Unfall melden:
- Feuerwehr 112
- Feuermelder betätigen
•
Inhalt der Meldung:
- Was ist passiert.
- Wo ist es passiert.
- Sind Menschen in Gefahr?.
- Wer meldet (Name, Telefon)
•
In Sicherheit bringen
•
Löschversuch unternehmen
- gefährdete Personen warnen
- hilflose Personen in Sicherheit bringen
- Türen und Fenster schließen
- gekennzeichneten Fluchtweg benutzen
- im Brandfall keinen Aufzug benutzen
- vorhandene Löschgeräte benutzen
4
Hygieneplan für den Kurssaal
WAS
WANN
WOMIT
Hygienische
Händedesinfektion
(vor dem Waschen)
Nach Beenden jeder
mikrobiologischen
Arbeit
Händereinigung /
Waschen
Nach Beenden jeder
mikrobiologischen
Arbeit
Grundsätzlich erst
nach der
Händedesinfektion
Pflegen der Hände
Nach dem
Händewaschen
Nach jeder
möglichen
Kontamination
Händedesinfektionsp
räparat aus dem
Direktspender
Präparat: Sterilium
Dosierung: 2-3 Hübe
Hautschonendes
Waschpräparat aus
dem Direktspender
Präparat: Baktolin
Dosierung: 1 Hub
Handtuch zum
einmaligen
Gebrauch
Handcreme
Präparat: Eucerin
Präparat: Sekusept
Dosierung: 1%
Thermolabile
Instrumente.
Werkbänke
Nach Beenden
jeglicher
mikrobiologischen
Arbeit
Präparat: Sekusept
Dosierung: 1%
Zentrifugen
Nach jeder
möglichen
Kontamination
Präparat: Sekusept
Dosierung: 1%
Oberflächen von
Nach jeder
Geräten und Inventar möglichen
Kontamination
Präparat: Sekusept
Dosierung: 1%
Fußböden
Nach jeder
möglichen
Kontamination
Präparat: PurseptFD
Dosierung: 2%
Schutzkleidung
Alle 2 Wochen, nach
jeder möglichen
Kontamination
Textilsack
Abfälle, die
möglicherweise
kontaminiert sind
Sofort
In geeigneten
Behältern (schwarze
Tonnen)
WIE
Einreiben, verteilen,
mindestens 5
Minuten einwirken
lassen, erst danach
Hände waschen
Waschen
Jeder, der im Labor
arbeitet
Pflegen
Jeder, der im Labor
arbeitet
Desinfizieren und
Reinigen: unter
Verwendung von
Handschuhen mit
Lappen einreiben
oder in Lösung
einweichen, 1h
Einwirken lassen
Desinfizieren und
Reinigen: unter
Verwendung von
Handschuhen mit
Lappen einreiben, 1h
Einwirken lassen
Desinfizieren und
Reinigen: unter
Verwendung von
Handschuhen mit
Lappen einreiben, 1h
Einwirken lassen
Desinfizieren und
Reinigen: unter
Verwendung von
Handschuhen mit
Lappen einreiben, 1h
Einwirken lassen
Desinfizieren und
Reinigen: unter
Verwendung von
Handschuhen mit
Lappen einreiben, 1h
Einwirken lassen
Sammeln,
Desinfektion und
Reinigung durch die
Wäscheversorgung
der Klinik
Sammeln, zur
Entsorgung geben
In Anlehnung an die Unfallverhütungsvorschrift „Biotechnologie“ (VBG 102 § 15.1)
5
WER
Jeder, der im Labor
arbeitet
Allgemeine Regeln für das Arbeiten im Praktikum
Da das Untersuchungsmaterial im Praktikum Krankheitserreger enthalten kann, müssen während der
gesamten Praktikumsdauer folgende Verhaltensregeln eingehalten werden:
• Während der Kursstunde ist grundsätzlich ein Kittel zu tragen. Diese Kittel dürfen nicht außerhalb
des Labors getragen werden.
• Kittel am Ende des Semesters wieder mitnehmen.
• Verbliebene Kittel werden in den Semesterferien entsorgt!!!
• Fenster und Türen müssen während des Kurses geschlossen sein.
• In den Laborräumen ist Essen, Trinken und Rauchen untersagt. Lebensmittel dürfen nicht mit in
den Kurssaal genommen werden.
• Pipettieren mit dem Mund ist untersagt. Pipettierhilfen sind zu benutzen.
• Bei den Arbeiten mit Mikroorganismen dürfen keine Aerosole entstehen.
• Hautwunden sind durch einen Verband oder Pflaster zu schützen. Einmal-Handschuhe
stehen zur Verfügung.
• Die Labortische sollen sauber und aufgeräumt sein. Die Arbeitstische dürfen nicht als
Abstellflächen benutzt werden. (Keine Taschen etc. auf die Labortische legen!)
• Nach Beendigung der Arbeit muss eine sorgfältige Händedesinfektion durchgeführt werden
(siehe Bakteriologie, Versuch 1).
• Achtung offene Flamme! Lange Haare zusammenbinden! Keine brennbaren Flüssigkeiten (z.B.
Alkohol) in Flammennähe aufbewahren.
•
Schwangere Kursteilnehmerinnen sind verpflichtet die Kursleitung über die
Schwangerschaft zu informieren, da aus Gründen des Arbeits- und Gesundheitsschutzes
die Kursteilnahme dann nicht möglich ist.
Spezielle Anweisungen für den Kurssaal
•
•
•
•
•
Die Platinösen werden vor und unmittelbar nach Gebrauch in der nicht leuchtenden
Bunsenbrennerflamme bis zur Rotglut ausgeglüht, der Halter wird mit der Öse nach oben in den
Halterklotz gesteckt.
Sämtliche Petrischalen müssen mit dem Deckel nach unten abgelegt werden, um
Verunreinigungen der Kulturen durch herab laufendes Kondenswasser zu vermeiden.
Beschriftungen von Kulturgefäßen müssen grundsätzlich auf dem unverwechselbaren Teil
angebracht werden (z. B. bei Petrischalen auf dem Gefäßboden).
Alle Gefäße, die am Ende der Kursstunde eingesammelt werden, um am nächsten Kurstag
wieder ausgeteilt zu werden, müssen mit der Platznummer gekennzeichnet sein.
Öffnen der Gefäße, in denen sich Bakterienkulturen befinden, nur bei Bedarf und möglichst
kurzzeitig, um Verunreinigungen aus der Luft zu vermeiden. Die Öffnungen von Glasgefäßen
sollen nach dem Öffnen und vor dem Schließen leicht mit dem Bunsenbrenner abgeflammt
werden.
Sollte es bei einem Bunsenbrenner zum Durchschlagen der Flamme kommen, dann muss der
Gashahn sofort geschlossen werden. Weil 96%iger Alkohol auf den Arbeitsflächen steht, ist
größte Vorsicht bei der Benutzung des Bunsenbrenners geboten.
Es wird erwartet, dass die Mikroskope sorgfältig behandelt werden. Wenn die Ölimmersion
benutzt wird, ist die Mikrometerschraube mit der nötigen Vorsicht zu betätigen, weil sonst Gefahr
besteht, dass der Objektträger zerdrückt und die Objektivlinse beschädigt wird. Reinigen der
Objektive von anhaftendem Immersionsöl: am Ende der Kursstunde mit dem dafür
vorgesehenen Läppchen.
6
Ausstattung des bakteriologischen Arbeitsplatzes
Für die Herstellung mikroskopischer Präparate:
1. Objektträger
2. Hohlschliff-Objektträger
3. Deckgläschen
4. Halterung mit Ösen und Pinzetten
5. 1 Vaselinefläschchen mit Spatel
6. Fettstift (Edding)
Für Färbungen:
1. Färbebank
2. Färbepinzette
3. Färbelösungen (alle gebrauchsfertig)
4. Flasche mit 96%igem Äthylalkohol bzw. 3%igem HCl-Alkohol
5. Fließpapier zum Trocknen der gefärbten Präparate
Zur Betrachtung von mikroskopischen Präparaten:
1. Mikroskop: Binokular: 10-fach
Objektiv:
Trockensystem (2,5-, 10-, 40-fach)
Immersionssystem (100-fach)
Vergrößerung = Objektivvergrößerung x Okularvergrößerung
2. Immersionsöl
3. Läppchen für die Reinigung der Objektive
Zur Keimabtötung:
1. Bunsenbrenner
2. Glaszylinder mit Desinfektionslösung: Pipetten, Spatel und gebrauchte Objektträger
Müllentsorgung:
1. Gelben Plastikbehälter: Spritzen und Kanülen
2. Papierkörbe: Gummihandschuhe, Restmüll
7
Kursteil 1
Kursteil 1 ist eine theoretische Veranstaltung mit allen Gruppen im Hörsaal!
Inhalte:
•
•
Grundprinzipien der Probengewinnung
Probentransport
Materialgewinnung, Probenentnahme und Probentransport
Für eine optimale mikrobiologische Diagnostik sind die adäquate Gewinnung und der bestmögliche
Transport des zu untersuchenden Materials von entscheidender Bedeutung. Das Material muss dabei
zum richtigen Zeitpunkt, in der richtigen Menge und vom richtigen Ort gewonnen werden. Der Transport
des Materials erfordert möglicherweise bei individuellen Keimen ganz besondere Transportmedien.
M E R K E:
Flüssiges Material soll möglichst so eingesandt werden wie es ist und nicht mit Hilfe eines
Abstrichtupfers!!!
8
Kursteil 2
•
•
Lebendbeobachtung von Bakterien
Kultivierung von Bakterien
Lebendbeobachtung von Bakterien
Die lichtmikroskopische Untersuchung steht am Anfang jeder bakteriologischen Untersuchung, sie ist
auch für Reinheitskontrollen, unentbehrlich. Form und Größe sowie Eigenbeweglichkeit der Bakterien
können einfach beurteilt werden. Die Größe der Bakterien bewegt sich im Bereich des
Auflösungsvermögens eines Lichtmikroskops, deshalb ist immer zur exakten Beurteilung die
Ölimmersionstechnik notwendig.
Form und Größe
Kokken
Erythrozyt
Diplokokken
in Haufen
in Ketten
Keulen
Hefezellen
Stäbchen
5 µm
Stäbchen mit
zentraler Endospore
Schrauben
Beweglichkeit
Flüssigkeitsstrom
(eine Richtung)
Brown'sche
Molekularbewegung
9
aktive
Eigenbewegung
Technische Durchführung
Sterile Materialentnahme aus einem Kulturröhrchen
Durchführung:
Vor Entnahme der Probe das Kulturröhrchen aufschütteln.
• Öse schräg halten, in der Gasflamme ausglühen, erkalten lassen.
• Verschluss des Röhrchens mit dem kleinen Finger der rechten Hand
abnehmen, nicht in offenes Röhrchen atmen!
• Röhrchenrand abflammen
• Mit der Öse Material entnehmen
• Röhrchenrand abflammen
• Röhrchen verschließen
• Das in der Öse enthaltene Material auf Objektträger aufbringen
• Öse ausglühen
Ausglühen der
Impföse
Herstellung eines "Deckglaspräparates" für Nativ- oder Lebendpräparate:
Durchführung:
• Mit der Öse aus dem Kulturröhrchen die Probe entnehmen und auf den Objektträger bringen.
• Tropfen mit einem Deckglas bedecken.
Mikroskopie: 40er Objektiv
Herstellung eines "Hängenden Tropfens" unter Verwendung eines Hohlschliffobjektträgers
Durchführung:
• Höhlung eines Hohlschliffobjektträgers dünn mit Vaseline umranden.
• Mit der Öse auf die Mitte eines Deckglases einen kleinen Tropfen der Probe bringen.
• Den vorbereiteten Hohlschliffobjektträger mit der Höhlung nach oben, Vaselinerand nach unten,
auf das materialbeschickte Deckglas auflegen.
• Umdrehen des Objektträgers, so dass das Deckglas oben liegt und das zu untersuchende
Tröpfchen frei in der durch den Hohlschliff gebildeten und luftdicht abgeschlossenen feuchten
Kammer hängt.
Hängender Tropfen
Deckglas
Vaseline
Hohlschliffobjektträger
Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
10
Mikroskopieren
Die direkte Mikroskopie lebender, unfixierter Keime hat vor allem die Kontrastarmut der Objekte
(Bakterien) zu überwinden. Dies kann durch spezielle Beleuchtungstechniken (Phasenkontrast,
Dunkelfeldmikroskopie) erreicht werden. Aber auch im normalen Durchlichtmikroskop können ungefärbte
Objekte beurteilt werden.
Dazu stehen zwei Methoden zur Verfügung:
• Deckglaspräparat
• „Hängender Tropfen“.
Ungefärbte Lebendpräparate werden bei gesenktem Kondensor und geschlossener Kondensorblende
beobachtet. Zuerst wird mit einer schwachen Vergrößerung (10er Objektiv) der Tropfenrand gesucht und
scharf eingestellt. Danach schwenkt man das 40er Objektiv ein.
Den hängenden Tropfen betrachtet man mit dem 100er Ölimmersionsobjektiv und mit geschlossener
Blende.
Aufgabe:
Größenvergleich von Hefepilzen, Erythrozyten und Bakterien
1. Herstellen eines Deckglaspräparates aus den Bouillonkulturen:
Röhrchen a = Hefezellen (ca.12 μ)
Röhrchen b = Erythrozyten (ca. 9 μ)
Röhrchen c = Pseudomonas fluorescens (gramneg. Stäbchen) (ca.1μ)
Röhrchen d = Staphylococcus epidermidis (grampos. Kokken) (ca. 0,8 μ)
Mikroskopie: 10er und 40er Objektiv
2. Herstellen eines „Hängenden Tropfens“ aus den Röhrchen C und D
Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
Protokollieren der Ergebnisse
Protokoll: Deckglaspräparat und hängender Tropfen
Form, Größe
X
X
X
X
Deckglaspräparat von a
Deckglaspräparat von b
Deckglaspräparat von c
Deckglaspräparat von d
Hängender Tropfen von c
Hängender Tropfen von d
Beweglichkeit
X
X
11
Kultivierung von Bakterien
Bakterien können in Flüssigkulturen und in semisoliden Agarnährmedien kultiviert werden. Die
Anzüchtung auf Agarnährmedien bietet den Vorteil, einzelne Kolonien zu erhalten. Damit kann eine
Keimisolierung aus einem Keimgemisch erreicht werden. Man unterscheidet Optimal-, Selektiv- und
Differentialnährmedien. Ein Optimalnährboden bietet für sehr viele unterschiedliche Bakterien gute
Wachstumsbedingungen (Beispiel: Blutagar). Ein Selektivnährboden lässt aufgrund von Zusätzen nur das
Wachstum einiger Bakterienspezies zu (z.B. McConkey Agar zum selektiven Wachstum von gramnegativen Enterobacteriaceae). Ein Differentialnährboden macht bestimmte Stoffwechselleistungen oder
Produkte von Bakterien sichtbar (z.B. Hämolyse auf Blutagar, Laktoseverstoffwechslung auf McConkey
Agar). Darüber hinaus sind viele Bakterien durch ihre typische Koloniemorphologie erkennbar
(z.B. schleimiges Wachstum von Klebsiella, schwärmendes Wachstum von Proteus, raues Wachstum
von Bazillus).
Technische Durchführung
Beimpfung von Flüssigkulturen
Durchführung:
• Mit ausgeglühter und wieder erkalteter Öse die Bakterien
aufnehmen.
• Durch Schräghalten der Flüssigkulturen werden die Bakterien
in den oberen
Bereich der Flüssigkeit gebracht und dort verteilt.
• Öse wieder ausglühen.
Beimpfen halbfester Medien
Durchführung:
• Mit ausgeglühter und wieder erkalteter Impfnadel die Bakterien
aufnehmen.
• Die Impfnadel tief in den halbfesten Agar einstechen.
• Impfnadel herausziehen und wieder ausglühen.
A
B eim p fen flü ss iger
M e d ie n
an der W and
einreiben
B
Beimpfen
Stichagarmedium
1.
2.
Beimpfen von Schrägagar
Durchführung:
• Mit ausgeglühter und wieder erkalteter Impfnadel die Bakterien
aufnehmen.
• Mit der Impfnadel tief in den Agar einstechen.
• Impfnadel aus der Hochschicht des Agars herausziehen und dann
wellenförmig auf Schrägagarfläche ausstreichen.
• Impfnadel wieder ausglühen.
12
C
Beimpfen SchrägStichagarmedien
(Kligler)
1.
3.
Fraktionierte Beimpfung der Nährbodenoberfläche mit der Öse
Durchführung:
Nach dem Ausglühen und Abkühlen der Öse wird ein Tropfen aus einem flüssigen Nährmedium, bzw.
eine Kolonie von einer Bakterienkultur entnommen und auf der Hälfte der Agaroberfläche in engen,
serpentinenartigen Impfstrichen verteilt. Anschließend wird die Öse wieder ausgeglüht. Mit der
ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse berührt man das bereits vorher beimpfte Feld und streicht
dann ein Viertel der Agaroberfläche aus. Das gleiche wird noch ein zweites Mal durchgeführt.
Beim Beimpfen der Agaroberfläche ist zu beachten, dass die Öse nur ganz leicht und locker auf dem
geleeartigen Nährboden gleiten und die Agaroberfläche nicht verletzen wird. Die beimpften Agarplatten
sind mit dem Deckel nach unten auf den Arbeitsplatz abzulegen.
Durch diese sog. „fraktionierte Aussaat“ erreicht man verschiedene Bakterienkonzentrationen auf der
Agaroberfläche und damit auch unterschiedlich dichtes Bakterienwachstum, was die Voraussetzung für
das Anlegen von Reinkulturen ist.
3 Ö s en au sstrich
1. A usstrich Ö se w echseln
2. A usstrich Ö se w echseln
3. A usstrich
S chräghalten der A garplatte
B eschriftung auf der
N ährbodenseite !
Aufgabe:
Kultivierung des Testkeims
Der Testkeim wird in der Technik des Dreiösenausstrichs ausgestrichen auf:
- Blutagar
- MacConkey-Agar
- Kulturen auf der Agarseite mit der Platznummer beschriften!
Die Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet und am nächsten Kurstag beurteilt und weiter bearbeitet.
Protokoll siehe Kursteil 3, Seite 21
13
Kursteil 3
•
•
•
Färben von Bakterien
Einfache Differenzierungen
Identifizierung von Bakterien
Färben von Bakterien
Die Anfertigung und Beurteilung gefärbter Präparate gehört zu den wichtigsten Fertigkeiten, die in diesem
Kurs vermittelt werden sollen. Ein Präparat ist die schnellste und kostengünstigste Methode eines
Keimnachweises. Die Unterscheidung von grampositiv und gramnegativ hat nicht nur systematische
Bedeutung, sondern ist auch ganz entscheidend für die Auswahl von Antibiotika für eine initiale Therapie.
Herstellen eines Färbepräparates
Durchführung:
• Von Abstrichmaterial:
Abstrich auf einem sauberen Objektträger ausdrücken und verteilen.
• Von Punktionsmaterial:
Flüssiges Material mit einer ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse aufnehmen und verteilen.
• Von Bakterienkolonie auf Agarplatte:
Auf einem sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse ein
Wassertröpfchen bringen.
Mit einer in gleicher Weise sterilisierten Öse sehr wenig Bakterienmasse aus einer Kolonie
aufnehmen. Die Bakterienmasse an den Rand des Wassertröpfchens aufbringen
und von dort in dieses homogen einreiben und das Tröpfchen ausbreiten.
• Von Suspensionskultur (Flüssigkultur):
Flüssigkultur aufschütteln, auf einen sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und
wieder abgekühlten Öse einen Tropfen Kulturmaterial bringen und verteilen.
Präparat lufttrocknen lassen (Keine Trocknung in der Flamme!)
Hitzefixierung:
Objektträger, Schichtseite nach oben, 3x durch die blaue Flamme des Bunsenbrenners ziehen
Bakteriologische Färbungen
Für Färbungen stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Man unterscheidet Einfachfärbungen,
die zur Kontrastverstärkung dienen, von Differentialfärbungen, die besondere Eigenschaften von
Bakterien nachweisen.
Beispiel für Einfachfärbungen ist die Methylenblaufärbung. Beispiel für Differentialfärbungen ist die
Gram-Färbung, die Kinyoun-Färbung (Ziel-Neelsen-Färbung) und die Neisserfärbung.
Beim Mikroskopieren von gefärbtem Untersuchungsmaterial sind ggf. weitere Punkte zu berücksichtigen
wie z. B.: sonstige Gebilde (Zellkerne, Epithelien, Leukozyten, Zelldetritus), die Lagerung von Bakterien
und Körperzellen zueinander, die ungefähre Menge der Bakterien pro Blickfeld (vereinzelt, mäßig viel,
reichlich, massenhaft).
14
Prinzip der Gram- Färbung
Bakterien unterscheiden sich in ihrem Zellwandaufbau. Dieser Unterschied kann durch die Gramfärbung
dargestellt werden.
Zellwandaufbau grampositiver und gramnegativer Bakterien
Lipopolysaccharid
gram-negativ
Äußere Membran
periplasmatischer Raum
Peptidoglykan
Innere Zellmembran
gram-positiv
Peptidoglykan
Innere Zellmembran
Kristallviolett oder Gentianaviolett bilden mit Lugol-Lösung (verdünnte Jod-Kaliumjodid-Lösung) im
Zytoplasma einen Farbstoff-Jod-Komplex. Durch Differenzieren mit Alkohol wird dieser Komplex aus
Bakterien, die eine dünne Peptidoglykanschicht besitzen, entfernt. Diese Bakterien werden gramnegative
Bakterien genannt. Im Gegensatz dazu bleibt der Farbstoffkomplex in Bakterien mit mehrschichtiger
Peptidoglykanwand erhalten (Gram-positive Bakterien). Zum Erkennen der gramnegativen Bakterien
müssen diese gegengefärbt werden, dies erfolgt mit Safranin.
Gramfärbung (Differenzialfärbung)
Durchführung:
• Präparat hitzefixieren
• Karbol-Gentianaviolett-Lösung
• Lugolsche Lösung
• Entfärben mit 96%igem Alkohol
• Abspülen mit Leitungswasser
• Gegenfärbung Safraninlösung
• Abspülen mit Leitungswasser
• Trocknen zwischen Filterpapier
3 Minuten
2 Minuten
einige Sekunden
1 - 2 Minuten
Mikrokopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
Beurteilung: Grampositive Bakterien = blauschwarz
Gramnegative Bakterien = rot
Methylenblaufärbung (Einfachfärbung)
Durchführung:
• Präparat hitzefixieren
• Methylenblau-Lösung, 2 Minuten
• Abspülen mit Wasser
• Trocknen zwischen Filterpapier
Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
Beurteilung:
Die Bakterien erscheinen kräftig blau, etwa vorhandene Körperzellen sind hellblau gefärbt. Die
Färbung eignet sich besonders für Präparate, in denen Bakterien und Körperzellen sowie ihre
Lagerung zueinander sichtbar werden sollen.
Hauptanwendung ist die Darstellung der Form und Lagerung von Bakterien (z.B. Gonokokken)
15
Aufgabe:
Färben von Bakterien
1. Von der Bakterienkultur 2 Präparate herstellen, lufttrocknen, hitzefixieren
2. 1 Präparate mit Methylenblau färben
1 Präparat nach Gram färben
Mikroskopie: Objektiv 100er, Blende geöffnet, ohne Deckglas, mit Immersionsöl
Protokollieren im Protokollblatt „Färbungen“: Farbe, Gramverhalten, Morphologie
Protokoll: Färbungen
Methylenblaufärbung
Gram-Färbung
Morphologie
Gramverhalten
Eigene Kultur
Kultur vom Nachbarn
16
Morphologie
Differenzierung von Bakterien
Die Differenzierung von Bakterien erfolgt durch Bestimmung biochemischer Merkmale.
Biochemische Leistungen von Enzymen des Kohlehydrat- (Zuckerspaltung) und Aminosäurestoffwechsels (z.B. Decarboxylasen, Desaminasen) können durch Farbumschläge spezieller Indikatoren in
sichtbar gemacht werden. Indikatoren sind entweder bereits in den Wachstumsmedien enthalten oder
werden nachträglich zugegeben. Einige Teste können auch direkt mit isolierten Bakterienkolonien
durchgeführt werden:
Demonstration: Wachstumsverhalten verschiedener Bakterienkulturen
Kulturen zum Betrachten und Vergleichen mit den eigenen Kulturen (2 Sets pro Tisch)
Streptokokken der Viridansgruppe
→
α-Hämolyse
Staphylococcus aureus
→
β-Hämolyse (schwach), gelbes od. weißes Pigment
Streptococcus agalactiae
→
β-Hämolyse (stark)
Enterokokken
→
У-Hämolyse
Klebsiella pneumoniae
→
Laktose-positiv, schleimig
Providencia rettgeri
→
Laktose-negativ, nicht schleimig
Pseudomonas aeruginosa
→
grünes Pigment, Geruch
Proteus mirabilis
→
Schwärmrasenbildung
Biochemische Reaktionen zur Identifizierung von Bakterien
•
Atmungskette
Cytochromoxidase Reaktion:
Die Cytochromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette. Einige Bakterien wie z.B. Neisseria gonorrhoeae,
Neisseria meningitidis und Pseudomonas aeruginosa sind Oxidase positiv.
Durchführung:
Ein Teil einer Kolonie wird mit einer Öse auf einem farblosen Oxidase-Testfeld verrieben.
Positiv: Testfeld verfärbt sich innerhalb von Sekunden tiefblau.
Eine „späte“ Verfärbung nach blau (nach 1 Minute) ist kein positiver Testausfall!
Katalase Reaktion:
Katalase bildende Bakterien spalten Wasserstoffperoxyd, wobei der freiwerdende Sauerstoff zu einer
Bläschenbildung führt.
Katalase-positiv: Staphylokokken, Listerien, Neisserien, Bacillus spp.
Katalase-negativ: Streptokokken, Clostridien.
Durchführung:
Übertragen einiger Kolonien auf einen Objektträger.
Auftropfen des Katalase-Reagenz (3%-ige H2O2).
Positiv: sofortige Blasenbildung.
•
Amionosäurestoffwechsel
Indol-Test:
Einige Bakterien können aus Tryptophan Indol bilden. Indol lässt sich durch p-Dimethylaminobenzaldehyd nachweisen
Durchführung:
Auf Filterpapier werden 1-2 Tropfen Indol-Reagenz aufgetropft. Mir der Öse reibt man die zu testende
Kolonie ein. Wichtig: Kolonie von einer Blutagarplatte abnehmen!
Positiv: Grünfärbung
17
•
Pathogenitätsfaktoren
Koagulase-Reaktion:
Durch das Enzym Koagulase wird das Fibrinogen im Zitratplasma von Menschen und Kaninchen in Fibrin
überführt. Die Koagulase ist ein Pathogenitätsfaktor von Staphylococcus aureus. Suspendiert man
Staphylococcus aureus in einen auf einem Objektträger befindlichen Zitratplasmatropfen, so kommt es
zur Ausfällung von Fibrin, in dessen Netzwerk die Staphylokokken eingebettet sind. Makroskopisch
erkennt man die Bildung kleiner Klümpchen in klarer Flüssigkeit (positives Ergebnis), die eine
Agglutination erkennen lassen. Im Gegensatz zu anderen Staphylokokken besitzen fast alle
Staphylococcus aureus-Stämme diesen "Clumping factor" an ihrer Zelloberfläche.
Durchführung:
Einen Tropfen Zitratplasma auf einen Objektträger geben.
Eine zu prüfende Bakterienkolonie wird im Plasma verrieben.
Positiv: Plasma koaguliert (es entstehen Flocken)
Negativ: homogene Trübung
•
Kohlehydratstoffwechsel
Säurebildung aus Glucose:
Säurebildung nach Kohlehydratabbau wird durch einen Indikator (z.B. Phenolrot, Bromthymolblau)
angezeigt. Das Medium enthält ferner ein Durham-Röhrchen, das dazu dient Gasbildung anzuzeigen.
Durchführung:
Ein kohlehydrathaltiges Flüssigmedium (z.B. Mannitol)
wird beimpft und für 16-24h bebrütet.
Positiv: Umschlagen des Indikators von rot nach gelb,
hochsteigen des Durham-Röhrchens: belegt eine Gasbildung.
K o h le h yd ra tm e d iu m
D u rh a m -R ö h rc h e n
•
Empfindlichkeitstestung
Vorgefertigte Testblättchen, die mit Antibiotika bzw. Chemikalien beladen sind, werden auf einen
beimpften Agar aufgelegt und bebrütet. Die Substanzen diffundieren aus dem Testblättchen in den Agar,
es bildet sich dabei ein Konzentrationsgradient. Hemmt eine Substanz das Bakterienwachstum, entsteht
eine Zone ohne Keimwachstum um das Testblättchen (Hemmhof). Der Durchmesser des Hemmhofes
korreliert mit der Empfindlichkeit des Bakterienstammes gegenüber der Substanz.
Optochin-Test:
Der Optochin-Test dient zur Unterscheidung von Streptokokken der Viridansgruppe gegenüber
Streptococcus pneumoniae.
Durchführung:
- Beimpfung einer Blutplatte
- Optochin-Plättchen mit Hilfe einer abgeflammten Pinzette auflegen
- 16-24h bei 37°C bebrüten
Auswertung:
Hemmhof: Streptococcus pneumoniae, kein Hemmhof: Streptokokken der Viridansgruppe
Novobiocin-Test:
Der Novobiocin-Test dient zur Unterscheidung von S. epidermidis gegenüber S. saprophyticus.
Durchführung:
- Beimpfung einer Blutplatte
- Novobiocin-Plättchen mit Hilfe einer abgeflammten Pinzette auflegen
- 16-24h bei 37°C bebrüten
Auswertung:
Die Sensibilität beginnt ab einem Hemmhof von 25 – 30 mm Durchmesser
Sensitiv: S. epidermidis, resistent: S. saprophyticus
18
Identifizierung von Bakterien
Am Beginn jeder Identifizierung eines Bakterienisolats steht die Beurteilung der Form und des
Färbeverhaltens nach Gram. Danach werden die biochemischen Untersuchungen angeschlossen.
Die folgenden Schemata dienen als Anhalt für eine Differenzierung der hier im Kurs behandelten Keime.
Sie stellen keineswegs ein vollständiges Differenzierungsschema für die mikrobiologische Diagnostik dar!
Kokken
grampositiv
gramnegativ
Katalasenegativ
Oxidasepositiv
Katalasepositiv
Neisserien
Streptokokken
Staphylokokken
ß-Hämolyse
α-Hämolyse
hämolytische
Streptokokken
keine Hämolyse
Koagulase
Enterokokken
positiv
S. aureus
Optochin
empfindlich
Pneumokokken
negativ
resistent
Viridans-Gruppe
Novobiocin
resistent
S. saprophyticus
empfindlich
S. epidermidis-Gruppe
Stäbchen
gramnegativ
grampositiv
Bacillus spp.
Corynebacterium spp.
Clostridien (= Anaerobier)
Oxidase
positiv
negativ
Non -Fermenter
Pseudomonas spp.
Enterobacteriaceae
„Bunte Reihe“:
SIM-Agar
Glucose
Lysin
Kligler-Agar
19
}
Wird im Praktikum nicht
durchgeführt
Bestimmungsschlüssel für grampositive und gramnegative Bakterien
Wahrscheinnlichste taxonomische Gruppe
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus sp.
Enterococcus faecalis
Bacillus sp.
Corynebacterium sp.
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Serratia marcescens
Klebsiella pneumoniae
Morganella morganii
Neisseria
Gramverhalten
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
Morphologie
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
1
Wachstum auf
Blutagar
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Hämolyse
(auf Blutagar)
-
+
-
+
-
-
-
v
v
v
v
v
-
gelb
gelb,
weiß
weiß
-
-
-
-
v
-
rot
-
-
-
Katalase
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
Koagulase
-
+
-
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
-
Oxidase
-
-
-
-
-
+
-
+
-
-
-
-
+
Indol
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
+
x
Biochemische
Leistungen:
Pigmentierung
(auf Blutagar)
Wachstum auf
MacConkeyAgar
Laktosespaltung
(auf
MacConkey)
Micrococcus luteus
Staphylococcus aureus
Familie der
Enterobacteriacae
Zeichenerklärung:
+ = positiv
- = negativ
1 = Kokken
2 = Stäbchen
v = variabel
x = Test nicht zur Identifizierung geeignet
20
Aufgabe:
Identifizierung des Testkeims
- Durchführen der biochemischen Reaktionen
- Protokollieren der Ergebnisse im Protokoll „Einfache Differenzierungen“
- Identifizierung des Keims u. a. mit Hilfe des Fließschemas und des Bestimmungsschlüssels
Nur bei richtigem Ergebnis gilt der Kurstag als erfolgreich absolviert.
Protokoll: Einfache Differenzierungen
Färbungen /
Biochemische Untersuchungen:
Ergebnis:
Methylenblaufärbung
(s. Protokoll: Färbungen)
Gram-Färbung
(s. Protokoll: Färbungen)
Wachstum auf Blutagar
(Hämolyse, Pigmentbildung)
Wachstum auf MacConkey-Agar
(Laktosespaltung)
Oxidase-Test
Katalase-Test
Koagulase-Test
(nur bei Verdacht auf S. aureus durchführen)
Indol-Test
Verdachtsdiagnose:
21
Kursteil 4
Hygiene:
• Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterientypen
• Nachweis von Keimen im Trinkwasser
• Mikrobielle Besiedlung der Hände
Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterientypen
Theoretischer Hintergrund:
Im Unterschied zur Desinfektion dient die Sterilisation der Abtötung aller auf einem Gegenstand oder in
einer Zubereitung befindlicher Mikroorganismen. Hierzu zählen auch Sporen von Bakterien, die eine
besondere Resistenz gegenüber thermischen oder chemischen Einflüssen aufweisen. Dies begründet die
meist aggressiveren Verfahren der Sterilisation im Unterschied zur Desinfektion, die eine Teilentkeimung
zur Sicherstellung der Unterbrechung von Infektketten als Aufgabe hat. Die Grenzen der heute
angewendeten Sterilisationsverfahren (meist Dampfsterilisation für thermostabile Medizinprodukte,
Niedrig-Temperatur-Plasmasterilisation für beispielsweise thermolabile Instrumente) werden beim
Versuch der Zerstörung von Prionen erreicht. Hier sind in Zukunft neue oder geänderte Verfahren zu
erwarten. Im heutigen Versuch sollen die Resistenzen einzelner Bakteriengruppen gegenüber
ausgewählten Entkeimungsmaßnahmen geprüft werden.
Aufgabe:
Testen der Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien
Um die Auswirkung von Hitze auf das Wachstum von Bakterien zu beurteilen, werden 2 verschiedene
Bakteriensuspensionen und 3 unterschiedlich vorbehandelte Sporenstreifen bearbeitet.
Untersuchungsmaterial:
1. A = S. aureus-Suspension
30 Min. bei 60°C vorb ehandelt
2. B = E. coli-Suspension
30 Min. bei 60°C vorbeh andelt
3. C = Sporenstreifen
unbehandelt
4. D = Sporenstreifen
bei 120°C, 1,2 atü Wasserd ampf sterilisiert
5. E = Sporenstreifen
bei 160°C 2, Stunden im He ißluftsterilisator sterilisiert
Reagenzien und Werkzeug:
6 Röhrchen mit steriler Glucosebouillon
Sterile Pipetten (in den Metalldosen)
Holzklammern
Durchführung:
Die Suspensionen A + B gut aufschütteln! (Achtung: Deckel sind nicht dicht)
1. Suspension A
→ 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A1
2. Suspension A, aufkochen → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A2
3. Suspension B
→ 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit B
4. Sporenstreifen C
→ ca. 2ml Leitungswasser zugeben, aufkochen, anschl.
den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben
5. Sporenstreifen D
→ den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben
6. Sporenstreifen E
→ den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben
Die 6 Bouillonkulturen werden 16-24 h bei 37°C und weitere 2 Tage bei Raumtemperatur bebrütet.
Nächste Kursstunde: Protokollieren der Ergebnisse in nachfolgender Tabelle.
22
Protokoll: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterientypen
Untersuchungsmaterial
Behandlung
A1 = StaphylokokkenBouillon-Kultur
30 Min. bei 60°C
B = E. coliBouillon-Kultur
30 Min. bei 60°C
A2 = StaphylokokkenBouillon-Kultur
aufgekocht (100°C)
C = Sporenläppchen
aufgekocht (100°C)
D = Sporenläppchen
autoklaviert bei
120°C, 1,2 atü Wasserdampf
E = Sporenläppchen
2 Std. 160°C, trocken
(Heißluftsterilisator)
Wachstum (Trübung = Wachstum)
Schlussfolgerung:
(Temperaturempfindlichkeit von grampos. und gramneg. Keimen, bzw. Sporenbildnern)
23
Nachweis von Keimen im Trinkwasser
Theoretischer Hintergrund:
Trinkwasser ist das wichtigste Lebensmittel, da es durch nichts anderes ersetzt werden kann. Daher sind
der Schutz des Wassers und der sparsame Umgang mit Trinkwasser eine der wichtigsten Aufgaben des
Menschen.
Eine wichtige Grundlage zur Sicherung der Ressource Wasser ist die hygienische Überwachung des
Trinkwassers, gesichert im Infektionsschutzgesetz und darauf basierend, der Trinkwasserverordnung
(TrinkwV oder auch TVO) in ihrer letztmalig 2001 geänderten Fassung (Novellierung), die am 1. Januar
2003 in Kraft trat. Mit der Trinkwasserverordnung wurde die Richtlinie des Rates der Europäischen
Gemeinschaft in deutsches Recht umgesetzt. Ziel dieser Verordnungen ist die Sicherstellung von
sauberem und hygienisch kontrolliertem Trinkwasser, das eine Gefährdung der menschlichen Gesundheit
ausschließt. Dieses wird vor allem durch die Einführung von Grenzwerten für gesundheitsschädliche
biologische und chemische Parameter erreicht.
Von zentraler Bedeutung ist dabei die mikrobiologische Überwachung des Wassers (Anlage 1 der
TrinkwV) sind die sicherstellen soll, dass keine potenziell gesundheitsschädlichen Darmkeime wie z.B.
Escherichia coli und andere Enterobakterien im Wasser nachweisbar sind. Die Liste der in der Anlage 2
der TrinkwV aufgenommenen toxikologisch relevanten chemischen Schadstoffe enthält erstmalig
auch solche Substanzen, deren Konzentration oder Giftigkeit durch das Leitungsnetz oder die
Wasseraufbereitung verändert wird.
Die Anlage 3 der Verordnung enthält Grenzwerte für weniger gefährliche Inhaltsstoffe oder Stoffe, deren
Giftigkeit nicht genau bekannt ist, die aber als wichtige als Indikatorparameter den Zustand des
Trinkwassers beschreiben und vor allem der Vorsorge dienen. In der Anlage 3 sind auch mikrobielle
Indikatoren gelistet.
Außerdem sind in der Verordnung die Abstände, in denen das Wasser untersucht werden muss und auch
die, für die Überwachung zuständige Behörde (Gesundheitsamt) sowie weitere Anforderungen festgelegt
Die Liste der zu untersuchenden chemischen Inhaltsstoffe ist sehr lang, daneben nehmen sich die
mikrobiologischen Anforderungen, zumindest was den Umfang der Parameter betrifft, eher bescheiden
aus: Neben der Koloniezahl (KBE bei 22°C und 37°C) sind es vor allem der Darmkeim Escherichia coli,
die coliformen Keime und Enterokokken, die als Indikatoren für mögliche fäkale Verunreinigungen des
Wassers dienen und somit ein Hinweis auf Krankheitserreger im Wasser sein können. Zusätzlich kann
das Gesundheitsamt Untersuchungen auf weitere Keime anordnen, wenn ein Kontaminationsverdacht es
erfordert.
Krankheitserreger im Trinkwasser
Grundwasser aus ausreichender Tiefe enthält normalerweise nur wenige, unproblematische Keime.
Mikrobielle Verunreinigungen entstehen durch:
•
Unzureichende Filterwirkung des Bodens, v. a. bei Flachbrunnen
•
Undichtigkeiten des Brunnens (Regenwasser, Hochwasser)
•
Sekundärverkeimungen durch die Versorgungssysteme
•
Unzureichende Aufbereitung (Desinfektion)
24
Infektionen durch Trinkwasser:
Bakterien:
- Salmonellen (S. typhi, S. paratyphi, S. dysenteriae, S. montevideo: Typhus, Paratyphus, Enteritis)
- Kolibakterien: (E. coli: meist Enteritis)
- Shigellen (Sh. dysenteriae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, Ruhr)
- Vibrionen (V. cholerae, V. fluvialis, V. mimicus, V. parahaemolyticus, V. vulnificus u.a.:
Cholera, Enteritis, and Wundinfektionen),
- Campylobacter (C. jejuni, C. coli: Enteritis)
- Chromobacterium violaceum (Enteritis)
- Aeromonaden (A. hydrophilia, A. sobria, A. caviae: Enteritis, Wundinfektionen)
- Mykobakterien (M. tuberculosis, M. marinum, M. chelone u.a.: TBC, Granulome)
- Yersinia entorocolitica (Enteritis)
- Chlamydien (C. trachomatis: Trachom, evtl. Erblindung)
- Fusobakterium necroforum (Leberabzess)
- Staphylokokken (S. aureus: Wundinfektionen, Lebensmittelvergiftung)
- Clostridium perfringens (Lebensmittelvergifter)
- Pseudomonaden (P. aeruginosa: über Kontakt: Wundinfektionen, Ohrinfektionen, Pneumonie)
- Legionellen (L. pneumophila u.a.: indirekt über Aerosole: Pneumonie, Pontiac-Fieber),
Viren:
- Poliovirus (Polio: Kinderlähmung)
- Coxsackievirus A und B (grippaler Infekt, Meningitis)
- Echovirus (Enteritis, "Sommergrippe", Meningitis)
- Astrovirus (Enteritis, harmlose Durchfälle)
- Adenovirus (Enteritis, "Sommergrippe", Pharyngitis)
- Hepatitisvirus A und E (Hepatitis)
- Rotavirus (Gastroenteritis v .a. bei Kleinkindern),
- Reovirus (Enteritis)
- Norwalkvirus (Enteritis),
- Calicivirus (Enteritis bei Kleinkindern)
- SRV: "small round virus": (Durchfälle)
- Coronavirus (grippale Infekte)
- Parvoviren ("atypische Röteln", nicht gesichert)
Protozoen:
- Cryptosporidium parvum (Enteritis)
- Entamoeba histolytica (Amöbenruhr)
- Giardia lamblia (Lambliasis: Enteritis)
Wurmkrankheiten:
- V. a. in den Tropen und häufig indirekte Infektionen über das Wasser
(z.B. Eindringen der Würmer oder Larven über die Haut: Schistosoma, Necator, Ancylostoma,
Dracunculus, Strongyloides u.a.)
- Ascaris lumbricoides (Spulwurm: Aufnahme der Eier aus Abwasserkontaminationen)
- Enterobius vermicularis (Madenwurm v. a. bei Kindern. Infektion durch Wasser ist eine Ausnahme)
Pilze:
- Candida (Soor, Candidamykose: Infektion durch Wasser unwahrscheinlich)
Algentoxine:
evtl. bei Oberflächenwasser wie Badeseen
25
Der Infektionsweg ist normalerweise fäkal-oral, aber auch aerogene Infektionen (z.B. Legionellen über
Aerosole) sowie Infektionen der Haut (Wunden, äußerer Gehörgang: Pseudomonas aeruginosa) oder der
Augen (Konjunktiva: Chlamydia trachomatis) sind möglich.
Einige Erreger verursachen Explosivepidemien (z.B. Cholera).
Die kritische Infektionsdosis ist äußerst unterschiedlich:
Vibrio cholerae
108 KBE
E. coli, Salmonella enteritidis
106 KBE
Salmonella typhi, Shigella dysenteriae
103 KBE
Legionella pneumophila, Yersinia enterocolitica
10 KBE
Enteroviren
1 - 10 PFU (plaque forming unit)
Giardia
1 Oozyste
Probleme der mikrobiologischen Überwachung des Trink- und Badewassers mittels bakterieller
Indikatoren:
Einige Mikroorganismen erreichen im Wasser und im Boden lange Überlebenszeiten (Tenazität),
die weit über 50 Tage („50-Tages-Linie“: Grundlage von Schutzmaßnahmen gegen mikrobielle
Beeinträchtigung der Wassers) hinausreichen können.
Der Indikator für mögliche fäkale Infektionserreger im Trinkwasser Escherichia coli und
Coliforme Keime nach der Trinkwasserverordnung (TVO) ist nicht für alle Erreger anwendbar.
Auch im gechlorten Wasser ist der Indikatorwert von E. coli nur eingeschränkt anwendbar,
da E. coli im Vergleich zu einigen Krankheitserregern sehr chlorempfindlich ist.
Für Mikroorganismen, die nicht fäkal-oral übertragen werden (Pseudomonas aeruginosa,
Legionella pneumophila u.a.) sind die enterobakteriellen Indikatoren ebenfalls nicht sinnvoll.
Die bakteriellen Indikatoren gelten auch für Viren und Protozoen, die teilweise auch gegen
Desinfektionsmaßnahmen völlig anders reagieren.
Im Trinkwasser werden regelmäßig Bakterien mit unterschiedlicher Signifikanz nachgewiesen:
Potentielle Pathogene, d.h. Keime, die vor allem opportunistische Infektionen
z.B. im Krankenhaus oder bei Immungeschwächten verursachen können.
Weiterhin Bakterien, die Korrosionen, Färbungen oder Gerüche verursachen aber meist
unproblematisch sind (Umweltkeime).
Wasservermittelte Epidemien wurden meist verursacht durch:
Kurzschlüsse in der Wasserversorgung mit dem Abwassersystem (Hamburg u.a.), heute
besonders bei Kleinversorgungen (Ismaning) oder Campingplätzen (Worchester) und noch
häufig in sog. Entwicklungsländern.
Verschneiden mit kontaminiertem Wasser aus „krimineller Geldgier“ (Gelsenkirchen)
Einschwemmen von Fäkaldünger in das Trinkwasserreservoir (Pforzheim, Milwaukee).
Stagnationen und Verkeimungen in Installationen und dem Netz (Biofilm).
26
Exemplarische Trinkwasserepidemien (Explosivepidemien) in Europa und USA
nach dem Institut für Wasser-Boden-Luft-Hygiene (WaBoLu) 1997:
Cholera
Hamburg 1892. 16.000 Erkrankte, fast 9.000 Tote: Eines der letzten großen Ausbrüche in Mitteleuropa.
Vorher wurden fast alle großen europäischen Städte regelmäßig von der Cholera heimgesucht, wie z.B.
Mitte des 19. Jahrhunderts: Paris, München, Berlin, London, New York u.a.
Typhus, Salmonellose (Auswahl)
Gelsenkirchen 1901: 3.200 Erkr./ 350 Tote,
Detmold 1904: 780 Erkr./ 54 Tote
Pforzheim 1919: 4.000 Erkr./ 400Tote)
Neu-Ötting 1946: 600 Erkr./ 96 Tote
Waldbröl 1949: 127 Erkr./ 11 Tote
Thereker Mühle 1953: 51 Erkr. (Paratyphus)
Hagen 1956: 500 Erkr.
Zermatt 1963: 437 Erkr. 3 Tote
Riverside 1965 (USA, Salmonellose): 16.000 Erkr. 3 Tote
Baden Württemberg 1974: 423 Erkr.
Missouri (USA) 1993: 625 Erkr.
Ruhr, EHEC
Worbis (Thüringen) 1972: 1.400 Erkr.
Ismaning/München 1980: 2.450 Erkr.
Cabool (USA) 1889: 243 Erkr. 4 Tote
New York (Staat, USA) 1994: 230 Erkr. (EHEC?).
Hepatitis A
Philadelphia 1944: 344 Erkrankten in einem Jugendlager.
Worchester 1969-71: über 1.200 Erkr.
Dingelstedt (Thüringen) 1972: 40 Erkr.
Rotavirus
Schweden 1977: 3.172 Erkr.
Georgetown (USA) 1980: 8.000 Erkr.
Eagle-Vail-Avon (USA) 1981: 1.500 Erkr.
Halle/Saale 1981: 11.600 Erkr.
Cryptosporidien
Carrolton (USA) 1987: 13.000 Erkr.
Milwaukee (USA) 1993: 403.000 Erkr.
Las Vegas (USA) 1993/94: 103 Erkr. 20 Tote
27
Legionellen: Infektionen durch „technische Vektoren“ (seit 1998)
1998
1999
2000
2001
2001
2001
2001
2002
2002
2002
2003
2003
2003
2003
Schweiz, verschiedene Orte und Ursachen
Amsterdam: (Blumenschau, Springbrunnen)
Melbourne (Kühltürme)
Valencia: (Kühltürme vermutet)
Ohio (Ford Motor Comp., Ursache unbekannt)
Paris (Hospital)
Pamplona, Sp (Hospital)
Japan (heiße Quellen)
Cumbria, UK (Klimaanlage)
Matara, Sp (Klimaanlage)
Valencia (Heißwassersystem)
Deutschland, Frankfurt/ Oder (Altenheime, Wasser)
Frankreich (Chemiefabrik bei Lens, Kühlsystem)
Kreuzfahrtschiff „Ocean Monarch“ (Warmwassersystem)
Fälle
78
192
101
98
4
12
18
252
131
124
25
?
68
4
Tote
8
21
21
4
2
2
3
6
4
2
1
6
8
1
Grenzwerte nach der Trinkwasserverordnung
Parameter (Anl.1)
Grenzwert
E. coli
0/100ml
Enterokokken
0/100ml
Coliforme
0/100ml
Indikatorparameter (Anl. 3)
Clostridium perfringens:
Koloniezahl bei 22°C
Koloniezahl bei 36°C
Pseudomonas aeruginosa:
0/100ml
100/ml am Zapfhahn
20/ml nach Abschluss der Aufbereitung
1000/ml bei Anlagen bis 1000m3/Jahr
100/ml Bei Koloniezahl „Gr enzwert“:
Keine wesentlichen Änderungen
0/100ml
Nachweis von Mikroorganismen nach der Trinkwasserverordnung:
Koloniezahl:
Als Koloniezahl (KBE: Koloniebildende Einheiten) wird die Zahl sichtbaren Kolonien definiert, die aus 1ml
Wasser auf nährstoffreichen Agarnährböden bei einer Bebrütungstemperatur von 20°C + 2°C und 36°C +
1°C nach 44 + 4 Stunden gewachsen sind.
Nach der neuen TrinkwV von 2001 wird die Koloniezahl nach Membranfiltration bestimmt. Über den
Indikatorparameter KBE wird nur ein geringer Teil der tatsächlichen bakteriellen Belastung des Wassers
erfasst.
Der Nachweis von Escherichia coli und coliformen Keimen gilt als Indikator einer fäkalen
Verunreinigung des Wassers.
Die Definition von Escherichia coli nach der Trinkwasserverordnung (TrinkwV) von 1990:
„Laktosefermentation zu Säure und Gas, negative Oxidase-Reaktion, positive Indol-Bildung, negative
Citratreaktion und Glukose- und Mannitfermentation zu Säure und Gas bei 44° C“ wurde in der neuen
TrinkwV von 2001 durch die Referenznorm ISO 9308-1: „Säurebildung durch Laktosefermentation (Besitz
des Enzyms β - Galaktosidase), negative Oxidase-Reaktion und positive Indol-Bildung“ ersetzt.
Nur wenige Promille der Mikroflora im menschlichen Stuhl sind E.coli, pro Tag werden dennoch von
einer Person jedoch bis 1 Trillionen E. coli ausgeschieden.
Neuere Untersuchungen lassen aber an der Verlässlichkeit dieses Indikators zweifeln. Vor allem einige
im Trinkwasser vorkommende Viren (Hepatitis, Polio, Coxsackie, Gastroenteritisviren) und auch
Protozoen (Cryptosporidium) überleben länger als E. coli im Wasser oder verhalten sich gegenüber
Aufbereitungswirkungen anders. So konnten Viren Desinfektionschritte der Wasseraufbereitung
passieren, ohne inaktiviert zu werden, obwohl die bakteriologischen Anforderungen erfüllt
wurden.
28
Coliforme Bakterien sind häufig „Umweltkeime“ und nur teilweise fäkalen Ursprungs. Neben der Gattung
Escherichia sind dies z.B. Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Klebsiella u.a.
Coliforme Bakterien wurden nach der alten TrinkwV von 1990 als eine physiologische Gruppe innerhalb
der Enterobakterien bezeichnet, die durch „Laktosefermentation mit Säure und Gasbildung innerhalb von
48 Stunden bei 36°C“ definiert ist. Die Referenznor m der neuen TrinkwV von 2001 definiert sie durch die
Merkmale: „Säurebildung durch Laktosefermentation und Besitz des Enzyms β - Galaktosidase sowie
negative Oxidase-Reaktion“.
Die Gasbildung als diagnostisches Merkmal wurde in der neuen TrinkwV von 2001 sowohl bei E. coli wie
auch bei den coliformen Keimen weg gelassen.
Nach der EG- Badegewässerverordnung werden Fäkalcoliforme (thermotolerante Coliforme keime wie
E. coli) von den Gesamtcoliformen unterschieden. Diese werden zum Teil auch als Umweltcoliforme
oder als nicht fäkale Coliforme (engl. Non-faecal coliforms) bezeichnet, obwohl sie auch über den Darm
von Mensch und Tier ausgeschieden werden können.
Als weiterer Indikator für Darmkeime wurden in die TrinkwV die so genannten Enterokokken eingeführt:
„Grampositive, katalase-negative Kokken, die resistent gegen Natriumchlorid und Rindergalle sind und in
einem Temperaturbereich von 10°C bis 45°C bis zu ei nem pH-Wert von 9,6 wachsen“ und außerdem
Aesculin hydrolysieren.
In der alten TrinkwV von 1990 wurden sie als Fäkal-Streptokokken (D-Streptokokken) bezeichnet. Der
Parameter „Enterokokken“ zielt im Wesentlichen auf humane Fäkalindikatoren wie Enterococcus faecalis,
E. durans, E. faecium), aber auch Umweltkeime, die z.B. auf pflanzlichen Rückständen leben, werden
erfasst.
Enterokokken sind wesentlich resistenter als coliforme Keime gegen chemische Desinfektionsmittel wie
Chlor.
Die TrinkwV lässt die Anwendung anderer Nachweisverfahren zu, sofern sie im Vergleich zur
Referenzmethode mindestens gleichwertige Ergebnisse liefert.
Der Nachweis von Clostridium perfringens (früher nach der alten
TrinkwV von 1990:
Sulfitreduzierende, sporenbildende Anaerobier) erfolgt über Membranfiltration (aus 100ml). Es ist ein
Indikatorparameter, der die möglich Beeinträchtigung des Trinkwassers durch Oberflächenwasser
anzeigen soll. Wegen der hohen Stabilität dieser Keime gegen Desinfektionsmaßnahmen
(Sporenbildner!) gilt Clostridium perfringens auch als Indikator für Chlor-resistente Organismen wie
beispielsweise Oozysten von Cryptosporidium parvum.
Die TrinkwV schreibt für spezielle Wasserversorgungssysteme und Anwendungen weitere bakterielle
Untersuchungen vor wie zum Beispiel Legionellen (L. pneumophila) in Warmwassersystemen und
aerosolbildenden Einheiten) und Pseudomonas aeruginosa im Badewasser und in Behälter abgefülltem
Wasser.
Im Verdachtsfall kann das Gesundheitsamt zusätzliche Untersuchungen fordern, so zum Beispiel:
Darmpathogene Keime wie Salmonellen, Shigellen, Campylobacter, Yersinien, Parasiten wie
Cryptosporidien oder Lamblien oder Viren.
Nachweis und Differenzierung von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden
(nach TrinkwV u.a.)
„Einfache“ Differenzierungsmöglichkeiten:
1. Blutagar:
Optimal Nährboden, Hämolyse Nachweis
2. MacConkey-Agar:
Selektivnährboden für gramnegative Bakterien.
Laktoseverwertung-positiv: Bakterien bilden rötlich bis rötlich-violette Kolonien.
Laktoseverwertung-negativ: Bakterien bilden helle Kolonien.
3. Cytochromoxidase-Reaktion:
Cytochromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette.
Oxidase-Reagenz wird im Bereich verdächtiger Kolonien aufgetropft.
Positive Reaktion: blauviolette Färbung der Kolonien nach 10-15 Sekunden
4. Laktose-Pepton-Bouillon (Vergärung von Laktose):
a) enthält einen Indikator zum Nachweis von Säurebildung.
Positiv: Farbumschlag von purpur nach gelb nach 24-44 h bei 36°C und 44°C
b) enthält ein Durham-Röhrchen zum Nachweis von Gasbildung:
Positiv: Deutlich sichtbare Gasblase im Durham-Röhrchen nach 24-44 h bei 36°C und 44°C
5. Weitere Differenzierungen:
„Bunte Reihe“, standardisierte Mikromethoden
29
Einige Merkmale von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden
Nachweis:
E. coli
+/-
Hämolyse:
Coliforme
Keime
+/-
Pseudomonaden
+/-
Laktoseverwertung:
+
+
-
Gas- und Säurebildung bei 36°C:
+
+
-
-
-
+
Cytochromoxidase-Reaktion
Aufgabe: (3er Gruppe pro Tisch)
Nachweis und Differenzierung von Keimen im Wasser nach TrinkwV u.a.
Es werden folgende Wasserproben aus Wassersystemen untersucht:
- Trinkwasser aus Wasserhahn
- Wasser aus dem Duschschlauch einer Patientendusche
- Wasser aus einer lange nicht benutzten Augendusche
1.Von jeder Wasserprobe werden jeweils 0,5ml Wasser mit einer Pipette auf 2 Agarplatten getropft
und mit einem Wattetupfer ausgestrichen:
- Blutagar = Optimalnährboden (hämolysierende Mikroorganismen)
- MacConkey-Agar = Selektivnährboden für gramnegative, insbesondere coliforme Keime in
Wasser und Lebensmittel
2.Von jeder Wasserprobe werden jeweils 0,5 ml Wasser in eine 1,5-fach konzentrierter
Laktose-Pepton – Bouillon zum Nachweis Laktose-Abbauender Bakterien überführt.
Platten und Reagenzgläser mit Platznummer und Ort der Entnahmestelle beschriften, sie
werden am Ende des Kurstages eingesammelt und über Nacht bei 36°C inkubiert.
Auswertung und Protokollierung am nächsten Kurstag.
Protokoll: Identifizierung von coliformen Keimen und von Pseudomonaden
Entnahmestellen
Augendusche
(Labor)
Nachweiskriterien:
Nachweis beta-Hämolyse:
Auf Blutagar
Nachweis Laktoseverwertung:
Koloniewachstum auf MacConkey-Agar:
rot = pos., hell = neg.
Nachweis Säurebildung:
In Laktose-Pepton-Bouillon:
Farbumschlag nach gelb: = pos.
Nachweis Gasbildung:
In Laktose-Pepton-Bouillon:
Gasblase im sog. Durhamröhrchen: = pos.
Nachweis Cytochromoxidase-Reaktion:
Mit Oxidase-Slide
Beurteilung:
30
Duschschlauch
(Patientenzimmer)
Trinkwasser
Mikrobielle Besiedlung der Hände
Theoretischer Hintergrund:
Die Übertragung von Mirkoorganismen über die Hände der Mitarbeiter auf Patienten und die daraus
resultierenden infektiösen Komplikationen sind seit vielen Jahren bekannt (Semmelweis) Auch heute
werden die meisten nosokomialen Infektionen über die Hände übertragen, obwohl die Maßnahmen zur
Unterbrechung der Infektionskette bekannt sind. Ursache ist meist die niedrige Compliance in der
Händehygiene, seltener die Wirksamkeit der verwendeten Desinfektionsmittel. Es mag aber auch an der
(Re)Kontamination der Hände von unbelebten Flächen liegen. Durch einmaligen direkten Kontakt mit
einer unbelebten Fläche werden 4-16% der Handfläche berührt, nach 12 Kontakten sind es ca. 40% der
Handfläche. Patienten auf Intensivstationen bzw. in anderen Risikobereichen unterliegen einem
besonders hohen Infektionsrisiko: durch die intensive device-assoziierte Pflege mit den damit
verbundenen Eintrittspforten für Krankheitserreger, durch die erforderlichen zahlreichen Kontakte zu den
Händen der Mitarbeiter und die Häufung antibiotika-resistenter Bakterien.
Hände von Mitarbeitern im Gesundheitswesen tragen häufig Gram-positive, aber auch bisweilen Gramnegative Bakterien als transiente Flora. In zahlreichen Ausbrüchen sind die Hände direkt oder indirekt als
Überträger von Bakterien auf die Patienten beschrieben. Die Kolonisation der Hände mit Mykobakterien
bzw. die Übertragung von Mykobakterien über die Hände stellt eine Ausnahme dar. Bei Clostridium
difficile Erkrankungen sind bis zu 60% der Hände der Mitarbeiter mit diesem Erreger kontaminiert. Die
Übertragung von C. difficile auf bis zu 20% der Patienten über die Hände ist belegt. Auch Hefepilze wie
Candida werden häufig von den Händen der Mitarbeiter im Krankenhaus isoliert. Schimmelpilze werden
hingegen eher selten bis gar nicht über die Hände übertragen. Die Übertragbarkeit verschiedener Viren
über die Hände ist in verschiedenen Studien belegt. Hier stehen vor allem die behüllten Viren (z.B.
Hepatitis) im Vordergrund. Die Übertragung unbehüllter Viren stellt nur in besonderen Bereichen ein
Risiko dar.
Diese Übertragungsproblematik ist eine wesentliche, aber durchaus vermeidbare Ursache für die immer
noch hohe Zahl an nosokomialen Infektionen weltweit. Durch einfache Verhaltensänderungen und dem
Wissen über die Übertragbarkeit ließen sich viele dieser teuren und leidvollen Infektionen verhindern.
Nosokomiale Infektionen lassen sich in endogene und exogene Infektionen unterscheiden. Exogene
Infektionen gehen von anderen Patienten, Mitarbeitern oder der unbelebten Umgebung aus. Hier spielen
die Hände der Mitarbeiter eine maßgebliche Rolle bei der Übertragung von der Quelle zum Patienten.
Endogene Infektionen gehen von der patienteneigenen Flora aus. So ist die Besiedlung eines Patienten
mit Staphylococcus aureus im Nasen-Rachen-Bereich, bzw. der Hand ein prädisponierender Faktor für
eine postoperative Wundinfektion. Aber auch die Besiedlung eines Operateurs, beispielsweise an der
Stirn, kann durchaus Ursache einer solchen postoperativen Infektion sein.
Um eine erfolgreiche Desinfektion der Hände zu gewährleisten wurden klare Vorgaben auf der Basis von
Studien entwickelt, die sowohl die Methode der „Hygienischen Händedesinfektion“ zur HospitalismusProphylaxe, als auch die „Chirurgische Händedesinfektion“ vor der OP regeln:
31
Ausschnitt aus den Hygieneplänen des Marburger Klinikums
Hygienische Händedesinfektion
Die Hände des Personals sind das wichtigste Übertragungsvehikel von Krankheitserregern. Deshalb
gehört die Händehygiene zu den wichtigsten Maßnahmen zur Verhütung von Krankenhausinfektionen.
Bei tatsächlicher wie auch fraglicher mikrobielle Kontamination der Hände muss eine hygienische
Händedesinfektion durchgeführt werden (Kategorie I A).
Bei mutmaßlicher oder wahrscheinlicher Viruskontamination muss ein gegen die entsprechenden Viren
wirksames Präparat, sofern dafür valide Prüfergebnisse vorliegen, verwendet werden (z.B. Isoliereinheit,
Kinderstation, Verdacht oder gesicherte übertragbare Virusinfektion; Kategorie I B).
Die hygienische Händedesinfektion ist so durchzuführen, dass die Kontaminationsflora noch auf den
Händen weitgehend abgetötet wird (Kategorie I A).
Zur hygienischen Händedesinfektion sind vorzugsweise Mittel auf Wirkstoffbasis von Alkoholen zu
verwenden. Die zu verwendenden Mittel müssen den Standardzulassungen gemäß § 36 des AMG
entsprechen, vorzugsweise sind DGM-Gelistete Mittel zu verwenden. Auf Mittel aus der
Desinfektionsmittelliste des RKI ist bei behördlich angeordneten Entseuchungen zurückzugreifen
(Kategorie IV)."
Durchführung:
Desinfektionsmittel in die hohlen, trockenen Hände geben. Nach dem unten aufgeführten Verfahren das
Produkt 30 Sek. in die Hände bis zu den Handgelenken kräftig einreiben. Die Bewegungen jedes
Schrittes fünfmal durchführen. Nach Beendigung des 6. Schrittes werden einzelne Schritte bis zur
angegebenen Einreibedauer wiederholt. Im Bedarfsfall erneut Hände-Desinfektionsmittel entnehmen.
Darauf achten, dass die Hände die gesamte Einreibezeit feucht bleiben.
1. Handfläche auf Handfläche
2. Rechte Handfläche über linkem Handrücken und linke Handfläche über rechten Handrücken.
3. Handfläche auf Handfläche mit verschränkten, gespreizten Fingern.
4. Außenseite der Finger auf gegenüberliegende Handflächen mit verschränkten Fingern.
5. Kreisendes Reiben des rechten Daumens in der geschlossenen linken Handfläche und umgekehrt.
6. Kreisendes Reiben hin und her mit geschlossenen Fingerkuppen der rechten Hand in der linken
Handfläche und umgekehrt.
Wann ist eine hygienische Händedesinfektion vorgeschrieben?
•
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•
vor invasiven Maßnahmen, auch wenn dabei Handschuhe getragen werden, z.B. Legen eines
Venen- oder Blasenkatheters, vor Endoskopie, Injektionen, Punktionen
vor Kontakt mit Patienten, die im besonderen Maße infektionsgefährdet sind, z.B.
Leukämie-, Verbrennungs-, polytraumatisierte, bestrahlte oder sonstige schwer
erkrankte Patienten
vor Tätigkeiten mit Kontaminationsgefahr, z.B. Bereitstellung von Infusionen, Aufziehen von
Medikamenten
vor und nach jeglichem Kontakt mit Wunden
vor und nach Kontakt mit dem Bereich der Einstichstellen von Kathetern,
Drainagen u. ä.
nach Kontakt mit potentiell oder definitiv infektiösem Material (Blut, Sekret oder
Exkremente) oder infizierte Körperregionen
nach Kontakt mit potentiell kontaminierten Gegenständen, Flüssigkeiten oder Flächen
(Urinsammelgefäße, Absaug-, Beatmungsgeräte u. -masken, Trachealtuben,
Drainagen, Schmutzwäsche, Abfälle u. ä.)
nach Kontakt mit Patienten, von denen Infektionen ausgehen können oder die mit Erregern von
besonderer krankenhaushygienischer Bedeutung besiedelt sind (z.B. MRSA)
nach Ablegen von Schutzhandschuhen
nach Toilettenbenutzung
nach Naseputzen
32
Händedesinfektion bei sichtbarer Kontamination
Wird zusätzlich zur hygienischen Händedesinfektion eine Reinigung gewünscht, soll diese bis auf
folgende Ausnahmen erst nach der Desinfektion durchgeführt werden.
Durchführung:
Stark beschmutzte Hände werden zunächst vorsichtig abgespült und warm gewaschen, wobei darauf zu
achten ist, dass Umgebung und Kleidung nicht bespritzt werden (z.B. bei Blutverunreinigung).
Gegebenenfalls ist der Kontaminationsbereich danach zu desinfizieren und der Kittel zu wechseln. Im
Anschluss sind die Hände zu desinfizieren. Bei punktueller Verunreinigung kann diese mit einem mit
Händedesinfektionsmittel getränktem Papierhandtuch, Zellstoff o. ä. entfernt und danach die Hand
desinfiziert werden.
Chirurgische Händewaschung
Bedingungen sind:
Fingernägel müssen kurz und rund geschnitten sein.
- Es dürfen keine Nagelbettverletzungen oder entzündliche Prozesse vorhanden sein.
- Ausschließlich Nägel und Nagelfalze sollen bei Bedarf mit weicher (!),
(thermisch) desinfizierter Kunststoffbürste und hygienischem Handwaschpräparat
gereinigt werden.
- Bürsten der Hände und Unterarme ist wegen Hautirritation und höherer Keimabgabe
zu unterlassen
- Armaturen und Spender nur mit Ellenbogen bedienen!
Durchführung:
Vor der am OP-Tag erstmalig durchgeführten chirurgischen Händedesinfektion werden Hände und
Unterarme bis zum Ellenbogen mit nach oben gerichteten Fingerspitzen und tief liegendem Ellenbogen
während etwa 1 min. mit einem Handwaschpräparat gewaschen.
Länger dauernde Händewaschungen sind wegen potentieller Hautschädigung abzulehnen, zumal
dadurch keine weitere Keimzahlverminderung erreicht wird. Nach Abtrocknen mit einem keimarmen
Einmaltuch wird die Händedesinfektion durchgeführt.
Folgende Aspekte sind von Bedeutung:
Sofern bei der Händewaschung bereits die OP-Bereichskleidung angelegt ist, sollte eine
wasserundurchlässige keimarme Schürze getragen werden, um ein Durchnässen der OPBereichskleidung zu verhindern.
Es ist darauf zu achten, dass Bereiche oberhalb des Ellenbogens (Ärmel!) nicht befeuchtet werden.
Das Waschen hat die Zielsetzung, auf der Haut befindlichen Schmutz, Hautabschilferungen etc. zu
beseitigen. Durch eine Waschung wird residente und transiente Flora reduziert, so dass der Erfolg der
sich anschließenden chirurgischen Händedesinfektion gewährleistet ist.
Um ein schonendes Waschen zu erreichen, sollte die Wassertemperatur nicht zu hoch gewählt werden.
Die verwendete Waschlotion sollte hautverträglich sein (pH-Wert und Inhaltsstoffe beachten).
Es ist darauf zu achten, dass Reste von Waschlotion vollständig abgespült werden, um mögliche
Wechselwirkungen mit dem Händedesinfektionsmittel zu vermeiden. Das Abspülen muss geschehen von
den Fingern zum Ellbogen hin (von distal nach proximal).
33
Chirurgische Händedesinfektion
Die chirurgische Händedesinfektion ist vor allen operativen Eingriffen durchzuführen (Kat. I A).
Während der vom Hersteller der Präparate angegebenen Einwirkungszeit müssen Hände und Unterarme
vollständig mit Desinfektionslösung benetzt sein. Eine Händetrocknung danach ist mit
Rekontaminationsrisiko verbunden und nicht erforderlich.
Die Hände müssen vor dem Anlegen der Op.-Handschuhe lufttrocken sein, um Hautschäden
vorzubeugen und die Integrität des Op-Handschuhs nicht zu gefährden.
Bei Aufeinanderfolge kurzer Eingriffe (OP + OP-Pause <60 min) mit geringer Kontaminationswahrscheinlichkeit (intakter Handschuh!) kann vor dem nächsten Eingriff die Händewaschung
unterbleiben.
Folgende Aspekte sind von Bedeutung:
Durch Einbürsten eines alkoholischen Desinfektionsmittels in den Nagelfalz mit steriler Handbürste kann
eine Wirkungssteigerung erzielt werden; dies empfiehlt sich, wenn eine hohe Keimarmut erforderlich ist,
z.B. vor Implantation alloplastischer Materialien.
Durchführung:
Das Händedesinfektionsmittel aus dem Spender (Hebel mit dem Ellenbogen betätigen) in die trockene
hohle Hand geben.
Das alkoholische Einreibepräparat wird über einen Zeitraum von 3 Minuten (je nach Präparat) in
einzelnen Portionen eingerieben. Die Haut muss über die gesamte Einwirkzeit feucht gehalten werden.
Im 1. Schritt Hände, Unterarme bis einschließlich Ellenbogen desinfizieren. Daran anschließend den
halben Unterarm und die Hände.
Im letzten Schritt nur noch die Hände desinfizieren. Dabei Hände über Ellenbogenniveau halten. Nach
dem Desinfektionsvorgang Hände und Unterarme nicht mehr abtrocknen! NICHT mit feuchten Händen
die Handschuhe anziehen.
Hautschutz/Hautpflege
Hautpflege an Händen und Unterarmen ist eine berufliche Pflicht, weil bereits kleinste Risse bzw.
Mikrotraumen potentielle Erregerreservoire sind und eine nicht gepflegte Haut lässt sich nicht sicher
desinfizieren.
Hautpflegemittel aus einem von allen Beschäftigten gemeinsam benutzten Behälter ohne
Dosiereinrichtungen sind ungeeignet. Z.B. Tuben, Direktspender dagegen sind geeignet.
.
34
Aufgabe:
Abklatschuntersuchung der Hände
Wir überprüfen die mikrobielle Kontamination der desinfizierten und nicht desinfizierteHand.
Hierzu werden Kontaktproben sowohl von der desinfizierten als auch von der nicht
desinfizierten Hand genommen.
1.Jeweils 2 Kursteilnehmer pro Bankreihe führen eine korrekte hygienische
Händedesinfektion durch.
Im Anschluss nehmen sie eine mikrobiologische Kontaktprobe durch
Aufdrücken und leichtes Schieben des Kontakt-Nährbodens auf der desinfizierten
Handinnenfläche.
2.Jeweils 2 Kursteilnehmer pro Bankreihe machen diesen Versuch ohne vorherige
Händedesinfektion.
3.Die Kontaktproben beschriften, sie werden eingesammelt und bei 36°C über Nacht
bebrütet.
Auswertung am nächsten Kurstag!
Protokoll: Händedesinfektion
Proband
Keimzahl desinfizierte Hand
Keimzahl nicht desinfizierte Hand
Aufgabe:
Übertragbarkeit von Mikroorganismen
Um die Übertragbarkeit von Erregern und damit das daraus resultierende Infektionsrisiko
gerade bei nosokomialen Infektionen abschätzen zu können, werden die Hände mit einem
Fluoreszenzfarbstoff als Simulation einer bakteriellen, bzw. viralen Kontamination markiert.
a) Tischreihe 1-5:
- Die erste Person der Tischreihe reibt sich die Hände mit dem Fluoreszenzfarbstoff ein.
- Schütteln Sie den anderen Kursteilnehmern in der Tischreihe die Hand.
- Im Anschluss können Sie unter der bereit gestellten UV-Lampe feststellen, ob eine
Kontaktübertragung stattgefunden hat.
- Abwaschen der Farbstoffreste mit Wasser und Seife.
- Eincremen der Hände
Im Falle einer Übertragung, z.B. von MRSA, bleibt ohne anschließende Händedesinfektion
ein unerkannt bleibender Vektor für die Verbreitung von MRSA im Krankenhaus bestehen.
b) Tischreihe 6-10:
- Jede Person simuliert eine Händedesinfektion mit dem Fluoreszenzfarbstoff.
- Im Anschluss können Sie unter der bereit gestellten UV-Lampe feststellen,
ob Sie die Hände sorgfaltig desinfiziert haben.
- Abwaschen der Farbstoffreste mit Wasser und Seife.
- Eincremen der Hände
Wichtig! ! !
Bitte für die nächste Kursstunde die Urinkultur- Utensilien mitnehmen.
35
Kursteil 5
•
•
•
Auswertung Kursteil 4 (=Hygieneteil, Protokolle siehe Seite 22-35)
Urinkultur I
Rachenabstrich I
Urinkultur I
Bakteriologische Diagnostik von Harnwegsinfekten:
Blasenurin ist beim Gesunden steril, wird jedoch bei der Miktion durch Keime der Harnröhre kontaminiert.
Dabei werden jedoch nur niedrige Keimzahlen pro ml erreicht. Um die Diagnose eines Harnwegsinfektes
zu stellen, ist es daher essentiell, die Keimzahl im Urin zu bestimmen. Ein weiterer wichtiger Parameter
für die Diagnose eines Harnwegsinfektes ist die Zahl an Leukozyten im Urin. Bei einem Blaseninfekt ist
diese stets erhöht (Ausnahme: Patient unter Zytostatikatherapie!). Urin muss vor der antibakteriellen
Chemotherapie gewonnen werden. Therapieerfolgskontrollen sind frühestens 3 Tage nach Absetzen
des Therapeutikums sinnvoll.
Zur Urindiagnostik können Mittelstrahl- und Katheterurin verwendet werden. Kontaminierende Bakterien
aus der Harnröhre können in diesem Urin bei Zimmertemperatur wachsen und damit fälschlich hohe
Keimzahlen vorspiegeln. Deshalb sollte der gewonnene Urin
- unmittelbar, höchstens aber 2 Stunden nach der richtig durchgeführten Entnahme entweder in
einem bakteriologischen Labor untersucht werden oder
- vor einer solchen Untersuchung möglichst ununterbrochen bei Temperaturen zwischen 4°C und
maximal 6°C nicht länger als 24 Stunden aufbewahrt werden.
Urin, der von zu Hause mitgebracht wird, sollte in einem keimarmen (z.B. ausgekochten) und
verschließbaren Behältnis transportiert werden.
Gewinnung von Mittelstrahlurin
Durchführung: Die Urinentnahme soll möglichst morgens, mindestens 3 Stunden nach dem letzten
Wasserlassen erfolgen.
Beispiel einer Instruktion für Patientinnen zur Gewinnung von Mittelstrahlurin
Hände waschen mit Wasser und Seife, abtrocknen mit einem Einweghandtuch. Schamlippen spreizen
und bis zum Abschluss der Uringewinnung geöffnet halten. Harnröhrenöffnung und deren Umgebung
dreimal mit je einer frischen nassen Kompresse durch Wischen von vorn nach hinten säubern. Danach
diesen Bereich durch Abtupfen mit trockenen Kompressen trocknen.
Beim anschließenden Wasserlassen die erste Urinportion (ca. 30 ml) in die Toilette laufen lassen und erst
dann wenigstens 10 ml Urin in einem sterilen Becher mit ausreichend großer Öffnung auffangen.
Beispiel einer Instruktion für Patienten zur Gewinnung von Mittelstrahlurin
Hände vorher sorgfältig mit Wasser und Seife waschen, mit Einweghandtuch trocknen. Vorhaut mit einer
Hand vollständig zurückstreifen und mit der anderen die Umgebung der Harnröhrenöffnung mittels eines
unter fließendem Wasser angefeuchteten Tupfers reinigen. Schließlich die Harnröhrenöffnung mit einem
trockenen Tupfer trocknen. Die erste Urinportion (ca. 50 ml) in die Toilette entleeren, dann - ohne den
Harnstrahl zu unterbrechen - ca. 5-10 ml Urin mit dem vorher griffbereit abgestellten Urinbecher
auffangen. Anschließend mit der Urinkabevette ca. 5 ml Urin aufsaugen, Kabevette verschließen, ohne
den Gefäßrand durch Hand, Kleidung usw. zu verunreinigen. Erst nachdem das Röhrchen verschlossen
ist, äußere Verunreinigungen beseitigen.
Die Gewinnung von Urin für die bakteriologische Untersuchung mittels eines nur zu diesem Zwecke
gelegten Katheters sollte, wegen der Gefahr einer Keimverschleppung in die Blase, nur Fällen
vorbehalten bleiben, in denen die Gewinnung von sauberen Mittelstrahlurin nicht möglich ist. Die
Katheterisierung der Harnblase muss unter Einhaltung aller Regeln der Asepsis erfolgen.
In Situationen, bei denen eine Analyse von Mittelstrahl- oder Katheterurin zu missverständlichen
Ergebnissen führt, kann unter aseptischen Bedingungen ein Blasenpunktionsurin (sicher
kontaminationsfrei) entnommen werden, der ein steriles Röhrchen gefüllt und sofort in das
bakteriologische Labor gebracht werden sollte.
Blasenkatheterspitzen sind für die Diagnostik eines Harnwegsinfekts völlig ungeeignet.
Bei Verdacht auf einen durch Anaerobier verursachten Harnwegsinfekt muss der Punktionsurin in der
Spritze belassen werden und sofort in das Labor gebracht werden.
36
Messung und Bewertung der Keimzahl im Urin:
Für die Keimzahlbestimmung werden 0,01 ml des aufgeschüttelten Urins auf eine Blutagarplatte
aufgebracht und möglichst gleichmäßig ausgespatelt. Nach mindestens 16 Stunden Bebrütung bei 36°C
werden die Kolonien ausgezählt. Die Keimzahl wird in KBE (= Koloniebildende Einheiten) pro ml Urin
angegeben.
Für die Beurteilung des Untersuchungsergebnisses eines Blasenpunktionsurins gilt: jede gefundene
Keimzahl muss primär als pathologisch angesehen werden.
Für die Beurteilung des Untersuchungsergebnisses von Mittelstrahl- und Katheterurin gilt:
Weniger als 103 KBE:
- es liegt keine pathologische Bakteriurie vor
- eine im Urin vorhandene bakteriostatisch bzw. bakterizid wirkende Substanz verhindert das
Keimwachstum (siehe Ergebnis der Untersuchung auf antimikrobielle Wirkstoffe)
- der Erreger kann sich auf den angebotenen Nährmedien in der angebotenen Atmosphäre nicht
vermehren.
103 - 104 KBE:
- eine Bakteriurie mit Krankheitswert ist kaum anzunehmen, im Einzelfall aber nicht auszuschließen.
104 - 105 KBE:
- das Vorliegen einer Bakteriurie mit Krankheitswert ist nicht ausgeschlossen. Keimzahlen über 104 im
Katheterurin zeigen meistens eine Infektion an.
- eine Kontrolleinsendung vor Therapiebeginn ist zu empfehlen.
105 KBE und mehr:
- Harnwegsinfektion wahrscheinlich
- bei Mittelstrahlurin von Frauen ist auch bei guter Entnahmetechnik in ca. 20 % der Fälle mit einem
falsch-positiven Ergebnis zu rechnen. Erst eine zweite Mittelstrahlurinprobe mit mehr als 105 KBE der
gleichen Keimart zeigt mit 95 %iger Wahrscheinlichkeit eine Harnwegsinfektion an.
Als Alternative zur direkten bakteriologischen Untersuchung des Nativurins sind agarbeschichtete
Objektträger-Eintauchkulturen anzusehen. Diese werden unmittelbar nach Uringewinnung mit Urin
benetzt, der Urin wird verworfen und anschließend wird der Objektträger bebrütet. Allerdings kann mit der
Eintauchkultur nicht das Vorhandensein von Leukozyten sowie die Anwesenheit antibakterieller Stoffe
festgestellt werden. Weiterhin ist die Keimzahlbestimmung dabei nur semiquantitativ möglich. Die
Untersuchung von Nativurin stellt daher den „Gold-Standard“ der Urindiagnostik dar und sollte, wenn
immer möglich, dem Urikultverfahren vorgezogen werden.
Aufgabe:
Am Abend vor dem Kurstag:
Urin in eine Monovette füllen mit der Platznummer und „abends“ beschriften, bei Raumtemperatur
lagern.
Am Morgen des Kurstages:
Die Eintauchkultur in den Becher mit Morgenurin tauchen, herausnehmen, verschließen. Einen Teil
dieses Morgenurins in die zweite Monovette füllen.
Beide Proben mit der Platznummer und die Monovette zusätzlich mit „morgens“ beschriften.
Die Eintauchkultur + beide Monovetten zum Kurs mitbringen!
Im Kurs:
Anlegen von Kulturen:
Zusätzlich zu den eigenen Urinproben, steht eine frische Urinprobe aus der lfd. Diagnostik.
Aus den insgesamt drei Urinproben entnehmen Sie mit einer sterilen Einwegöse (kalibriert, 10µl) je
eine Probe des gut gemischten Urins und beimpfen damit je eine Blutagar- und eine MacConkey-Platte.
Alle 6 Agarplatten und die Eintauchkultur werden mit der Platznummer und entsprechend mit
„abends“, „morgens“, „Patientenurin“ beschriftet.
Die Kulturen werden bei 16-24 h bei 37°C bebrütet. Auswertung und Protokollierung im Kursteil 6
Leukozytenzählung:
Zum Zählen von Leukozyten im Urin entnehmen Sie aus der Urinprobe „morgens“ und der Urinprobe
„Patient“ ca.10 µl Urin mit der Kolbenhubpipette und füllen damit je ein Feld der Zählkammer.
Auszählung: Anzahl der Zellen in den 4 großen Eckquadraten = Zellzahl,
Zellzahl : 4 x 10.000 = Zellzahl/ml Urin (siehe auch PowerPoint-Präsentation)
Normalwert: 20.000 Zellen
Protokoll: siehe im Kursteil 6
37
Rachenabstrich I
Mikroskopische und kulturelle Untersuchung von Rachenabstrichen:
Die Normalflora des Rachenraums besteht aus einem komplexen Gemisch apathogener, fakultativ
pathogener, aerober und anaerober Keime. Kolonisation mit fakultativ pathogenen Keimen bedeutet
keinesfalls eine Erkrankung des Trägers, sie ist vielmehr von epidemiologischer Bedeutung, da diese
Keime durch z.B. Tröpfcheninfektion weiter verbreitet werden können.
Die Normalflora des Rachens beinhaltet andere, folgende Keime:
- vergrünenende Streptokokken (= sog. „Leitkeim“)
- apathogene Neisserien
- apathogene Corynebakterien
- Staphylokokken
- apathogene Hämophilus-Arten.
- Anaerobier
Fakultativ pathogene Keime, die im Rachen vorkommen können, sog. „Trägerstatus“, sind z.B.:
-Staphylococcus aureus
-hämolysierende Streptokokken der Gruppe A (=Streptococcus pyogenes)
-Neisseria meningitidis („Meningokokken“)
-Hämophilus influenzae
Ziel dieses Versuchs ist es, einen Abstrich Ihres Rachens mikroskopisch und kulturell zu untersuchen.
Zur Gewinnung des Rachenabstriches wird folgendermaßen vorgegangen:
Durchführung Rachenabstrich :
- Mund weit öffnen lassen (evtl. Gaumensegel durch Phonieren „AAAA“ heben lassen)
- Mit einem Spatel die Zunge nach unten drücken
- Die Zunge oder die Wangenschleimhaut darf mit dem Tupfer nicht berührt werden!
- Tupfer rasch an der Tonsille bzw. Rachenhinterwand abrollen und zurückziehen
Achtung: Würgereflex setzt schnell ein! Eine Abstrichgewinnung ohne leichten Würgereflex
ist nicht ausreichend!
Aufgabe:
1. Gegenseitige Entnahme des Rachenabstrichs:
Entnehmen Sie sich gegenseitig einen Rachenabstrich.
Rollen Sie den Watteträger auf einer Blutplatte aus.
Ausstreichen mit 3-Ösenausstrich, wobei der Tupfer die erste Öse darstellt.
Beschriften Sie die Blutplatte!
Die Blutplatten werden 16-24h bei 37°C bebrüt et.
Auswertung und Protokollierung siehe im Kursteil 6
2. Anfertigung des Rachenabstrichpräparates:
Rollen Sie den Watteträger auf einem Objektträger aus
Objektträger lufttrocknen, hitzefixieren, beschriften
Objektträger wird eingesammelt und am der nächsten Kurstag zum Färben wieder ausgeteilt.
38
Kursteil 6
•
•
•
Antibiotikaaustestung I
Urinkultur II
Rachenabstrich II
Antibiotikaaustestung I
Begriffserklärung:
Die Resistenz von Bakterien gegenüber Antibiotika wird ermittelt:
1. Der Agardiffusionstest wird auf festen Nährböden durchgeführt und die Hemmhöfe ermittelt.
2. Mit dem Reihenverdünnungstest wird in flüssigen Medien die minimale Hemmstoffkonzentrationen
(MHK) ermittelt. Abgelesen wird bei der MHK diejenige Konzentration, bei der kein sichtbares Wachstum
der Keime mehr festzustellen ist. Ein Erreger wird als empfindlich eingestuft, wenn die MHK geringer als
die erreichbare Antibiotika-Konzentration am Ort der Infektion ist.
Fall: Aus der BAL eines Patienten mit einer nosokomialen Pneumonie konnte der Keim (=Testkeim)
Enterobacter agglomerans kultiviert werden. Im anschl. Versuch soll anhand zwei verschiedener
Resistenztestungen ein Antibiotikum zur Therapie der nosokomialen Pneumonie ausgewählt werden.
Hausaufgabe: Setzen Sie sich mit den getesteten Antibiotika auseinander!
Aufgabe: (wird 2x pro Arbeitstisch durchgeführt)
1. Agardiffusionstest:
Herstellen einer Bakteriensuspension:
- 1-2 Kolonien des Testkeims mit der Öse in das Mineralbasisröhrchen suspendieren, mischen
- Sterilen Tupfer in die Suspension tauchen und zwei Müller-Hinton-Agarplatten lückenlos damit
ausstreichen, anschl. beschriften
- mit dem Dispenser (steht am Pult) die Antibiotikaplättchen auf die Agarplatten auftragen
Inkubieren für 18-24 Stunden bei 36°
2. Empfindlichkeitsbestimmung von Enterobacteriaceae gegenüber verschiedener Antibiotika
mit dem Teststreifen ATB G-1:
Der Teststreifen besteht aus 32 Vertiefungen, die in Zweiergruppen aufgeteilt sind.
Die erste Zweiergruppe enthält kein Antibiotikum und dient als Wachstumskontrolle.
Die 15 folgenden Gruppen enthalten Antibiotika in ein oder zwei Konzentrationen (c und C).
Zum Herstellen einer Bakteriensuspension wird 1 Kolonie des Testkeims mit der Öse in das
API Suspensionsmedium eingerieben und gemischt.
- 10μl dieser Suspension wird mit einer Pipette in das ATB Medium pipettiert
- Teststreifen aus der Verpackung nehmen, beschriften
- in jede Vertiefung des Teststreifens werden 135μl ATB Medium pipettiert
- Deckel auf den Streifen legen
Inkubieren für 18-24 Stunden bei 36°C
Protokoll: siehe Kursteil 7
39
Urinuntersuchung II
Aufgabe:
1. Bestimmung der Keimarten und der Keimzahl auf der Eintauchkultur des eigenen- und
des Patienten-Urins.
Die Eintauchkultur „Patient“ wurde von der Kursassistentin angelegt und 3x pro Tisch ausgeteilt.
2. Bestimmung der Keimzahl in den Urinkulturen „abends“, „morgens“ und „Patient“
(es werden die Keime auf dem Blutagar gezählt).
Ggf. einfache Differenzierungen (z. B. Katalase, Koagulase, Indol, Oxidase) und Färbungen.
3. Protokollieren der Ergebnisse
Protokoll: Eintauchkultur
Eigene Kultur
Patienten Kultur
Wachstum auf CLED-Agar:
(grüne Seite)
Wachstum auf MacConkey-Agar:
(rotbraune Seite)
Wieviel Koloniebildende Einheiten/ml (KBE/ml):
(wird mit Hilfe der Schablone ausgewertet)
Verdachtsdiagnose:
Protokoll: Urinkultur
Patienten-Urin
Anzahl der Leukozyten im Urin:
Wachstum auf Blutplatte:
Wachstum auf MacConkey-Agar:
Laktosespaltung auf MacConkey-Agar
(Rote Kolonie: = pos., helle Kolonie = neg.)
Wieviel Koloniebildende Einheiten/ml (KBE/ml):
(wird auf der Blutagarplatte ausgezählt)
Verdachtsdiagnose:
40
Eigener Urin
„morgens“
Eigener Urin
„abends“
Wird nicht
ausgezählt
Rachenabstrich II
Aufgabe:
1. Färbung des Rachenabstrich-Präparates nach Gram
Mikroskopieren und protokollieren der Ergebnisse (siehe Protokollblatt)
2. Beurteilung des Keimwachstums auf der Blutagarplatte (=Kulturelles Ergebnis) und Durchführung
der biochemischen Tests.
a) bei vergrünenden Streptokokken: zunächst Katalase testen und dann ggf. eine Subkultur mit
Optochin auf Blutagar herstellen. Ergebnis nächste Kursstunde.
b) bei β-hämolysierenden Kolonien: zunächst Katalase testen, dann Koagulase, wenn diese negativ
ist, herstellen einer Subkultur auf Blutagar. Ergebnis nächste Kursstunde.
c) bei allen anderen Keimen: Durchführung einfacher biochemischer Tests (z.B. Oxidase, Katalase,
Koagulase).
3. Beurteilung: u.a. mit Hilfe des Fließschemas und der Tabelle aus Kursteil 3
Protokoll: Rachenabstrich
Mikroskopisches Ergebnis:
Gram-Präparat:
 grampositive Kokken (Haufen)
 grampositive Kokken (Ketten)
 gramnegative Kokken
 gramnegative Stäbchen
 grampositive Stäbchen
 sonstiges
Kulturelles Ergebnis:
Keimwachstum auf
der Blutagarplatte:
Vergrünende
Streptokokken
β-hämolysierende
Keime
V. a. Staphylokokken
V. a. Neisserien
Biochemische Tests:
Oxidase
Katalase
X
X
X
□ positiv
□ negativ
□ positiv
□ negativ
X
Optochintest
□ positiv
□ negativ
□ positiv
□ negativ
X
X
X
□ positiv
□ negativ
X = Test zur Identifizierung nicht geeignet
Beurteilung:
 Normale Rachenflora
 Träger von S.aureus,
 Träger von Streptococcus pneumoniae,
 Träger von Streptococcus pyogenes
41
Koagulase
X
□ positiv
□ negativ
□ positiv
□ negativ
X
Streptex
X
wird von d.
Kursassistenz
durchgeführt
X
X
Demonstrationen
Demonstrationsplatte von Pneumokokken und Viridans-Streptokokken im Optochintest
Ein Pathogenitätsfaktor von Pneumokokken ist ihre Kapsel. Sie wachsen daher als schleimige Kolonien
auf Blutagar und besitzen eine alpha-Hämolyse (vergrünend).
Um sie von sonstigen vergrünenden Streptokokken zu unterscheiden, wird der Optochintest durchgeführt.
Er dient zur Unterscheidung von Viridans-Streptokokken gegenüber Pneumokokken. Streptococcus
pneumoniae ist Optochin empfindlich.
Optochintest
Durchführung:
Eine Blutplatte wird mit dem Keim kreuz und quer ausgestrichen, anschl. legt man mit einer
abgeflammten Pinzette ein Optochin-Testblättchen auf.
Platte 16-24h bei 37°C bebrüten.
Auswertung:
Wachstumshemmhof > 14mm → Streptococcus pneumoniae
Wachstumshemmhof < 14mm → Streptokokken der Viridansgruppe
Corynebakterien
Neben der Streptokokkenangina kam vor Einführung der Schutzimpfung der Angina diphtherica eine
besondere Bedeutung zu. Heute gibt es in Deutschland nur noch sehr selten begrenzte Epidemien.
Allerdings werden in den letzten Jahren wieder gehäuft toxinbildende Corynebakterien nachgewiesen.
Die Erkrankung beginnt meistens als Infektion des Rachens mit Rötung und Schwellung der Tonsillen,
begleitet von schwerem, allgemeinem Krankheitsgefühl. Innerhalb von Stunden bilden sich weiße Beläge,
die von der Tonsille auf Rachen und Gaumen übergreifen. Die Pseudomembranen färben sich von
rahmartig weiß in bräunlich um. Sie sind Teil der Mucosa und haften fest auf der Wundfläche der
Schleimhaut. Der Versuch, sie abzulösen, verursacht Blutungen. Die Patienten haben einen typischen
fad-süßlichen Mundgeruch.
Andere Manifestationen der lokalisierten Diphtherie sind die Nasen-, Augen-, primäre Kehlkopf- und
Wunddiphtherie. Die Wunddiphtherie führt selten zur Intoxikation, obwohl hohe Antitoxin-Spiegel
nachgewiesen werden können.
Neben der lokalen Infektion kann es auch zu einer systemischen Infektion kommen. Das Toxin wird
allerdings ausschließlich von solchen Diphtherie-Stämmen produziert, die durch die Anwesenheit eines
Phagen lysogen und damit virulent (toxinogen) sind. Ein Phagen-tox-gen kodiert im Zellstoffwechsel der
Diphtheriebakterien die Synthese des Toxins. Es wird als hoch potentes Exotoxin aktiv an das
umgebende Gewebe abgegeben.
Die Übertragung der Diphtherie erfolgt von Erkrankten oder gesunden Keimträgern durch direkten
Kontakt oder Tröpfcheninfektionen.
Die Therapie erfolgt allein aufgrund des klinischen Bildes und der Verdachtsdiagnose. Die wichtigste
Maßnahme ist die sofortige Gabe von Antitoxin. Vor Beginn einer Antibiotikatherapie müssen Rachen
und Nasenabstriche zur bakteriologischen Untersuchung abgenommen werden. Das Ergebnis der
Untersuchung kann allerdings nicht abgewartet werden. Die Antibiotikatherapie vermag die antitoxische
Serotherapie nur zu unterstützen. Antibiotika verhindern zwar die weitere Vermehrung der Bakterien und
damit die Neubildung von Toxin, sie haben aber keinen Einfluss auf bereits gebildetes Toxin. Mittel der
Wahl ist Penicillin G.
Morphologisch handelt es sich bei Corynebacterium diphtheriae um grampositive, schlanke Stäbchen.
Sie sind oft leicht gekrümmt mit keulenartig aufgetriebenen Enden. In der Lagerung zueinander erinnern
sie an chinesische Schriftzeichen. Mit der Spezialfärbung nach Neisser (siehe unten) lassen sich im
Kulturpräparat von Blutagar oder Löfflerserum schwarzblau gefärbte Polkörperchen bei sonst braungelb
42
gefärbten Bakterien erkennen. Die Polkörperchen enthalten Kalzium sowie Metaphosphate. Das
mikroskopische Präparat erinnert an eine ausgeschüttete Streichholzschachtel.
Die Anzüchtung gelingt auf Blutagar oder serumhaltigen Nährböden (Löfflermedium). Zur Selektion der
Corynebakterien aus normaler Rachenflora werden Spezialmedien mit Zusatz von Tellurit benutzt
(Clauberg II und Clauberg III). Diese Medien hemmen die Begleitflora weitgehend. C. diphtheriae toleriert
Kaliumtellurit, reduziert es und speichert das Tellur. Die Kolonien sind dadurch dunkelgrau bis schwarz
gefärbt.
Es können 3 verschiedene Diphtherietypen unterschieden werden:
Typ gravis, mitis und intermedius. Eine eindeutige Zuordnung zu bestimmten Krankheitsverläufen ist nicht
möglich. Alle 3 Typen können die Ursache für schwerste, lebensbedrohende Erkrankungen sein. Die
Typisierung ist vorwiegend von epidemiologischem Interesse.
Aufgabe:
Färben von Corynebakterien nach Gram und Neisser
- Von den Kulturen von Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium pseudodiphtheriae
je 2 Präparate herstellen
- Präparate lufttrocknen lassen, hitzefixieren
- 2 Präparate nach Gram, 2 Präparate nach Neisser färben
Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
Skizzieren der Form und Lage der Bakterien
Färbung nach Neisser
Durchführung:
1. Neisser I
→1 Minute
Farbe abgießen, nicht mit Wasser abspülen!
2. Neisser II
→1 Minute
Farbe abgießen, nicht mit Wasser abspülen!
Präparat zwischen Filterpapier trocknen
Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
Beurteilung:
C. diphtheriae = schwarzblau gefärbte Polkörperchen bei sonst braungelb gefärbten Bakterien
C pseudodiphtheriae = braungelb gefärbten Bakterien, ohne Polkörperchen
Skizze der Form und Lage der Bakterien:
43
Kursteil 7
•
•
•
•
Antibiotikaaustestung II
Anaerobier I
Blutkultur I
Darmpathogene Keime I
Antibiotikaaustestung II
Aufgabe:
1. Ablesen und protokollieren der Hemmhof-Durchmesser des Agardiffusionstest
2. Ablesen und protokollieren der Ergebnisse der Empfindlichkeitsbestimmung von Enterobacteriaceae
Protokoll: Agardiffusionstest
Antibiotikum
Dispenser I:
Penicillin G
Ampicillin
Ampicillin/Sulbactam
Piperacillin
Cefazolin
Cefotaxim
Dispenser II:
Imipenem
Erythromycin
Ciprofloxacin
Gentamicin
Co-Trimoxazol
Tetracyclin
Code Resistent ab
Hemmhof
<
Intermediär
Hemmhof
von - bis
sensibel ab
Hemmhof
>
P
AM
SAM
PIP
CZ
CTX
13
13
16
17
14
14
13-17
13-17
16-21
17-21
14-18
14-23
17
17
21
21
18
23
IPM
E
CIP
GM
SXT
TE
13
13
15
12
10
12
13-16
13-23
15-21
12-15
10-16
12-16
16
23
21
15
16
16
gemessener
Wert
Beurteilung
Welches Antibiotikum empfehlen Sie zur Therapie der nosokomialen Pneumonie?
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
44
Empfindlichkeitsbestimmung von Enterobacteriaceae gegenüber verschiedener Antibiotika
mit dem Teststreifen ATB G-1:
Ablesung und Interpretation:
Antibiotika, die in 2 Konzentrationen getestet werden:
Die Vertiefungen sind
Ergebnis
c
C
c
klar
klar
trüb
klar
+
trüb
trüb
+
Der Stamm ist:
C
+
S = Sensibel
I = Intermediär
R = Resistent
Antibiotika, die nur in einer Konzentration getestet werden:
Die Vertiefungen sind
klar
trüb
Ergebnis
+
Der Stamm ist:
S = Sensibel
R = Resistent
Protokoll: Empfindlichkeitsbestimmung
Antibiotikum
Wachstumskontrolle
(kein Antibiotikum)
Ampicillin
Amox-Clav.AC
Ticarcillin
Piperacillin
Piperacillin+Tazobactam
Cephalothin
Cefuroxim
Cefixim
Cefotaxim
Cefoxitin
Cefoxitin 32
Ceftazidim
Cefepim
Imipenem
Meropenem
Gentamicin
Tobramycin
Amikacin
Tetracyclin
Nalidixin Acid (CASFM)
Nalidixin Acid (CLSI)
Ofloxacin
Levofloxacin
Ciprofloxacin
Cotimoxazol
Fosfomycin
Code
c
O
AMP
AMC
TIC
PIC
TZP
CFT
CXM
CFM
CTX
CXT
CX32
CAZ
FEB
IMI
MERO
GEN
TOB
AKN
TET
NALF
NALI
OFL
LVX
CIP
TSU
FOS
C
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
45
Interpretation
Sensibel
Intermediär
Resistent
Beide Vertiefungen müssen trüb sein
Anaerobier I
Die Bakterien werden eingeteilt nach der Fähigkeit O2 als Elektronenakzeptor zu gebrauchen
Obligat aerobe Bakterien
Mikroaerophile Bakterien
O2 ist essentiell für das Wachstum
Beispiel: Pseudomonaden, Mykobakterien
Wachstum nur bei reduziertem O2 Partialdruck (5% CO2)
Beispiel: Gonokokken, Mycoplasmen, Campylobacter
Obligat anaerobe
O2 ist toxisch, Wachstum nur in O2-freiem Milieu
Bakterien
Beispiel: Clostridien, Bacteroides, Peptokokken
Fakultativ anaerobe
Wachstum sowohl in Gegenwart von O2 als auch im O2-freien Milieu
Bakterien
Beispiel: Enterobacteriaceae, Streptokokken, Staphylokokken
Obligat anaerobe Keime werden Morphologie und Färbeverhalten eingeteilt
Vorkommen
1. Obligat anaerobe, grampositive, sporenbildende Stäbchen
-Clostridien
ubiquitär
(Gastrointestinaltrakt)
2.Obligat anaerobe, gramnegative Stäbchen
Bestandteile der
- Bacteroides spp.
physiologischen Flora
- Fusobakterien
3.Obligat anaerobe, grampositive Kokken
(Schleimhaut,
- Peptokokken
Gastrointestinaltrakt)
- Peptostreptokokken
4.Obligat anaerobe, gramnegative Kokken
- Veillonellen
Infektionen mit Anaerobier (Ausnahme: Clostridien) sind überwiegend endogene Misch-Infektionen
(reduzierte O2-Spannung nach Trauma, Stase). Veillonellen besitzen klinisch praktisch keine Bedeutung.
Clostridien sind für eine Reihe schwerer Krankheitsbilder verantwortlich. Virulenzfaktoren sind Toxine,
die von Clostridien gebildet werden.
Sporen:
Erkrankung:
Erreger:
Gasbrand
Tetanus
Clostridium
Clostridium
Clostridium
Clostridium
Clostridium
Botulismus
Clostridium botulinum
Enterale Toxininfektionen
Clostridium perfringens
Pseudomembranöse Colitis
Clostridium difficile
perfringens
novyi
septicum
histolyticum
tetani
46
Terminal
(Trommelschlegel)
Subterminal
(Tennisschlägerform)
Keine
Subterminal
(Tennisschlägerform)
Aufgabe:
1. Mikroskopische Morphologie verschiedener Clostridienspezies
Pro Tisch 3 Sets mit:
- Cl.tetani
- Cl.botulinum
- Cl.perfringens
- Bacteroides fragilis
Bitte Beachten: das unterschiedliche Vorhandensein und Lokalisation der jeweiligen Sporen!
Die Präparate nach dem Betrachten nicht entsorgen!
2. Anzucht von obligat anaeroben und obligat aeroben Keimen auf Festnährböden
(Übung wird 2x pro Tisch durchgeführt)
Material:
Auf jeder 2. Tischreihe steht 1 Anaerobier-Topf mit:
- 4 Bacteroides fragilis-Kulturen
- 4 Clostridium perfringens-Kulturen (sind nur zur Demonstration)
Auf jedem Tisch liegen 2 Sets mit:
- 1 Pseudomonas aeruginosa-Kultur
- 2 Columbia-Agarplatten
- 2 Schädler-Agarplatte
a) Aerobe Anzucht
Durchführung:
- 1 Columbia-Agarplatten beschriften mit: Platznummer, aerob, P. aeruginosa,
Platte mit P. aeruginosa beimpfen
- 1 Columbia-Agarplatten beschriften mit: Platznummer, aerob, Bacteroides fragilis,
Platte mit Bacteroides fragilis beimpfen
- Beide Columbia-Agarplatten für 16-24 h bei 37°C bebrütet
b) Anaerobe Anzucht
Durchführung:
- 1Schädleragarplatten beschriften mit: Platznummer, anaerob, P. aeruginosa
Platte mit P. aeruginosa beimpfen, in den Anaerobier-Topf legen
- 1 Schädleragarplatten beschriften mit: Platznummer, anaerob, Bacteroides fragilis
Platte mit Bacteroides fragilis beimpfen, in den Anaerobier-Topf legen
- Anaerobes Milieu im Anaerobier-Topf durch Aktivierung des Reaktionsbeutels erzeugen
- Anaerobier-Topf verschließen
- Beide Schädleragarplatten für 16-24 h bei 37°C be brütet
Protokollieren der Ergebnisse am nächsten Kurstag (siehe Kursteil 8 / Anaerobier II)
47
Blutkultur I
Diagnostische Maßnahmen bei Sepsis:
Die Bakteriämie stellt die symptomlose Präsenz von Bakterien im Blut dar. Sie ist ein häufiges Ereignis
und tritt z.B. beim Zähneputzen in etwa 30% auf. Im Gegensatz dazu ist eine Sepsis die Präsenz von
Keimen im Blut mit Symptomen (z.B. Schüttelfrost, Tachycardie, Fieber). Neben den obligat pathogenen
Erregern, die zu einer Sepsis führen (z.B. Salmonella typhi), gibt es in einem Klinikum Sepsis v. a. im
Rahmen von Hospitalismusinfektionen. Hier spielen Infektionen durch Enterobacteriaceae oder
Katheterinfektionen durch Staphylococcus epidermidis oder Staphylococcus aureus eine große Rolle.
Zur Erfassung einer Sepsis führt man Blutkulturen durch. Dabei wird Blut, das aus einer peripher
punktierten Vene gewonnen wurde (ca. 2-10ml), in spezielle Blutkulturflaschen injiziert. Je nach System
werden dabei nur eine oder je zwei Flaschen für die aerobe und anaerobe Diagnostik beimpft. Die
Flaschen werden dann bei 37 o C in speziellen Automaten inkubiert. Bei Bakterienwachstum kommt es zu
einer Veränderung der Flasche, die von dem Automaten erfasst wird. Der Erreger wird dann durch
Subkultur aus der Flasche auf herkömmlichen Nährböden weiter differenziert.
Aufgabe: (3er Gruppen pro Tisch)
Auf dem Arbeitsplatz befinden sich eine Blutkulturflasche und ein Röhrchen mit Blut bei Sepsisverdacht
- mit einer Spritze und aufgesetzter Kanüle werden vorsichtig 2 ml Blut aufgezogen
- von der Blutkulturflasche wird die sterile Plastikabdeckung entfernt und anschl. das
Blut in die Flasche injiziert.
Achtung !!! Bitte die Spritze und Kanüle direkt in das gelbe Entsorgungsgefäß geben
Niemals die Kanüle wieder zurück in ihren Plastikschutz geben. Dies ist der Hauptgrund für
iatrogen übertragene HIV-Infektionen!
- Flasche mit der Platznummer beschriften
- Die Flasche wird für 24 Stunden bei 37oC bebrütet
- Identifizierung der Keime und protokollieren der Ergebnisse am nächsten Kurstag
(siehe Kursteil 8 / Blutkultur II)
48
Darmpathogene Keime I
Das Symptom „Durchfall“ kann einerseits durch von Mikroorganismen produzierte Toxine hervorgerufen
werden. In diesem Fall können die verantwortlichen Erreger zwar selbst noch vorhanden sein, ihre
Anwesenheit ist jedoch nicht zum Auslösen der Erkrankung erforderlich (Intoxikation; Prototyp:
Enterotoxine von S. aureus). Andererseits können eine Vielzahl von Erregern direkt zum Symptom
Durchfall führen (Infektion, Prototyp: Salmonellen). Erreger können hierbei Viren, Parasiten und Bakterien
sein.
Ein großer Teil der durch Nahrungsmittel übertragenen Durchfallerkrankungen wird durch gramnegative
Stäbchen (Salmonellen) hervorgerufen. Zumeist sind diese Bakterien nicht in der Lage, Laktose zu
verstoffwechseln. Das Aufbringen des Stuhls auf eine McConkey-Platte zur Auffindung laktosenegativer
Bakterien stellt daher eine im Labor häufig durchgeführte Screeninguntersuchung dar.
Aufgabe: (3er Gruppen pro Tisch)
Handschuhe anziehen!
Auf dem Arbeitsplatz stehen zwei Nahrungsmittelproben, die im Verdacht stehen eine GastroenteritisEpidemie ausgelöst zu haben.
Die Nahrungsmittel-Proben werden mit einem „Drei-Ösenausstrich“ kultiviert auf:
1. Blutagar (=Columbiaagar)
= Optimalnährboden
2. MacConkey-Agar
= Selektivagar
- Die im MacConkey-Agar enthaltene Gallensalze und Kristallviolett hemmen die grampositive Flora.
- Laktose dient zusammen mit dem pH-Indikator Neutralrot zum Nachweis des Laktoseabbaus
3. XLD-Agar
= Spezialagar zum Nachweis von Salmonellen
- Der Abbau von Xylose, Laktose und Saccharose wird durch den Umschlag des Indikators Phenolrot
von rot nach gelb angezeigt.
- Thiosulfat und Eisen-(III)-Salz zeigen Schwefelwasserstoffbildung an durch Ausfällung schwarzen
Eisensulfids in den Kolonien.
- Der Abbau von Lysin ist erkennbar an der purpurroten Farbe um die Kolonie infolge Erhöhung des
pH-Wertes
Die Agarplatten werden 16-24 h bei 37°C bebrütet
Identifizierung der Keime und protokollieren der Ergebnisse am nächsten Kurstag
(siehe Kursteil 8 / darmpathogene Keime II)
49
Kursteil 8
•
•
•
Anaerobier II
Blutkultur II
Darmpathogene Keime II
.
Anaerobier II
Aufgabe:
Ablesen und protokollieren der Ergebnisse
Protokoll: Wachstum von aeroben und anaeroben Keimen auf Festnährböden
Keim
Aerobes Wachstum
Anaerobes Wachstum
Bacteroides fragilis
Pseudomonas
Blutkultur II
Aufgabe:
In der Flasche ist durch das Bakterienwachstum ein Überdruck entstanden. Dieser wurde durch
Einbringen einer Kanüle vor dem Kurs entlastet.
- Vorsichtig mit einer Spritze + Kanüle eine geringe Menge an Inhalt der Blutkulturflasche aufziehen
- Spritze abnehmen und zusammen mit der Kanüle entsorgen
- 1-2 Tropfen Flüssigkeit auf einen Objektträger geben und verteilen
- Lufttrocknen, hitzefixieren und nach Gram färben
- Im Routinelabor werden bei diesem Arbeitsschritt zusätzlich je eine Blutagar-, Mac Conkey- und
XLD-Platte beimpft. Aus zeitlichen Gründen wurde dieser Schritt von der Kursassistenz durchgeführt
und auf den Arbeitsplätzen bereit gestellt.
- Identifizierung des Keims (siehe darmpathogene Keime II)
- Protokollieren der Ergebnisse (siehe darmpathogene Keime II)
50
Darmpathogene Keime II
Merkmale einiger darmpathogener Keime:
Staphylokokken
Gramverhalten
grampos. Kokken
gelbe/weiße
Kolonie,
β-Hämolyse
kein Wachstum
Salmonellen
gramneg.
Stäbchen
E. coli
gramneg. Stäbchen
graue Kolonie,
keine Hämolyse
graue Kolonie,
z. T. β-Hämolyse
Wachstum
Wachstum
Laktosespaltung auf MacConkey-Agar kein Wachstum
Laktose neg.
Laktose pos.
Wachstum auf XLD-Agar
kein Wachstum
helle Kolonie
Koagulase
positiv
schwarze Kolonie
Test nicht
geeignet
Polyklonale Agglutination
Test ist nicht
geeignet
positiv
negativ
Wachstum auf Blutagar
Wachstum auf MacConkey-Agar
Test nicht geeignet
Polyklonale Agglutination zum Nachweis von Salmonellen:
Durchführung:
- 1 Tropfen polyvalentes Salmonellen Test-Serum auf einen Objektträger geben
- einige Bakterienkolonien von der Blutagarplatte in das Serum hinein reiben
Negative Reaktion: Homogene Trübung
Positive Reaktion: Agglutination
Koagulase-Reaktion zum Nachweis von Staphylococcus aureus:
Durchführung:
- 1 Tropfen Zitratplasma auf einen Objektträger geben
- einige Bakterienkolonien in das Zitratplasma hinein reiben
Negative Reaktion: Homogene Trübung
Positive Reaktion: Koagulation
Aufgabe:
- Herstellen eines Grampräparates von den gewachsenen Kulturen. Färben und mikroskopieren
- Beurteilung des Wachstumsverhaltens auf den unterschiedlichen Nährböden
- Identifizierung der Keime
- Protokollieren der Ergebnisse (siehe unten)
Protokoll: Identifizierung darmpathogener Keime und Keime aus der Blutkultur
Probe 1
Gramverhalten
Wachstum auf Blutagar:
Wachstum auf MacConkey-Agar:
Laktosespaltung auf MacConkey-Agar:
Wachstum auf XLD-Agar:
Polyklonale Agglutination:
Koagulase:
Diagnose:
51
Probe 2
Blutkultur
Kurstag 9
Mykologie:
• Sprosspilze
• Schimmelpilze
Einführung:
Pilze sind heterotrophe, eine Zellwand ausbildende Eukaryonten, die auf oder in organischem Material
einen Thallus ausbilden können und sich asexuell oder sexuell fortpflanzen. Sie kommen in Form von
Einzelzellen (z.B. Bäckerhefe) und Zellverbänden (z.B. Hutpilze) vor. Sie besitzen kein Chlorophyll und
sind somit nicht zur Photosynthese befähigt. Sie benötigen daher organische Kohlenstoff-Quellen (Cheterotroph) und können auch unter Lichtabschluss leben. Pilze sind als Einzeller aufzufassen. Bei
manchen Pilzarten können sich einzelne Zellen aber unterschiedlich spezialisieren. Die einfachste,
einzellige Form ist der Sprosspilz, heute als Hefe bezeichnet. Um die lediglich durch Sprossung sich
fortpflanzenden Hefen von den echten (perfekten) Hefen, die zur Sexualsporenbildung befähigt sind (z.B.
Ascomyceten) abzugrenzen, werden die Sprosspilze auch als nicht sporenbildende Hefen bezeichnet.
Komplexere Strukturen kommen ebenfalls vor. Eine Pilzzelle kann sich verlängern, ohne sich zu teilen.
Es resultiert eine fadenförmige Hyphe. Verschachteln sich mehrere Hyphen, entsteht ein Myzel. Bei
einem Myzel dessen Hyphen alle von einer einzigen Zelle abstammen, handelt es sich um einen Thallus.
Ist ein derartiges Hyphengeflecht lose strukturiert, liegt eine Kolonie vor.
Bei einem Drittel der bislang bekannten Pilzarten ist der Entwicklungsgang der Hauptformen mit sexueller
Reproduktion, meist unter Sporenbildung nicht bekannt. Diese Pilze werden als Fungi imperfecti
(Deuteromycetes) zusammengefasst. Bei diesen Pilzen ist, da sich Haupt- und Nebenfruchtformen an
ganz unterschiedlichen Standorten entwickeln und zudem morphologisch sehr unterschiedlich ausfallen,
entweder die Zuordnung beider Formen nicht gelungen, oder die Pilze haben die Möglichkeit zur
Ausbildung einer sexuellen Fruktifikation verloren.
Die Gesamtzahl der Pilzarten wird auf 100.000 bis 250.000 geschätzt, lediglich ca. 180 Arten stehen mit
Erkrankungen von Mensch und Tier in Zusammenhang. Hier findet man häufig imperfekte Pilzarten,
sowohl in der Hefeform als auch in Form von Schimmelpilzen. Bei den letzteren spielen in der
medizinischen Mykologie die charakteristischen Nebenfruchtformen, die asexuell gebildeten Sporen
(Konidien) und deren besondere Fruchtkörper, für die Identifizierung eine wichtige Rolle.
Neben Pilzinfektionen sind Mykoallergien, Mykotoxikosen durch sekundäre Stoffwechselprodukte und
Myzetismus, die Pilzvergiftung durch Aufnahme von Strukturelementen von Pilzen, meist Basidiomyzeten
(Hut- und Ständerpilze), in der Humanmedizin von Bedeutung.
Im Kursabschnitt Mykologie werden an Hefen und Schimmelpilzen die wichtigsten klassischen
Untersuchungsmethoden aus der Routinediagnostik vorgestellt. Andere Verfahren wie Serologie,
Immunfluoreszenz, PCR etc. können nicht behandelt werden.
Begriffe:
Hyphe:
Pilzfaden, Myzel – Hyphengeflecht
Pseudomyzel:
Ketten von Hefezellen, die hyphenartig verlängert sind
Vegetative Sporen:
Konidien = frei an Hyphen gebildete vegetative Ektosporen (Mikrokonidien sind einzellig,
Makrokonidien sind mehrzellig, gewöhnlich septiert)
Blastospore = Sprosszelle, Hefe im engeren Sinn, keine echte Spore im Sinne von Dauerformen!
Chlamydospore = Hyphenabschnitte mit verdickter Zellwand
Arthrospore = Quader- oder walzenförmiges Hyphenfragment
Sexuelle Sporen:
Ascosporen, Zygosporen, Basidiosporen = sexuelle Sporen, die in speziellen Sporenbehältern reifen.
52
In der medizinischen Mikrobiologie werden die Pilze ohne Rücksicht auf Klassenzugehörigkeit nach
praktischen und klinischen Gesichtspunkten in folgende Gruppen, dem DHSD-System, eingeteilt:
• Dermatophyten
• Hefen
• Schimmelpilze
• Dimorphe Pilze ( =DHSD-System
Von den Vertretern der anderen Gruppen unterscheiden sich die Dermatophyten, die Erreger der
Dermatophytosen dadurch, dass sie nur oberflächliche Mykosen verursachen. Sie befinden sich auf der
Haut und deren Anhangsgebilden und breiten sich gewöhnlich nicht über das Stratum basale hinweg in
die Tiefe aus.
Hefen lassen sich schon makroskopisch von den luftmyzelbildenden Schimmelpilzen unterscheiden. Sie
wachsen auf Nährmedien meist in weißlichen, glatten Kolonien, ähnlich Bakterienkolonien.
Für die Gruppe der dimorphen Pilze ist charakteristisch, dass sie im Organismus in der Hefephase, aber
in der freien Natur luftmyzelbildend (wie Schimmelpilze) vorkommen.
Orte, an denen Pilze Infektionen verursachen:
Lunge
Cryptococcus, Pneumocystis jiroveci, Aspergillus,
Candida, Mucorales, (Blastomyces, Coccidioides,
Paracoccidioides, Histoplasma)*
Blut
Candida, Cryptococcus, Fusarien, (Histoplasma)*
Schleimhäute
Candida, Cryptococcus, Fusarien, (Blastomyces)*
Liquor
Cryptococcus
Harnwege
Cryptococcus, Candida,
(Blastomyces, Coccidioides, Histoplasma)*
Nasennebenhöhlen
Aspergillus, Mucorales, Fusarien (Sporothrix)*
Subkutanes Gewebe
(Mycetoma-Erreger, Sporothrix,
Chromoblastomykose-Erreger)*
Haut
Dermatophyten, Fusarien,
(Sporothrix, Chromoblastomykose-Erreger,
Coccidioides, Paracoccidioides, Blastomyces)*
Haare, Nägel
Dermatophyten, Trichosporon*, Scopulariopsis
Verschiedene (Disseminierte Infektionen)
Candida, Cryptococcus, Aspergillus
(Coccidioides, Paracoccidioides)*
*in Mitteleuropa nicht endemisch
53
Sprosspilze
1. Candida albicans:
Mit mehr als 150 Arten sind die Arten der Gattung Candida in der Umwelt weit verbreitet, 17 Arten
wurden bislang als Infektionserreger beschrieben. Die am häufigsten mit Hefemykosen assoziierte Art
Candida albicans hat ihren natürlichen Standort am Menschen bzw. Warmblüter, aber nicht in der Natur.
Andere Arten wie Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis lassen sich
auch aus der Umwelt isolieren und spielen somit bisweilen auch eine Rolle als Erreger von exogen
übertragenen Hospitalinfektionen.
Etwa 30% der Gesunden sind oral oder gastrointestinal mit Candida besiedelt, wobei die Keimzahl meist
gering ist. Bei hospitalisierten Patienten steigt die Kolonisierungsrate proportional zur Aufenthaltsdauer im
Krankenhaus an. Candida zählt zu den sog. opportunistischen Erregern. Eine Infektion entwickelt sich
erst dann, wenn lokale oder systemische Faktoren dafür disponieren. So spielt die chronische Mazeration
der Haut bei der Windeldermatitis des Säuglings oder der Intertrigo bei Fettleibigen eine Rolle. Ist die
zelluläre Immunabwehr kompromittiert, kann es zur Ausbildung einer systemischen Organmykose mit
anschließendem Multiorganversagen oder einer Pilzsepsis kommen. Beispielhafte Risikofaktoren für
invasive Mykosen sind: extreme Altersgruppen (Neugeborene, sehr alte Menschen), chronisches
Nierenversagen,
Diabetes,
Neutropenie,
lymphoide
Malignome,
AIDS,
Transplantation,
Kortikosteroidtherapie, Polytraumata, Verbrennungen.
Diagnostik:
Die Anfertigung eines Nativ-, Methylenblau-, oder Grampräparates direkt vom Untersuchungsmaterial ist
eine sehr schnelle und hilfreiche orientierende Methode, die vor allem bei Haut- oder
Schleimhautinfektionen eine unmittelbare Erregerdiagnose ermöglicht.
Mit der mikroskopischen
Untersuchung von Punktaten kann man sofort wichtige morphologische und quantitative Informationen
über die Pilz-Ätiologie einer Infektion erhalten und somit unverzüglich mit einer unter Umständen
lebensrettenden antimykotischen Therapie beginnen.
Der Nachweis einer systemischen Candida-Infektion dagegen ist schwer. Ein Nachweis von Pilze mittels
Blutkulturflaschen ist nicht immer möglich. Der serologische Nachweis von Antikörpern gegen Candida ist
mit Hämagglutinationstests, Immunfluoreszenz und ELISA-Techniken möglich, kann aber oft kaum
zwischen einer Besiedlung und Infektion unterscheiden. Bei einer systemischen Infektion ist zwar mit
einem Titeranstieg beim immunkompetenten Patienten zu rechnen, jedoch sind in der Regel die
Betroffenen meist immunsupprimiert.
Die klassische Diagnostik setzt immer noch die Kultur voraus, wobei heute durch den sog.
CHROM-Agar eine Kultivierung mit gleichzeitiger Differenzierung durch verschiedene Farben der
Kolonien realisiert wurde.
Keimschlauchtest:
Der Keimschlauchtest ist ein einfacher und kostengünstiger Nachweis zur Schnelldiagnose von C.
albicans. Bereits am Tag der Anzucht können 90% aller C. albicans-Fälle diagnostiziert werden, ohne
kommerzielle Testkits einsetzen zu müssen. Keimschlauch-negative C. albicans-Stämme können durch
Chrom- oder Reisagar nachgewiesen werden.
Keimschlauchtest
Durchführung:
Man nimmt mit der Öse einige Kolonien von Candida albicans auf und suspendiert die anhaftenden
Hefezellen in einem Röhrchen mit 0,5-1ml Serum.
In gleicher Weise stellt man zur Negativkontrolle eine Suspension mit Candida glabrata her.
Die Röhrchen werden 1-2 Stunden im Heizblock bei 36°C bebrütet.
Anschl. stellt man ein Deckglaspräparat her und mikroskopiert mit dem 10er oder 40er Objektiv.
Blastosporen von C. albicans bilden in dieser Zeit einen Keimschlauch aus.
54
Aufgabe:
Nachweis der Keimschlauchbildung
Durchführung:
Röhrchen 1 = Candida albicans
Röhrchen 2 = Candida glabrata (Negativkontrolle)
Die Proben sind bereits im Heizblock 1 h bei 36°C bebrütet worden und stehen 2x pro Tisch zur
Verfügung.
- Jeder Kursteilnehmer bringt mit der Öse einen Tropfen Hefesuspension auf einen Objektträger.
- Der Tropfen wird mit einem Deckgläschen bedeckt und mikroskopiert.
Mikroskopie: 10er – 40er Objektiv, ohne Öl !
2. Cryptococcus neoformans
Seit dem Auftreten der AIDS-Epidemie zu Beginn der 80er Jahre ist weltweit eine deutliche Zunahme der
Inzidenz von Cryptococcus-Infektionen zu beobachten. Gelegentlich können auch immunkompetente
Personen betroffen sein. Wie bei allen opportunistischen Infektionen besteht aber meist eine Assoziation
mit verschiedenen Grunderkrankungen wie Tuberkulose, chronische Nierenerkrankungen, Erkrankungen
unter systemischer Corticoid-Therapie oder Immunsuppression im
Zusammenhang mit
Organtransplantation.
Die Infektion mit Cryptococcus neoformans, einer im Warmblüter bekapselten Hefe, erfolgt aerogen durch
Inhalation des Pilzes aus der Umgebung. Es handelt sich hierbei oft um die Sporen der perfekten Form,
eines auf Getreide und Gräsern wachsenden Basidiomyzeten (Filobasidiella neoformans). Die
Verbreitung der Kryptokokken erfolgt aber auch über Vögel, die mit den Gräsern und Samen auch die
Sporen aufnehmen und mit ihren Exkrementen die infektionsfähigen Kryptokokken wieder ausscheiden,
die sich im Verdauungstrakt vermehrt haben (Taubenkot). Im Wirtsorganismus entwickelt sich dann die
gewöhnlich bekapselte Hefeform. In Abhängigkeit von der Immunitätslage wird die Infektion abgewehrt
bzw. bleibt auf die Lunge beschränkt oder es folgt die hämatogene Disseminierung mit Befall des ZNS
und verschiedener anderer Organe.
Die Kryptokokkose manifestiert sich als Meningoenzephalitis und Meningitis beim Abwehrgeschwächten,
in wenigen Fällen tritt eine kutane Kryptokokkose auf. Wegen der „unbemerkten“ Vermehrung ohne akute
entzündliche Reaktion beginnt die Meningoenzephalitis schleichend, oft nur mit subakuten und
uncharakteristischen Beschwerden (Kopfschmerz). Die pulmonale Kryptokokkose geht über einen
längeren Zeitraum mit rekurrierenden unspezifischen Symptomen wie Fieber, Husten, Dyspnoe und
eventuell pleuritischen Beschwerden einher.
Diagnostik:
Da Cryptococcus neoformans nicht als Schleimhautsaprophyt vorkommt, ist jeder Nachweis in
menschlichem Untersuchungsmaterial diagnostisch signifikant. Im Vordergrund der Diagnostik stehen der
mikroskopische und kulturelle Nachweis aus dem Liquorsediment. Hierbei hat sich die direkte
Mikroskopie nach Anfertigung eines Tuschepräparates bewährt. Im Gegensatz zu den mehr ovalen
Candida-Zellen erscheinen die 3-20µm großen bekapselten Kryptokokken auffallend rund mit dicke,
doppelt konturierter Zellwand. Um eventuelle Kontaminationen auszuschließen, sind mikroskopische
Befunde stets kulturell zu bestätigen. Hier wird ein Kreatinin-Agar verwendet, der Cryptococcus
neoformans an der Bildung eines braunen Pigments erkennbar macht (Melaninbildung wegen des
Vorhandenseins von Phenoloxidase).
Neben dem mikroskopischen Präparat stehen zur Schnelldiagnostik für Liquor-, Serum- und Urinproben
Antigen-Nachweismöglichkeiten zur Verfügung.
55
Kapseldarstellung im Tuschepräparat
Durchführung:
1. Herstellen einer Hefesuspension:
- 0,5 ml phys. NaCl + einige Kolonien von der Hefekultur
- mischen mit der Öse
2. Herstellen eines Tuschepräparats:
- 1Tropfen Tusche + 1Tropfen Hefesuspension auf einen Objektträger geben
- mischen mit der Öse
- Deckglas auflegen, mikroskopieren.
Wichtig: Tropfen nicht zu große machen!
Mikroskopie: 40er Objektiv
Beurteilung: Die Kapsel ist unter dem Mikroskop als helle Aussparung zu erkennen
Aufgabe:
Herstellen von Tuschepräparaten
1. von Cryptococcus neoformans
2. von Candida albicans (=Negativkontrolle)
Cryptococcus neoformans
(Tuscheausstrich)
56
•
Schimmelpilze
Schimmelpilze sind in vielen Gattungen in der Natur verbreitet. Meist leben sie als Saprophyten auf
abgestorbener organischer Substanz (Topfpflanzen und Essensreste in Kliniken!). Da ihre Bestandteile
(Hyphenfragmente, Konidien) auch ständig in der Luft anzutreffen sind, werden sie somit ständig inhaliert.
Unter bestimmten Umständen können einige Arten humanmedizinische Relevanz erlangen als:
• Erreger opportunistischer Infektionen
• Mykotoxinbildner
• Allergene
Mit Zunahme der abwehrgeschwächten Patienten ist insbesondere die Häufigkeit von AspergillusInfektionen kontinuierlich angestiegen. Neben dem häufigsten Erreger aus dieser Gattung, Aspergillus
fumigatus, werden auch andere Arten, wie Aspergillus niger nachgewiesen. Diese Infektionen sind immer
lebensbedrohlich, da sie fast ausschließlich bei Patienten mit schweren Grunderkrankungen auftreten.
Betroffen sind Patienten mit hämatologischen Neoplasien, mit Knochenmark- oder anderen
Organtransplantationen. Gelegentlich finden sich auch beim immunkompetenten Patienten AspergillusInfektionen, die aber meist lokalisiert sind und in der Regel vorgeschädigtes Gewebe betreffen.
Diagnostik:
Für den Therapieerfolg ist eine frühzeitige Diagnosestellung essentiell. Der mikroskopische Nachweis von
verzweigten Pilzfäden, z.B. im Sputum von Risikopatienten, ist diagnostisch hinweisend. Der negative
mikroskopische Befund schließt eine Aspergillose nicht aus. Der kulturelle Nachweis ist zuverlässiger,
kann aber einige Tage in Anspruch nehmen. Generell ist für den mikroskopischen oder kulturellen
Nachweis Material aus Biopsie- oder Punktionsmaterial aus sterilen Körperregionen anzustreben. Bei der
Interpretation der Befunde von Sputumproben von nicht abwehrgeschwächten oder bei fehlender
klinischer Symptomatik kann die Abgrenzung einer Kolonisation von einer invasiven Infektion
problematisch sein. Aus Blut, Liquor und Knochenmark lassen sich Aspergillen nur selten isolieren. Der
Nachweis von Aspergillus aus der bronchoalveolären Lavage (BAL) ist zwar spezifisch, hat jedoch nur
eine geringe Sensitivität.
Serologische Tests zum Nachweis von Antikörpern finden Anwendung bei der allergischen pulmonalen
Aspergillose und beim Aspergillom. Ihre Wertigkeit in der Diagnostik der invasiven Aspergillose ist
unsicher. Aufgrund der fehlenden Immunantwort bei den meist erheblich abwehrgeschwächten Patienten
fallen die Tests in der Regel negativ aus und erweisen sich daher als wenig brauchbar. Durch Nachweis
zirkulierender Antigene konnte eine wesentliche Verbesserung der Frühdiagnostik erreicht werden,
obwohl die Sensitivität der momentan zur Verfügung stehenden Tests häufig nicht ausreichend ist.
Grundsätzlich basiert die Diagnostik der Schimmelpilze heute in der Medizinischen Mykologie und auch
der Hygiene auf kulturellen und mikroskopischen Methoden. Wesentliche Merkmale sind neben der
Koloniemorphologie insbesondere die charakteristischen Nebenfruchtformen der verschiedenen Spezies.
Die charakteristischen Nebenfruchtformen von Schimmelpilzen der Gattungen Absidia, Aspergillus,
Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis werden vorgestellt. Zusätzlich zu den
vorgelegten mikroskopischen Fertigpräparaten werden die zugehörigen Pilzkulturen als Demonstration
aufgestellt.
Aspergillus niger (Elektronenmikroskopie)
Aspergillus niger (Kultur)
57
Skizzen einiger Schimmelpilze:
Rhizopus
Alternaria
Aspergillus fumigatus
Penicillium
Cladosporium
Scopulariopsis
Geotrichum candidum
58
Herstellung mikroskopischer Präparate von luftmyzelbildenden Pilzen:
Die Nebenfruchtformen luftmyzelbildender Pilze sind berührungsempfindlich und daher gelingt die
Darstellung intakter Nebenfruchtformen im mikroskopischen Präparat häufig erst nach mehrfachem
Versuch!
Einfache Techniken zur Herstellung von Präparaten sind:
•
Objektträgerkultur (s. Abbildung)
•
Tesafilmpräparat
Objektträgerkultur
Durchführung:
Man schneidet mit einer Öse/Nadel aus einer Nährbodenplatte ca. 10x10 mm große Stücke und
legt diese auf sterile Objektträger. Anschließend beimpft man die seitlichen 4 Flächen des
Agarwürfels mit einer Pilzkultur und bedeckt die Würfeloberfläche mit einem Deckglas.
Die Objektträgerkulturen werden in einer feuchten Kammer bebrütet. Die Pilze wachsen von
den seitlichen Agarflächen auf die angrenzenden Glasoberflächen hinüber. Nach vorsichtigem
Abheben des Deckgläschens und des Würfels vom Objektträger kann man zwei Präparate mit
intakten Nebenfruchtformen erhalten. Während des Pilzwachstums lassen sich die verschiedenen
Stadien auch mikroskopisch verfolgen.
Da die Objektträgerkultur eine Beobachtungszeit von mehreren Tagen erfordert, müssen
die praktischen Übungen auf das Tesafilmpräparat beschränkt bleiben.
Tesafilmpräparat
Durchführung:
- Auf einen Objektträger wird 1 Tropfen Lactophenolblau gegeben.
- Ein ca. 6 cm langer Tesafilmstreifen (an beiden Enden anfassen) wird mit dem mittleren Teil auf
den Pilzrasen der unbekannten Pilzkultur auf Sabouraud-Agar geklebt.
- Dieser Tesafilmstreifen wird auf einen Objektträger geklebt, so dass die Pilzelemente in der
Farblösung zum Liegen kommen.
Mikroskopie: 10er - 40er Objektiv, ohne Öl! r –40er Objektiv, Öl !10er – 40er O ohne Öl !
59
Aufgabe:
Auseinandersetzung mit Schimmelpilzen
- Betrachtung von Fertigpräparaten verschiedener Schimmelpilz-Spezies
(Herstellung siehe oben „Objektträgerkultur“)
- Beschreibung und Skizzierung der unbekannten Schimmelpilzkultur
- Herstellen eines Tesafilm-Präparates, anschl. mikroskopieren und skizzieren
- Bestimmung der Gattung der unbekannten Schimmelpilzkultur
a) durch Vergleich mit den ausgestellten Schimmelpilzkulturen
b) durch Vergleich mit den Fertigpräparaten und den Skizzen der mikroskopischen Bilder im Skript
Mikroskopie: 10er – 40er Objektiv, ohne Öl!
Protokoll: Unbekannte Schimmelpilzkultur
Beschreibung der Kultur:
Skizze von der Kultur:
Skizze des Tesafilmpräparates:
Höhe des Mycels:
Kontur:
Pigment:
Oberfläche:
Sonstiges:
Identifizierung:
Bei der unbekannten Schimmelpizkultur handelt es sich um: ………………………………………………
60
Kursteil 10
•
•
•
Mykobakterien
Differenzialdiagnose I: Lungenerkrankungen
Differenzialdiagnose II: Sepsis
Mykobakterien
Allgemeines:
Mykobakterien sind gerade oder leicht gekrümmte, schlanke, unbewegliche Stäbchenbakterien.
Gemeinsames Merkmal dieser Bakterien ist die sog. Säurefestigkeit in der Ziehl-Neelsen-Färbung. Unter
dem Begriff "Tuberkulosebakterien" (Tb-Komplex) werden M. tuberculosis (einschließlich M. africanum)
und M. bovis (einschließlich BCG-Stämme) zusammengefasst. Alle anderen Mykobakterien werden als
"atypische Mykobakterien", "Nicht-Tuberkulose Mykobakterien" (NTM) oder Mycobacteria other than
tuberculosis" (MOTT) bezeichnet.
Pathogenität
Spezies
Immer
M. tuberculosis
M. africanum
M. bovis
M. leprae
M. avium intrazellulare Komplex
M. fortuitum
M. kansasii
M. marinum
M. scrofulaceum
M. xenopi
M. flavescens
M. gordonae
M. smegmatis
M. terrae
M. vaccae
Häufig
Selten
Krankheitsbild
Lungen- und extrapulmonale Tuberkulose
Tuberkulose hauptsächlich in Afrika
Lungen- und extrapulmonale Tuberkulose
Lepra
Lungen und extrapulmonale Infektionen
iatrogene Abszesse
Lungeninfektionen
Hautinfektionen (Aquarien, Schwimmbäder)
Lymphadenitiden
Lungeninfektionen
verschiedene Krankheitsbilder - jeweils nur in
Einzelfällen
bekannt
Nachweis von Mykobakterien
a) Mikroskopischer Nachweis von Mykobakterien
Mykobakterien sind "säurefest". Freie Mykolsäuren in der Zellwand gehen mit Karbolfuchsin (Fuchsin +
Phenol) eine Komplexbindung ein, die einer Entfärbung mit HCl-Alkohol standhält, während die nichtsäurefesten 'Bakterienarten dadurch entfärbt werden (Ziehl-Neelsen-Färbung bzw. Kinyoun-Färbung).
Man kann bei dieser Färbung nicht zwischen Tuberkulosebakterien und nicht-tuberkulösen
Mykobakterien unterscheiden. Deshalb lautet der mikrobiologische Befund nicht "Tuberkulosebakterien
nachweisbar", sondern "säurefeste Stäbchen nachweisbar".
Die mikroskopischen Präparate müssen sorgfältig durchgemustert werden, um auch geringe Keimzahlen
zu erkennen. Routinemäßig werden dazu 300 (!) einzelne Blickfelder untersucht. Die Befundmitteilung
erfolgt nach folgenden Kriterien:
Zahl von säurefesten
Stäbchen / Blickfeld
0 / 300 BF
1-2 / 300 BF
2-9 / 100 BF
1-9 /10 BF
1-9 / 1 BF
> 9 / 1 BF
Befund
säurefeste Stäbchen nicht nachgewiesen
 (verdächtig), neues Präparat anfertigen
+
++
++
+++
61
Kinyoun-Färbung
Durchführung:
1. Präparat hitzefixieren (ist bereits geschehen)
2. Karbol-Fuchsin-Lösung
→ 4 Minuten
3. Kurz mit Leitungswasser abspülen
4. entfärben mit Salzsäure-Alkohol
→ 3-5 Sekunden
4. Kurz mit Leitungswasser abspülen
5. Methylenblau (Gegenfärbung)
→ 30 Sekunden
6. waschen unter fließendem Leitungswasser
7. Trocknen zwischen Filterpapier
Mikroskopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
Ergebnis: Säurefeste Stäbchen rosa bis rot, sonstige Keime und Zellen blau
b) Kultureller Nachweis von Mykobakterien
Während schnell wachsende Bakterien (wie E. coli und S. aureus) sich in der Log-Phase etwa alle 20
Minuten teilen, läuft eine Zellteilung der Tuberkulosebakterien im Abstand von 18 - 20 Stunden ab.
Kulturen müssen deshalb über mehrere Wochen beobachtet werden.
Die meisten Materialien, wie z. B. Sputum oder Urin, enthalten schnellwachsende Begleitkeime. Sie
würden die meist sehr langsam wachsenden Mykobakterien überwuchern. Deshalb muss diese
Begleitflora außer bei primär sterilem Material, wie z. B. Liquor, abgetötet werden. Man nennt diesen
Vorgang Dekontamination. Dabei wird die erhöhte Widerstandsfähigkeit von Mykobakterien gegen
Säuren und Laugen ausgenutzt. Je nach Einwirkdauer und Mykobakterien Art werden jedoch dabei auch
Mykobakterien geschädigt.
Bewährte Vorbehandlungsmethoden benutzen z.B. N-Acetyl-L-Cystein-NaOH oder Natrium- LaurylsulfatNaOH. Dadurch wird z. B. auch zähes Sputum verflüssigt und eine Anreicherung von Mykobakterien
durch Zentrifugieren möglich.
Auf festen Nährböden sind charakteristische Kolonien frühestens nach 3 - 4 Wochen zu erkennen.
Agarnährböden (z. B. Middlebrook 7H10 Agar) haben nur geringe Pufferwirkung und inaktivieren toxische
Stoffe nur wenig. Eiernährböden haben dagegen eine gute Pufferkapazität (Löwenstein-Jensen-Medium
enthält Malachitgrün zur Unterdrückung von Begleitkeimen, Stonebrink-Medium enthält kein Glycerin, das
M. bovis hemmt).
In Flüssigmedien wachsen Mykobakterien meist schneller als auf festen Nährböden, sie werden jedoch
leichter von schnell wachsenden Begleitkeimen überwuchert und die Infektionsgefahr bei der
Verarbeitung im Labor ist wesentlich höher.
Middlebrook 7H12-Flüssigmedium ist daher zur Primärisolierung mit der Antibiotika-Mischung PANTA
(Polymyxin B, Amphotericin B, Trimethoprim und Azlocillin) supplementiert.
Die schnellste Kulturmethode mit einer durchschnittlichen Nachweiszeit von etwa 2 Wochen sind
automatisierte Flüssigmedien, die radiometrisch (14C) oder enzymatisch Wachstum nachweisen. Mit
diesen Kulturmethoden kann auch die Resistenz von Tuberkulosebakterien gegen Tuberkulostatika in ca.
einer weiteren Woche bestimmt werden. Dabei wird das Wachstum von Mykobakterien in Anwesenheit
unterschiedlicher Tuberkulostatika geprüft.
c) Der Tierversuch
Tierversuche mit Meerschweinchen sind in der Routinediagnostik entbehrlich geworden. Vor allem die
automatisierten Nachweissysteme sind mindestens gleich empfindlich, jedoch um Wochen schneller.
d) Molekularbiologische Nachweismethoden
Mykobakterien können mit Gensonden oder durch Mykobakterien-spezifische Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) nachgewiesen werden. Der direkte Nachweis aus Patientenmaterial ist zwar zurzeit nicht
sensitiver als eine Kultur, jedoch eindeutig schneller (2 - 3 Tage). Nachteilig sind die relativ hohen
Kosten.
62
Nachweisverfahren für Mykobacterium tuberkulosis
Keimzahl
Verfahren
Testdauer
Preis in €
105
Gensonde
2-3 h
50
104
Mikroskopie
1 Tag
10
102
Konventionelle Kultur
6-8 Wochen
30
Automatisierte Flüssigkultur
2-4 Wochen
50
2h
30
<102
101-2
PCR
Identifizierung von Mykobakterien
Die Identifizierung erfolgt aus der Kultur nach Morphologie und Stoffwechselleistungen!
Merkmal
M. tuberculosis
M. bovis
streuselartig (eugon)
glatt, flach (dysgon)
Niacin
+
-
Nitratreduktase
+
-
Kolonie auf Löwenstein-Jensen
Weitere Kriterien sind die Wachstumsgeschwindigkeit bei unterschiedlichen Temperaturen, Pigmentation
bei Licht und Dunkelheit u. a. Im Mittel dauert die herkömmliche Identifizierung nach positiver Kultur etwa
6 Wochen. Gensonden sind zur Identifizierung der Zugehörigkeit zum M. tuberculosis-Komplex und M.
avium intrazellulare Komplex erhältlich. Mit Gensonden ist eine Identifizierung am selben Tag mit sehr
hoher Spezifität möglich. Durch die Sequenzierung von Nukleinsäuren sind auch seltene und im Labor
nicht anzüchtbare Mykobakterien identifizierbar.
Resistenztestung von Mykobakterien
Bei Tuberkulose wird eine Kombinationstherapie durchgeführt. Die gebräuchlichsten Medikamente sind
Isoniazid (INH), Rifampicin (RMP), Pyrazinamid (PZA), Ethambutol (EMB) und Streptomycin (SM). Vor
allem bei nicht-tuberkulösen Mykobakterien sind Resistenzen sehr weit verbreitet. In letzter Zeit nehmen
jedoch auch die Resistenzen bei M. tuberculosis zu.
Die konventionelle Empfindlichkeitsaustestung erfolgt auf festen Nährböden mit unterschiedlichem Gehalt
von Tuberkulostatika und dauert etwa 4 Wochen. Ein Mykobakterien Stamm ist resistent, wenn er auf
diesem Nährboden trotz der entsprechenden Tuberkulostatika Konzentration wächst. Die
Resistenztestung von Tuberkulosebakterien wird heute zunehmend mit automatisierten Flüssigkulturen
durchgeführt, die Testdauer ist dabei wesentlich verkürzt (1 Woche).
Aufgabe:
Auf dem Arbeitsplatz liegt ein bereits hitzefixiertes Präparat von tuberkulösem Sputum
- Färben des Präparates nach Kinyoun.
- Durchmustern des gefärbten Präparates nach säurefesten Stäbchen.
- ggf. zählen der säurefesten Stäbchen (mind. 10 Blickfelder)
- Beurteilung des Untersuchungsergebnisses.
63
Protokoll:
Blickfeld
Zahl der säurefesten
Stäbchen/Blickfeld
Befund
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Summe
Durchschnitt / Gesichtfeld
Demonstrationsplatte von Haemophilus influenzae
Zur raschen Erkennung von Haemophilus influenzae kann das „Satellitenphänomen“ oder
„Ammenphänomen“ gegenüber S.aureus ausgenutzt werden, d.h. in der Umgebung von S. aureusKolonien wächst Haemophilus influenzae schneller und üppiger.
Nachweis von Haemophilus influenzae
Durchführung:
Eine Blutplatte wird mit Haemophilus influenzae ausgespatelt. Anschl. wird diese Platte mit einem
Querstrich S.aureus beimpft.
Platte 16-24h bei 37°C bebrüten
Auswertung:
Entlang dieser strichförmigen Kultur findet man schon nach 24 h feine Haemophilus-Kolonien
64
Differenzialdiagnose I: Lungenerkrankungen
Aufgabe:
Aus der laufenden Diagnostik der Mikrobiologie erhalten Sie 2 Präparate von eitrigen Bronchiallavagen,
Fall 1 und Fall 2.
Färben Sie die Präparate nach Gram
Sie sind jetzt der Mikrobiologe / die Mikrobiologin und müssen folgende Fragen beantworten:
1. Welches sind bakterielle Pneumonie-Erreger?
2. Welche Abwehrzellen sind zu erwarten?
3. Nach welcher Patienten-Konstellation lässt sich die Pneumonie einteilen?
4. Was müssen Sie den behandelnden Arzt / Ärztin fragen, um bei dem vorliegenden Präparat einen
Keimverdacht äußern zu können?
Differenzialdiagnose II: Sepsis
Aufgabe:
Aus der laufenden Diagnostik der Mikrobiologie erhalten Sie 2 Präparate aus Blutkulturen,
Fall 3 und Fall 4
Färben Sie die Präparate nach Gram.
Wichtig: Präparate aus der Blutkultur sind schwieriger zu beurteilen. Führen Sie die Färbung
sehr sorgfältig durch. Achten Sie besonders auf den Schritt „Entfärben mit 96%igem Alkohol“!
Beim Mikroskopieren in den (dünneren) Randbereichen des Präparats suchen!
Sie sind jetzt der Mikrobiologe / die Mikrobiologin und müssen folgende Fragen beantworten:
1. Welches sind bakterielle Sepsis-Erreger?
2. Welche Abwehrzellen sind zu erwarten?
3. Nach welcher Patienten-Konstellation lässt sich die Sepsis einteilen?
4. Was müssen Sie den behandelnden Arzt / Ärztin fragen, um bei dem vorliegenden Präparat einen
Keimverdacht äußern zu können?
65
Kursteil 11
•
•
Differentialdiagnose einiger mikrobiologischer Krankheitsbilder
Bilder mit Geschlechtserkrankungen
Die direkte mikroskopische Untersuchung (z.B. Grampräparat) erlaubt in vielen klinischen Situationen bei
Infektionserkrankungen schon eine Verdachtsdiagnose. In diesem Versuch sollen klinische Fälle
vorgestellt werden und anhand der Gramfärbung eines klinischen Materials bereits eine
Verdachtsdiagnose erstellt werden.
Aufgabe: (3er Gruppen pro Tisch)
Präparate sind bereits hitzefixiert!
- Färben der Präparate (Fall 1-7) nach Gram
- Mikroskopieren: 100er Objektiv, Ölimmersion
- Protokollieren: Morphologie, Gramverhalten, Lagerung der Bakterien
- Erstellen einer Verdachtsdiagnose
Mikrobiologische Notfälle:
Fall Nr. 1
20-jährige Frau; seit 36h septische Temperaturen.
Jetzt Erbrechen, Meningismus und Auftreten von Petechien.
Präparat von einer Kultur aus dem Liquor.
Fall Nr. 2
1-jähriges Kind mit vorerst Zeichen eines banalen Atemweginfektes.
Seit 24h rapide Verschlechterung, hohe Temperaturen (bis 41°C).
Präparat einer Kultur aus dem Liquor.
Weitere mikrobiologische Notfälle:
Fall Nr. 3
67-jähriger Patient; seit 48 h hohes Fieber (bis 40°C).
Thorax-Röntgen: Verschattung links mit Pleuraerguss bzw. Empyem links.
Präparat aus dem Pleuraerguss.
Fall Nr. 4
50-jähriger Patient mit infizierter Bagatellverletzung an der rechten Hand.
Jetzt (72h später) Rötung des gesamten rechten Arms, des Schulterbereichs mit Übergreifen auf die
rechte Thoraxwand. Alle Anzeichen deuten auf eine Sepsis hin, Patient wird intensivpflichtig.
Präparat von einem Gewebestückchen aus dem rechten Arm.
Fall Nr. 5
Patient nach Lebertransplantation im Stadium voller Immunsuppression (unter stationären Bedingungen).
Plötzliche Verschlechterung des Zustands es Patienten mit allen Zeichen einer Sepsis.
Präparat aus der Blutkultur.
Fall Nr. 6
Patient mit Schnittwunde am linken Arm, verursacht durch Gartenarbeit.
Vom Hausarzt wurde die Wunde primär versorgt (genäht), dann Zeichen der Wundinfektion.
6h später wird der Patient ins Klinikum aufgenommen, wo er kurze Zeit später intensivpflichtig wird.
Präparat von Gewebeteilchen des Wundrandes.
Fall Nr. 7
Patient klagt über plötzlich auftretende Heiserkeit und Doppelbilder.
Einigen Stunden vorher hat er den verdorbenen Inhalt einer Konservendose gegessen.
Präparat wurde von den Resten des Doseninhalts hergestellt.
66
Protokoll: Mikrobiologische Notfälle
Fallnummer
Gramverhalten
Morphologie
1
2
3
4
5
6
7
67
Lagerung
Verdachtsdiagnose
(welcher Keim?)
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Kategorie
Gesundheitswesen
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