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1
Aus der Klinik für Plastische und Handchirurgie
der Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. R. E. Horch
Transforming growth factor beta 1 induziert eine endogene
Expression von Interferon gamma
–
eine in-vitro Studie an kultivierten Fibroblasten aus
Dupuytren’schen Kontrakturen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Oke Akkermann
aus
Pegnitz
2
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Univ-Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
PD Dr. med. J. Kopp
Koreferent:
Univ-Prof. Dr. med. R. E. Horch
Tag der mündlichen Prüfung:
20. Juli 2011
3
gewidmet meinen lieben Eltern
4
1
Zusammenfassung.............................................................. 6
1.1
Zusammenfassung...............................................................................6
1.1.1 Hintergrund und Ziele .........................................................................6
1.1.2 Methoden............................................................................................7
1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen.........................................................7
1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen...........................................................7
1.2
Abstract.................................................................................................8
1.2.1 Aim......................................................................................................8
1.2.2 Methods ..............................................................................................8
1.2.3 Results................................................................................................9
1.2.4 Conclusion ..........................................................................................9
2
Einleitung ........................................................................... 10
3
Zielsetzung......................................................................... 12
4
Ergebnisse ......................................................................... 13
4.1
Material und Methoden ......................................................................13
4.1.1 Zellkultur ...........................................................................................13
4.1.1.1 Fibroblastenseparation- und -kultivierung aus Dupuytren’schen
Kontrakturen ......................................................................................... 13
4.1.1.2 Einfrieren von Fibroblasten ................................................................... 14
4.1.1.3 Auftauen von Fibroblasten .................................................................... 14
4.1.1.4 HEK293-Zellen...................................................................................... 15
4.1.1.5 Ethik-Kommission ................................................................................. 15
4.1.2
OP-Resektate von Dupuytren’schen Kontrakturen ...........................15
4.1.2.1 Herstellung von Paraffinschnitten ......................................................... 15
4.1.2.2 Immunhistochemie................................................................................ 16
4.1.3
8-Kammer-Chamber-Slides ..............................................................17
4.1.3.1 Immunhistochemie................................................................................ 17
4.1.3.2 Immunfluoreszenz................................................................................. 18
4.1.4
Histologische Analyse.......................................................................19
4.1.4.1 Immunhistochemie................................................................................ 19
4.1.4.2 Immunfluoreszenz................................................................................. 19
4.1.5
Western Blot .....................................................................................20
4.1.5.1
4.1.5.2
4.1.5.3
4.1.5.4
4.1.6
quantitative RT-PCR .........................................................................23
4.1.6.1
4.1.6.2
4.1.6.3
4.1.6.4
4.1.6.5
4.1.7
Protein-Isolation .................................................................................... 20
Gesamtproteinkonzentrationsbestimmung – BCA-Assay ..................... 21
Western Blot - Durchführung ................................................................ 21
Analyse der Ergebnisse ........................................................................ 23
RNA-Isolation........................................................................................ 24
RNA-Qualitäts und Quantitätsbestimmung ........................................... 25
Reverse Transkription........................................................................... 25
quantitative real-time-PCR.................................................................... 26
Analyse der Ergebnisse ........................................................................ 26
adSMAD7 .........................................................................................27
4.1.7.1 Konstruktion .......................................................................................... 27
4.1.7.2 Virusamplifikation.................................................................................. 27
4.1.7.3 Konzentrationsbestimmung .................................................................. 28
5
4.2
Ergebnisse..........................................................................................30
4.2.1 IFNG induziert über JAK1 und STAT1 eine zeitabhängige SMAD7Expression ........................................................................................30
4.2.2 IFNG ist in Fibroblasten und Myofibroblasten endogen exprimiert ...34
4.2.2.1 IFNG und JAK1 können immunhistochemisch in Paraffinschnitten
aus Dupuytren’schen Kontrakturen nachgewiesen werden.................. 34
4.2.2.2 Nachweis der de-novo Synthese von IFNG in DF und CF durch
Western Blot und real-time PCR........................................................... 35
4.2.2.3 In DF°II kann ohne weitere Stimulation eine gleichzeitige Expression
von ACTA2 und IFNG gezeigt werden.................................................. 36
4.2.3
SMAD7 inhibiert die Expression von IFNG und die davon
abhängige Signaltransduktion in DF und CF ....................................37
4.2.3.1 Überexpression von SMAD7 in DF durch Transfektion mit adSMAD7
hemmt IFNG und die davon abhängige Signaltransduktion in der
Immunhistologie.................................................................................... 38
4.2.3.2 Überexpression von SMAD7 in CF, DF°II und DF°III durch
Transfektion mit adSMAD7 hemmt IFNG und die davon abhängige
Signaltransduktion im Western-Blot...................................................... 40
4.2.3.3 Überexpression von SMAD7 in CF, DF°II und DF°III durch
Transfektion mit adSMAD7 senkt in der quantitativen real-time-PCR
die mRNA-Level von IFNG, JAK1 und STAT1 signifikant..................... 42
4.2.4
IFNG und TGFB1 führen zu einer endogenen Expression von
IFNG
und
induzieren
die
von
IFNG
abhängige
Signaltransduktionskette...................................................................43
4.2.4.1 Immunhistochemisch lässt sich nach Stimulation mit rekombinantem
TGFB1 eine erhöhte Expression von TGFBR1, ACTA2, IFNG, JAK1,
STAT1 und SMAD7 nachweisen .......................................................... 44
4.2.4.2 Stimulation mit rekombinantem IFNG und TGFB1 führt zu einer
erhöhten endogenen Expression von IFNG und induziert die davon
abhängige Signaltransduktion im Western Blot .................................... 48
5
Diskussion ......................................................................... 52
6
Literaturverzeichnis .......................................................... 57
7
Abkürzungsverzeichnis .................................................... 62
8
Vorveröffentlichungen ...................................................... 64
9
Anhang ............................................................................... 65
10
Danksagung ....................................................................... 67
11
Lebenslauf.......................................................................... 69
6
1 Zusammenfassung
1.1 Zusammenfassung
1.1.1 Hintergrund und Ziele
Interferone (IFNs) sind weit verbreitete Zytokine mit ausgeprägten antiviralen
und wachstumshemmenden Effekten. Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle
bei der Immunüberwachung von malignen Zellen. In vielen klinischen und invitro Studien kann gezeigt werden, dass Interferon gamma (IFNG), eine ausgesprochene antifibrotische Wirkung bei fibroproliferativen Erkrankungen hat.
Fibrose ist durch Transdifferenzierung von inaktiven Fibroblasten zu Myofibroblasten charakterisiert. Daraus resultiert eine Überexpression und Ablagerung von Extrazellulärmatrix. Dies führt im Weiteren zur Entstellung und Dysfunktion des befallenen Organs. Als spezifisches verantwortlichen Zytokin für
diese Umbauvorgänge kann Transforming-Growth-Factor beta 1 (TGFB1) identifiziert werden, indem es profibrotische Umbauprozesse auf molekularer Ebene
induziert. Die intrazelluläre Weiterleitung des TGFB1-Inputs geschieht durch
sog. SMAD-Proteine. Als Folge kann Gen-Transkription und Proteinexpression
beobachtet werden, die genauen Hintergründe sind dabei nur teilweise verstanden.
Morbus Dupuytren (DD) ist eine fibroproliferative Erkrankung der Hand, die zu
Deformation und funktioneller Einschränkung führt. DD dient in dieser Arbeit als
Fibrose-Modell, da DD den kompletten zeitlichen, histologischen und molekularbiologischen Ablauf einer fibroproliferativen Erkrankung zeigt und die entsprechenden Zytokine und Extrazellulärmatrix ausbildet.
Andere Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass IFNG zu einer Induktion von
SMAD7 führt und damit die TGFB1-Signaltransduktion hemmt. Diese Arbeit hat
das Ziel zu klären, ob IFNG möglicherweise endogen von Fibroblasten und Myofibroblasten exprimiert wird. Außerdem soll untersucht werden, ob, wenn IFNG
endogen exprimiert wird, IFNG von TGFB1 beeinflusst wird und damit auf einen
möglichen sog. „bidirektionalen cross-talk“ hinweisen könnte.
7
1.1.2 Methoden
In dieser Arbeit dienten Myofibroblasten aus Dupuytren’schen Knoten und
Strängen (DF) als Fibrosemodell. Kontrollfibroblasten (CF) werden aus Ringbändern der Hand gewonnen. DF und CF wurden entweder mit rekombinantem
IFNG oder rekombinantem TGFB1 stimuliert oder aber mit einem adenoviralem
Konstrukt, das zur Überexpression von SMAD7 führt, (adSMAD7) transfiziert.
Danach wurden die Zellen fixiert und weiter aufgearbeitet für Immunhistochemie, Immunfluoreszenz und molekularbiologische Untersuchungen.
1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Überraschenderweise zeigen DF und CF eine endogene Expression von IFNG.
Zell-Transfektion mit adSMAD7 führt zur Hemmung von IFNG und der nachgeschalteten Signaltransduktion, was auf einen neuen negativen feedbackMechanismus hinweist. Andererseits resultiert die Applikation von rekombinantem TGFB1 in einer Induktion von profibrotischen Proteinen und von SMAD7.
Interessanterweise induziert TGFB1 zusätzlich die Transkription von IFNG in
DF und CF. In der Folge wird die IFNG-Signaltransduktion, wahrscheinlich über
einen autokrinen oder parakrinen Mechanismus, induziert und führt in der Folge
zu erhöhten SMAD7-Leveln. Dies weist auf einen weiteren neuen negativen
feedback-Mechanismus der TGFB1-Signaltransduktion hin.
1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen neue Perspektiven bezüglich eines möglichen „bidirektionalen cross-talk“ und die damit verbundene Relevanz für das
Standard-Modell der Fibrose auf.
8
1.2 Abstract
1.2.1 Aim
Interferons (IFNs) are widely expressed cytokines with potent antiviral and
growth-inhibitory effects. These IFNs are the first line of defence against viral
infections and have important roles in immunosurveillance of malignant cells. In
many clinical trials and in-vitro-studies Interferon gamma (IFNG) has been reported as a possible agent to affect fibroproliferative diseases in an antifibrotic
manner.
Fibrosis is characterised by transdifferentiation of quiescent fibroblasts to myofibroblasts that results in overexpression and deposition of extracellular matrix
proteins that subsequently leads to organ impairment and dysfunction. Transforming growth factor beta 1 (TGFB1) has been identified as crucial cytokine in
many fibroproliferative disorders inducing profibrotic processes on the molecular
level. Since Smad proteins mediate TGFB1-dependant signals on the intracellular level, thus initiating RNA transcription and protein expression, molecular
mechanisms regulating these processes are poorly understood.
Dupuytren’s disease (DD) is a fibroproliferative disorder of the hand leading to
disfigurement and functional impairment of the hand. DD acts as model of fibrosis, since it displays the entire temporal and histological architecture of cells,
cytokines and extracellular matrix involved in fibroproliferative processes.
Since other groups have demonstrated that INFG leads to SMAD7 upregulation
and thereby blocking TGFB1 signaling this study addressed the question
whether endogenous expression of INFG is possible in fibroblasts and myofibroblasts and if IFNG is endogenously expressed whether it can be influenced
by TGFB1, thus indicating a bidirectional crosstalk of signaling pathways.
1.2.2 Methods
In our study myofibroblasts isolated from nodules and cords of Dupuytren’s disease (DF) serve as model of fibrosis. Control fibroblasts derived by normal tendon pulleys serve as control cells (CF). DF and CF are stimulated with either
recombinant IFNG or recombinant TGFB1 or transfected with an adenovirus
overexpressing SMAD7 (adSMAD7). Subsequent cells are fixed and used for
histological, immunohistochemical, immunofluorescence and molecular biological examinations.
9
1.2.3 Results
Surprisingly, DF and CF express endogenous levels of Interferon gamma
(IFNG). Cell infection with adSMAD7 leads to downregulation of IFNG and subsequent signaling, indicating a novel negative feedback mechanism of IFNG
signaling. On the other hand application of recombinant TGFB1 results in
upregulation of profibrotic proteins and subsequent elevated expression levels
of SMAD7. Surprisingly, TGFB1 additionally induces transcription of IFNG in
stimulated DF and CF. Consequently, IFNG signaling is presumably enhanced
by an autocrine mechanism leading to upregulation of SMAD7, thereby indicating a further new negative feedback mechanism of TGFB1 signaling.
1.2.4 Conclusion
Therefore, our results point to new perspectives concerning IFNG-TGFB1crosstalking and its possible relevance in a standard model of fibrosis.
10
2 Einleitung
Interferone sind weit verbreitete Zytokine mit ausgeprägter antiviraler und
wachstumshemmender Funktion. Diese Zytokine sind die erste Verteidigungslinie des Körpers gegen virale Infektionen und haben außerdem eine wichtige
Rolle bei der Überwachung des Immunsystems vor potentiellen malignen Zellen. Grundsätzlich werden die Interferone in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Interferon Typ 1 und Interferon Typ 237. Im Gegensatz zu den vielen verschiedenen
Untertypen der Typ 1 Interferone, gibt es bei den Typ 2 Interferonen nur ein
einziges, nämlich Interferon gamma (IFNG). Nach Bindung von IFNG an seinen
spezifischen zellmembranständigen zweiteiligen Rezeptor, assoziiert sich Janus-Kinase-1 (JAK1) und Janus-Kinase-2 (JAK2) an den inzwischen gekoppelten Rezeptor und legt nach Phosphorylierung eine Andock-Stelle für einen bestimmten Transkriptionsfaktor frei, den sog. „latent cytoplasmatic signal transducer and activator of transcription type 1“ (STAT1). Nachdem auch dieser zur
Aktivierung phosphoryliert wurde, verbinden sich zwei aktivierte STAT1, translozieren in den Zellkern und induzieren eine IFNG-abhängige Transkription von
IFNG-induzierbaren Genen über Bindung an so genannte IFNG-aktivierte Sequenzen (GAS)43.
In vielen klinischen Studien und in-vitro-Untersuchungen wird berichtet, dass
IFNG ein mögliches Target mit antifibrotischer Wirkung bei der Behandlung von
fibroproliferativen Erkrankungen sein könnte. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass
IFNG die Kollagensynthese in humanen Fibroblasten inhibieren kann22, oder
dass es die Galaktosaminoglykane, die von humanen Fibroblasten produziert
wurden, modulieren kann39, oder dass IFNG die Induktion der Transdifferenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten blockieren kann45.
Fibrose ist vor allem durch die Transdifferenzierung von inaktivierten
Fibroblasten in Myofibroblasten charakterisiert. Daraus resultiert eine Überexpression und Ablagerung von Extrazellulärmatrixproteinen, was in der Folge zu
Organentstellung und –dysfunktion führt1, 13, 15, 38, 40.
Auf molekularer Ebene werden profibrotische Änderungen und Regulationsmechanismen über bestimmte Zytokine aus der Familie des sog. „transforming
growth factor beta“ (TGFB) und im Falle von Fibroblasten vor allem über den
Typ 1 (TGFB1) reguliert und gesteuert. Intrazellulär werden nach Aktivierung
11
von einem spezifischen Rezeptor die Signale über die sog. SMAD-Proteine weitergeleitet. Es gibt rezeptor-assoziierte SMADs (R-SMAD), mediierende SMADs
(Co-SMAD) und inhibitorische SMADs (I-SMAD)32,
33
. Nach Aktivierung des
zweiteiligen TGFB1-Rezeptors (TGFBR1 und TGFBR2) durch TGFB1 werden
SMAD2 und SMAD3 phosphoryliert und formen daraufhin einen oligomeren
Komplex mit SMAD451. Dieser Komplex transloziert in den Zellkern und wirkt als
Transkriptionsfaktor für bestimmte Target-Gene19, z.B. Kollagen Typ 1
(COL1A1)5, Fibronektin (FN1)17, alpha-smooth-muscle-actin (ACTA2)9, plasminogen-activator-inhibitor 1 (PAI1)50 und SMAD720.
Morbus Dupuytren (DD) ist eine fibroproliferative Erkrankung der Hand. Sie ist
charakterisiert durch Bildung von Knoten und Strängen der Palmar- und FingerFaszie. Dies führt im Laufe der Erkrankung zur Entstellung und deutlichen
Funktionseinschränkung der Hand21, 46.
Kürzlich wurde gezeigt, dass DD ein geeignetes Modell für Fibrose und
fibroproliferative Erkrankungen darstellt. Der komplette histologische und zeitliche Ablauf der beteiligten Zellen, Zytokine und Extrazellulärmatrixproteine einer
fibroproliferativen Erkrankung wird im Laufe der Erkrankung abgebildet30. Außerdem ist die Behandlung häufig eine chirurgische mit Resektion der befallenen Faszienanteile, so dass die entsprechenden Gewebe für weitere Untersuchungen zur Verfügung stehen. Wie bei anderen fibroproliferativen Störungen
ist TGFB1 auf molekularer Ebene das entscheidende Zytokin in der Pathogenese des DD. Als Gegenspieler im Sinne eines negativen feedback-Mechanismus
fungiert hierbei I-SMAD SMAD74, das in Komplex tritt mit TGFBR1 und damit
die Phosphorylierung, d.h. die Aktivierung, von R-SMADs verhindert35.
Obwohl dieses Modell eine logische Erklärung für Beginn und Progress der
Symptome des fibroproliferativen Verlaufes des DD bietet, hat es noch keine
Erklärung dafür gefunden, dass bei einigen Patienten, die an DD leiden, ein
Stop der Erkrankung stadienunabhängig beobachtet werden kann. Man muss
davon ausgehen, dass nicht alle relevanten beteiligten Faktoren im Zusammenspiel der Fibrose ausreichend gewürdigt werden25.
So konnten einige Gruppen in der Vergangenheit zeigen, dass IFNG zu einer
Hochregulation von SMAD7 führt und damit zu einer Blockierung des SMADSignaltransduktion führt47.
12
3 Zielsetzung
Zunächst soll für das Fibrose-Modell des DD untersucht werden, ob auch bei
diesen Zellen IFNG die Signaltransduktion von TGFB1 beeinflusst.
Außerdem wird vermutet, dass IFNG als Zytokin nicht allein von Immunzellen
produziert wird und damit seine Wirkung auf Fibroblasten und Myofibroblasten
entwickelt, sondern dass es auch von Fibroblasten endogen exprimiert und damit parakrin oder autokrin einen Einfluss auf den Verlauf von fibroproliferativen
Umbauvorgängen
über
die
Beeinflussung
des
TGFB1-
Signaltransduktionsweges hat.
Dabei soll ein potentieller Einfluss von TGFB1 auf die endogene Expression
von IFNG im Sinne eines möglichen bidirektionalen cross-talks der beiden
Signaltransduktionswege untersucht werden.
Diese Hypothese soll in-vitro auf zellulärer und molekularbiologischer Ebene
untersucht werden.
13
4 Ergebnisse
4.1 Material und Methoden
4.1.1 Zellkultur
4.1.1.1 Fibroblastenseparation- und -kultivierung aus Dupuytren’schen Kontrakturen
Nach Resektion von Dupuytren’schen Strängen und Knoten bzw. nach Resektion von Kontrollgewebe aus Ringbändern unter sterilen Kautelen im Rahmen
von Operationen der Klinik für Plastische und Handchirurgie der Chirurgischen
Universitätsklinik Erlangen werden diese in feuchte Kompressen eingeschlagen, in einem sterilen Gefäß ins Zellkulturlabor verbracht und am gleichen Tag
weiterverarbeitet.
Im Labor wird das Gewebe unter dem Laminar Air Flow zunächst in Betaisodona-Lösung desinfiziert, nachfolgend in PBS (phosphate buffered saline, Biochrom, Berlin) dreimal gewaschen und kurz in vergälltem Ethanol inkubiert. Sodann wird das Gewebe von Haut- oder Fettgewebe befreit, in ca. 4mm durchmessende Stücke aufgeteilt und in einer 75 cm2-Zellkulturflasche (Greiner BioOne, Frickenhausen) gleichmäßig verteilt. Zunächst wird 4-5 ml Kulturmedium
dazugegeben um ein Austrocknen der Gewebestücke zu verhindern und
gleichzeitig ein besseres Anhaften auf dem Flaschenboden zu erreichen. Nach
90 Minuten wird vorsichtig 15ml Kulturmedium dazugegeben und die Kulturflasche wird in einem Zell-Inkubator in feuchter Atmosphäre bei 37°C und 5% CO2
inkubiert. Das Medium wird alle 2-5 Tage gewechselt, je nach Menge der Zellen
in der Flasche.
Als Zellkulturmedium wird eine Mischung aus Dulbecco’s MEM Medium (Biochrom)
mit
10%
FCS
(Fetal-calf-serum,
Biochrom)
und
1%
Penicil-
lin/Streptomycin (100 µg/ml, Biochrom) verwendet.
Diese Bedingungen sind ideal für Fibroblasten, andere Zelltypen wie zum Beispiel Keratinozyten benötigen andere Zellkulturbedingungen und gehen vor der
ersten Passagierung unter. Aus den Gewebestücken wachsen dann in den
14
nächsten 7-21 Tagen, je nach Proliferationsrate, Fibroblasten auf dem Flaschenboden aus.
Nach Erreichen einer Konfluenz von ca. 80% wird die Kultur passagiert. Dazu
wird das Medium entfernt, die am Boden anhaftenden Fibroblasten werden mit
PBS
gewaschen,
woraufhin
die
Zellen
mit
5ml
Trypsin/EDTA
(Trypsin/Ethyldiamintetraessigsäure, Biochrom) innerhalb von 10 Minuten vom
Boden der Flasche abgelöst werden. Nachdem in der lichtmikroskopischen
Kontrolle eine vollständige Zellsuspension erreicht ist, wird die Reaktion mit
10ml Medium gestoppt. Die Suspension wird in ein steriles Falcon-Gefäß (Greiner BioOne) umgefüllt und bei 3000 rpm (rounds-per-minute) für 8 Minuten abzentrifugiert (Zentrifuge Haereus, Hanau). Der Überstand wird verworfen, das
Pellet wird mit 10ml Medium resuspendiert. Die Zellkonzentration wird mit Hilfe
einer Neubauer Zählkammer ermittelt, so dass die Fibroblasten mit einer Minimalkonzentration von 1 x 106 / Zellkulturflasche erneut ausgesät werden. Für
die Versuche wurden Myofibroblasten aus Dupuytren’schen Kontrakturen des
zweiten (DF °II) und dritten Grades (DF °III) nach der Tubiana-Klassifikation46
sowie Kontrollfibroblasten aus Ringbändern der Hand (CF) je von der 2. bis 10.
Passage verwendet.
4.1.1.2 Einfrieren von Fibroblasten
Überschüssige Fibroblasten werden für weitere Versuche kryokonserviert. Wie
unter 4.1.1.1 beschrieben werden die Fibroblasten mit Hilfe von Trypsin/EDTA
vom Boden abgelöst und abzentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wird
das Zellpellet mit 2000 µl einer Mischung aus 20% DMSO (Dimethylsulfoxid,
Sigma-Aldrich, Steinheim) mit 80% FCS auf Eis resuspendiert. Diese Menge
wird in 4 Kryoröhrchen (Greiner BioOne) überführt. Die Kryoröhrchen werden
schrittweise mit einer Abkühlrate von 1°C/Minute auf -70°C eingefroren und am
Folgetag in flüssigen Stickstoff bei -195°C verbracht.
4.1.1.3 Auftauen von Fibroblasten
Tiefgefrorene Zellen der Fibroblasten-Zellbank werden aus dem Stickstofftank
herausgenommen, auf Eis ins Zellkulturlabor verbracht und in einem 37°C
warmen Wasserbad (Julabo, Seelbach, Deutschland) über kurze Zeit aufgetaut.
Nach Antauen des Zell-DMSO-FCS-Gemisches wird dieses vorsichtig mit 15ml
Medium vermischt und für 8 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Nach Verwer-
15
fen des Überstandes, wird das Pellet in gewohnter Weise in Medium resuspendiert und nach Zellzählung auf Zellkulturflaschen verteilt.
4.1.1.4 HEK293-Zellen
HEK293-Zellen (human embryonic kidney-cells, Invitrogen GmbH, Darmstadt,
Deutschland) werden zur Amplifikation von adenoviralen Konstrukten, z.B. von
adSMAD7, verwendet.
Nach Lieferung der Zellen in einem Kryoröhrchen werden die Zellen wie oben
beschrieben aufgetaut und die Kryomedium-Zellen-Suspension wird in ein mit
Zellkulturmedium gefülltes Falcon-Gefäß überführt. Das Medium von HEK293Zellen unterscheidet sich darin, dass das DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin,
5% FCS und 1 mM Natrium-Pyruvat (PAA, Pasching, Österreich) versetzt wird.
Nach 5 minütiger Zentrifugation bei 1000 rpm wird der Überstand verworfen,
das Pellet in 10ml Medium resuspendiert und in eine 75 cm2 Zellkulturflasche
überführt. Die HEK293-Zellen haften nur leicht am Flaschenboden an. Die Inkubation erfolgt unter gleichen Bedingungen im Zell-Inkubator bei hoher Luftfeuchtigkeit 37°C und 5% CO2, das Medium wird alle 2 Tage gewechselt.
Die Passagierung erfolgt wie unter 4.1.1.1 beschrieben, wobei zum Ablösen
Accutase (PAA, Pasching, Österreich) verwendet wird.
4.1.1.5 Ethik-Kommission
Alle Patienten haben vor Operation nach ausführlicher Aufklärung der Verwendung Ihrer OP-Resektate für Forschungszwecke schriftlich zugestimmt. Nach
Beendigung der Experimente werden die Zellen entsorgt. Es liegt außerdem ein
Votum des Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg zur Verwendung der primären Zellreihen vor.
4.1.2 OP-Resektate von Dupuytren’schen Kontrakturen
4.1.2.1 Herstellung von Paraffinschnitten
Einzelne komplette Knoten und Stränge aus Dupuytren’schen Kontrakturen
wurden intraoperativ direkt in Formalin inkubiert und freundlicherweise durch
das Pathologische Institut (Prof. Dr. med. A. Hartmann) des Universitätsklini-
16
kums Erlangen in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Objektträger gezogen.
4.1.2.2 Immunhistochemie
Bei der Immunhistochemie können intra- und extrazelluläre Signal- und Effektorproteine detektiert werden. Mit Antikörpern gegen entsprechende primäre
Antikörper (Antikörperliste im Anhang) erfolgt die immunhistochemische Aufarbeitung der Paraffin-eingebetteten Schnitte. Dafür werden die zu färbenden und
auf Objektträger aufgezogenen Schnitte zunächst über 3 x 4 Minuten in Xylol
und sodann über eine absteigende Alkoholreihe (2 x 2 min 100 % Isopropanol,
2 x 2 min 96 % Isopropanol, 1 x 2 min 70 % vergällter Ethanol) entparaffiniert
und anschließend kurz in destilliertem Wasser gewässert. Sodann erfolgt die
Blockierung der endogenen Peroxidase mit 3 % H2O2 für 20 min, gefolgt von
einem Enzym-Verdau mit Trypsin (0,2 g Trypsin/0,2 g CaCl2 in2 00 ml destilliertem Wasser, pH 7,8). Danach Waschen in Wasser, destilliertem Wasser und
TBS (tris-buffered saline bei pH 7,6, Carl Roth GmbH, Karlsruhe) für insgesamt
15 min. Zur Blockierung der unspezifischen Antigenreaktion wird 100 % FCS für
30 min auf die Objektträger in einer feuchten Kammer aufgetragen. Jetzt wird
der primäre Antikörper verdünnt in einer Antikörper–Verdünnungslösung (Dako,
Hamburg) aufpipettiert und über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4°C inkubiert. Am darauf folgenden Tag werden die Präparate zweimal für 2 min in TBS
gewaschen und mit einem spezifischen Sekundär-Antikörper (Antikörperliste
siehe Anhang), ebenfalls gelöst in Antikörper–Verdünnungslösung (Dako,
Hamburg), für 30 min auf den Schnitten bei Raumtemperatur in einer feuchten
Kammer inkubiert. Danach werden die Schnitte 2 x 2 min in TBS gewaschen
und sodann für 30 min mit Avidin HRP (1 µl Avidin [Vector Burlingame, USA
(A2004)] gelöst in 2 ml TBS) bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer
überschichtet. Nach erneutem Waschen für 2 x 2 min mit TBS wird nachfolgend, je nach Spezifität, für ca. 15 min DAB (Vector, Burligame, CA, USA) bei
Raumtemperatur in einer feuchten Kammer aufgebracht. Danach wird wieder 2
x 2 min mit TBS gewaschen und mit Mayers Hämalaun (Merck) für 1 Sekunde
zur Zellkernmarkierung gegengefärbt. Nach erneutem Waschen mit Wasser
und umgekehrt aufsteigender Alkoholreihe (siehe oben) erfolgt das Eindeckeln
der Schnitte mit Entellan (Merck). Zum Ausschluss unspezifischer Antikörper-
17
Bindungen werden immer entsprechende Negativ-Kontrollen ohne PrimärAntikörper gefärbt.
4.1.3 8-Kammer-Chamber-Slides
Zellen, die in Kapitel 4.1.1.1 genannter Weise aus Knoten und Strängen Dupuytren’scher Kontrakturen gewonnen wurden, werden für die Versuche in 8Kammer-Chamber-Slides (Nunc, Wiesbaden) zu je 5 x 103 inkubiert. Nach
Durchführung des Versuches wird für die Fixierung der Zellen das Medium zunächst entfernt. Die auf den Objektträgern aufgeklebten Kammern werden abgenommen, woraufhin die Objektträger mit den Zellen in 4°C kalten vergällten
Ethanol für 10 Minuten überführt werden. Sodann werden die Objektträger für
10 Minuten im Inkubator getrocknet. Daraufhin werden die nunmehr fixierten
und getrockneten Fibroblasten in Rahmen der Immunhistochemie bzw. –
fluoreszenz weiter bearbeitet.
4.1.3.1 Immunhistochemie
Die Objektträger werden zunächst 3 x 2 min in TBS rehydriert. Daraufhin wird
zur Blockierung der unspezifischen Antigenreaktion 100 % FCS für 30 min auf
die Objektträger in einer feuchten Kammer aufgetragen. Jetzt wird der primäre
Antikörper für die entsprechenden Ziel-Signal- bzw. Effektorproteine verdünnt in
der o.g. Antikörper–Verdünnungslösung aufpipettiert und über Nacht in einer
feuchten Kammer bei 4°C inkubiert. Am darauf folgenden Tag werden die Objektträger zweimal für 2 min in TBS gewaschen und mit einem spezifischen Sekundär-Antikörper (Antikörperliste siehe Anhang) ebenfalls gelöst in Antikörper–
Verdünnungslösung für 30 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer
inkubiert. Danach werden die Schnitte 2 x 2 min in TBS gewaschen und sodann
für 30 min mit StreptABComplex/HRP (9 µl StreptavidinA, 9 µl biotinylierte Peroxidase B [beides Dako] gelöst in 1 ml TBS) bei Raumtemperatur in einer
feuchten Kammer überschichtet. Nach erneutem Waschen für 2 x 2 min mit
TBS werden nachfolgend für ca. 15 min AEC + Substrat Chromogen (Ready to
use, Dako) aufgebracht in der feuchten Kammer. Danach wird wieder 2 x 2 min
mit TBS gewaschen und mit Mayers Hämalaun (Merck) für 1 Sekunde zur Zellkernmarkierung gegengefärbt. Nach erneutem Waschen mit Wasser und umgekehrt aufsteigender Alkoholreihe (siehe oben) erfolgt das Eindeckeln der
18
Schnitte mit Entellan (Merck). Zum Ausschluss unspezifischer AntikörperBindungen werden immer entsprechende Negativ-Kontrollen ohne PrimärAntikörper gefärbt.
4.1.3.2 Immunfluoreszenz
Die Objektträger werden zunächst 3 x 2 Minuten in PBS rehydriert. Daraufhin
wird zur Blockierung der unspezifischen Antigenreaktion 100 % DS (donkeyserum, Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK) für 30 Minuten auf die Objektträger in einer feuchten Kammer aufgetragen. Jetzt wird der erste primäre Antikörper für die entsprechenden Ziel-Signalproteine verdünnt in der o.g. Antikörper–Verdünnungslösung aufpipettiert und über Nacht in einer feuchten Kammer
bei 4°C inkubiert. Am folgenden Tag werden die Objektträger dreimal für 2 Minuten in TBS gewaschen und mit einem spezifischen multi-labeling SekundärAntikörper, (JacksonImmunoResearch, Suffolk, UK, siehe Antikörperliste im
Anhang) ebenfalls gelöst in Antikörper–Verdünnungslösung für 30 Minuten bei
Raumtemperatur in einer feuchten lichtundurchlässigen Kammer inkubiert. Alle
folgenden Schritte erfolgen in Dunkelheit. Die Objektträger werden für 3 x 2 Minuten in TBS gewaschen, mit 50% DS verdünnt mit Antikörperverdünnungslösung zur Blockierung der unspezifischen Antikörperreaktion erneut inkubiert
und dann über Nacht mit dem zweiten spezifischen Primärantikörper in einer
feuchten Kammer bei 4°C über Nacht überschichtet. Am Folgetag werden die
Objektträger dreimal für 2 Minuten in TBS gewaschen und mit dem zweiten,
spezifischen multi-labeling Sekundär-Antikörper (JacksonImmunoResearch,
UK) gelöst in Antikörper–Verdünnungslösung für 30 min bei Raumtemperatur in
einer feuchten Kammer inkubiert. Danach erfolgen zwei weitere Waschschritte,
ein erneuter Blockschritt mit 50% DS in Antikörperverdünnungslösung und das
Überschichten mit dem dritten spezifischen primären Antikörper über Nacht bei
4°C in einer feuchten lichtundurchlässigen Kammer. Am folgenden Tag werden
die Objektträger dreimal für 2 min in TBS gewaschen und mit dem dritten spezifischen multi-labeling Sekundär-Antikörper (JacksonImmunoResearch, UK),
gelöst in Antikörper–Verdünnungslösung, für 30 min bei Raumtemperatur in
einer feuchten Kammer inkubiert. Nachdem die Objektträger erneut 3x 2 Minuten in TBS gewaschen wurden, werden die Objektträger in DAPI (SigmaAldrich, Hamburg) zur Kernfärbung inkubiert. Daraufhin werden die Objektträger
erneut 3x 2 Minuten in TBS gewaschen und mit Moviol eingedeckelt.
19
4.1.4 Histologische Analyse
4.1.4.1 Immunhistochemie
Die immuhistochemischen Präparate wurden bei 40- und 100-facher Vergrößerung mikroskopiert, digital fotografiert (Leica, Deutschland) und qualitativ auf
morphologische Veränderungen in Bezug auf Volumen, Ausdehnung, Veränderung der Fibroblasten untersucht. Sodann wurde das Ausmaß und die Lokalisation des exprimierten TGFBR1 (Transforming growth factor beta receptor type
2), ACTA2 (alpha-smooth muscle actin), SMAD7, IFNG (Interferon gamma),
JAK1 (Janus-Kinase-1) und STAT1 (signal-transducer-and-transcription-factor1) in den verschiedenen Versuchsgruppen untersucht. Da in nahezu jeder Zelle
eine gewisse Menge des Zielproteins nachzuweisen ist und es daher keine negativen Zellen für die Zielproteine gibt, kann keine immunhistochemische Quantifizierung der Proteinexpression durchgeführt werden. Negativkontrollen ohne
Primärantikörper sind negativ. Die Versuche werden als triple aus 3 unterschiedlichen primären Zelllinien durchgeführt und 3 repräsentative Gesichtsfelder werden für jede Gruppe jeweils fotografiert.
4.1.4.2 Immunfluoreszenz
Die Sekundärantikörper für die Immunfluoreszenz sind gelabelt mit cy2®, cy3®
oder cy5®, so dass im Fluoreszenzmikroskop drei verschiedene Zielproteine
einer Zelle gleichzeitig untersucht werden können. Dafür wurden die Präparate
mit einem Axioplan 2 Mikroskop (Zeiss, Jena) unter 40facher und 63facher Vergrößerung untersucht und als Graustufen-Fotos digital fotografiert. Sodann wird
qualitativ das Ausmaß und die Lokalisation des exprimierten IFNG, JAK1,
STAT1 und SMAD7 untersucht. Zur besseren Übersicht und besseren Vergleichbarkeit des Verhältnisses der Zielproteine untereinander werden die
Graustufenfotos als multilayer-Foto mit Hilfe von Photoshop (Photoshop 9.0
CS2, Adobe Systems GmbH, München) digital übereinander gelegt. Dabei werden jeweils die gleichen Einstellungen verwendet um die Gewichtung zueinander nicht zu verändern und die Proteinexpression miteinander vergleichen zu
können. Die Versuche werden als triple durchgeführt mit unterschiedlichen pri-
20
mären Zelllinien und es werden je Gruppe 3 repräsentative Gesichtsfelder fotografiert.
4.1.5 Western Blot
Western Blot ist ein Verfahren zum qualitativen Nachweis von Proteinen. Im
zweiten Schritt können Proteinkonzentrationen bestimmt werden im Verhältnis
zu einem sog. house-keeping-Protein. Dies kommt in allen Zellen des Versuchaufbaus vor, wird gleich exprimiert und nicht durch den eigentlichen Versuch
beeinflusst.
Beim Western Blot werden zunächst alle Proteine einer gegebenen Zellmenge
aus einem Experiment isoliert, im zweiten Schritt durch eine Gelelektrophorese
nach Gewicht aufgetrennt, dann auf eine besser haltbare Membran vertikal
übertragen. Daraufhin werden die Zielproteine mit Antikörpern markiert und
können jetzt mit Hilfe von Chemolumineszenz fotografiert und gemessen werden. Wenn immer die gleiche Menge Gesamtprotein aufgetragen wird, ist jetzt
eine Konzentrationsbestimmung im Verhältnis zu einem wie oben beschriebenem house-keeping-Protein und vor allem im Vergleich zu anderen Versuchsproben möglich.
4.1.5.1 Protein-Isolation
Für verschiedene Fragestellungen sollen Proteinnachweis bzw. –konzentration
bestimmt werden. Zunächst werden für den Versuchsaufbau Fibroblasten auf
10cm-Petrischalen (Greiner BioOne) ausgesät. Nach Erreichen von 80% Konfluenz wird das Experiment durchgeführt. Nach Beendigung des Experimentes
wird das Zellkulturmedium entfernt und die Zellen 2x mit 4°C kaltem PBS gewaschen. Das PBS wird daraufhin entfernt und die Zellen werden mit 300µl RIPA
lysis Puffer (Fertiglösung von Santa Cruz Biotechnology [USA] versehen mit je
3 μl Protease-Inhibitor-Cocktail [Santa Cruz Biotechnology, USA], Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF, Santa Cruz Biotechnology, USA] und Orthovanadat [Santa Cruz Biotechnology, USA]) überschichtet und für 15 Minuten bei 4°C
inkubiert. Anschließend werden die Zellen mit einem Zellschaber (Greiner
BioOne) abgekratzt und diese Suspension wird in ein 1,5ml Eppendorf-Cup
überführt. Die folgenden Schritte erfolgen auf Eis. Die Suspension wird jetzt zur
Lyse zehnmal durch eine 25G-Kanüle gezogen. Jetzt wird die Zellsuspension in
21
den Eppendorf-Cups in ein mit Eiswasser gefülltes Ultraschallbad (Sonorex RK
102 M, Bandelin, Berlin) in einem Schwimmträger gebracht und hier für weitere
45 Minuten lysiert. Daraufhin werden die Lysate für 15 Minuten bei 13000 rpm
und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird in mehrere neue Eppendorf-Cups
aliquotiert, das Pellet wird verworfen.
4.1.5.2 Gesamtproteinkonzentrationsbestimmung – BCA-Assay
Zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration wird eine photometrische Methode, der BCA-Assay, verwendet. Dafür werden 3 µl des Lysats in RIPA Lysis
Buffer 1:10, 1:20 und 1:50 vorverdünnt. Pro well einer 96 Mikrotiter-Platte
(Greiner BioOne) werden 40 µl destilliertes Wasser vorgelegt. Danach werden
je 10µl einer Verdünnungsreihe eines BSA-Standards (Interchim, Montilucon,
Frankreich) jede doppelt bzw. die verdünnten Proben auch jeweils doppelt hinzugegeben. Anschließend werden je 200 µl Working Reagent – Mischung (BCA
Assay Reagent A: BCA Assay reagent B = 50:1, Pierce BCATM Protein Assay
Kit, Thermo-Fisher-Scientific Inc., USA) hinzupipettiert. Nachfolgend wird die
Platte 30 sec lang vorsichtig geschüttelt und sodann für 30 min im Wärmeschrank bei 37°C inkubiert. Nach 10-minütigem Abkühlen erfolgt die Messung
im Elisa-Reader bei λ = 562 nm. Über die definierten Proteinmengen des BSAStandards kann eine Kalibrierung erfolgen, die eine Konzentrationsbestimmung
in µg/µl ermöglicht.
4.1.5.3 Western Blot - Durchführung
Für die Western Blots werden jeweils 25µg Gesamtprotein pro Probe verwendet. Dazu kommen je 2,5 µl Reducing Agent (NuPAGE® Reducing Agent (10 x)
NP0009), 6 µl Sample Buffer 4 x (NuPAGE® LDS Sample Buffer (4 x) NP0008)
und die entsprechenden Menge destilliertes Wasser um eine Zielmenge von 30
µl pro Slot zu erreichen. Dann werden die Proben für 5 Minuten bei 95°C inaktiviert, anschließend für 5 Minuten auf Eis stehen gelassen und dann bei 13000
U/min für 5 Minuten abzentrifugiert.
Nun werden die Geltaschen (NuPAGE® 4-12 % Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10well
NP0301 Box bzw. NuPAGE® 3-8 % Tris-Acetate Gel 1,0 mm, 10 well EA0375
Box) mit 4°C kaltem Laufpuffer (NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer (20 x)
NP0001 bzw. NuPAGE® Tris Acetate SDS Running Buffer (20 x) LA0041) gespült, die Kammer (XCell SureLock Mini Cell CE mark EI0001) mit Laufpuffer
22
gefüllt und dann die Proben in die Geltaschen pipettiert. Ein Slot wird hierbei
nur mit Marker (SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard LC5925, MagicMark XP
Western Protein Standard LC5602) beladen. Jetzt wird eine konstante Spannung angelegt um die Proteine aufgrund ihrer Ladung durch das Gel zu ziehen.
Hierbei findet eine Auftrennung nach Größe statt. Die Proteinauftrennung findet
bei konstant 190V bzw. 140V gemäß der Anleitung von Invitrogen© statt.
Nach horizontaler Auftrennung nach Gewicht durch den Gellauf erfolgt die vertikale Übertragung mittels Blotting auf besser haltbare Membranen aus PVDF
(Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Deutschland).
Dafür werden Pads und Filterpapiere (Pierce Western Blotting Filter Paper
#88600) mit 4°C kaltem Transferpuffer (NuPAGE® Transfer Buffer (20x)
NP0006) durchfeuchtet, die PVDF-Membran kurz in Methanol 100 % geschwenkt und dann das Sandwich zum Blotten gemäß der Anleitung von Invitrogen© gebaut. Geblottet wird bei 30 V konstant für 90 Minuten, die Kammer
steht auch hierbei wieder auf Eis. Anschließend erfolgt das Blocken in 5 % Magermilchpulver (5g Magermilchpulver (MMP) gelöst in 100ml TBST [TBS-Puffer
versetzt mit 2 ml Tween]) für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rollmischer um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Anschließend
wird der Primär-Antikörper (Antikörpertabelle im Anhang) verdünnt in 5 %
MMP/TBST auf die Membran gegeben und über Nacht bei 4°C auf dem Rollmischer inkubiert. Am nächsten Tag wird der spezifische, gegen den jeweiligen
Primärantikörper gerichtete mit horseradish-peroxidase gelabelte SekundärAntikörper (Antikörpertabelle im Anhang) verdünnt in 5% MMP/TBST auf die
Membran gegeben und bei Raumtemperatur auf dem Rollmischer für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Membran dreimal mit TBST 1 % und einmal mit TBS 1 % für jeweils 5 Minuten gewaschen. Dann erfolgte die Messung
der Chemoluminiszenz in einem Lumi Imager (LAS-1000 Fuji Film, Düsseldorf)
unter Verwendung von ECL (3,5 ml Lsg A [200ml 0,1M Tris-Cl pH 8,6, 50 mg
Luminol (Sigma-Aldrich A4685) 4°C] + 2,2 µl 30 % H2O2 (4°C) + 35 µl Lsg B [11
mg para-Hydroxy-coumarinsäure (Sigma C9008), 10 ml DMSO, RT]). Die an
den Sekundär-Antikörper gebundene Horseradish-Peroxidase katalysiert die
Oxidation des in der ECL-Lösung enthaltenen Luminols, wobei Lichtenergie
freigesetzt wird, die als Chenolumineszenz im Lumi Imager als Langzeitfotografie gemessen werden kann.
23
Anschließend erfolgt das Strippen der Membranen zur Entfernung der vormals
aufgetragenen Antikörper um im Anschluss das house-keeping-Protein als Ladungskontrolle zur Verifizierung der gleichmäßig aufgetragenen Proteinkonzentrationen bzw. zur nachfolgenden Quantifizierung der Proben auf die Membranen zu geben. Nach dreimaligem Waschen für je 5 Minuten in TBST 1 % wird
die Strip-Lösung (1 % SDS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf die Membranen gegeben, im Anschluss werden die Membranen erneute dreimal für je 5
Minuten in TBST 1 % gewaschen. Mit Beginn des Blockens in 5 % MMP/TBST
bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf dem Rollmischer erfolgt das weitere
Procedere wie oben beschrieben.
4.1.5.4 Analyse der Ergebnisse
Im Lumi Imager werden Langzeit-Fotos aufgenommen, die als digitale Fotos
abgespeichert werden. Danach werden die Fotos mit Photoshop CS2 9.0 in
einem festgelegten Verfahren zur besseren optischen Vergleichbarkeit immer
gleich nachbearbeitet. Jetzt werden die zu untersuchenden Banden aus den
Fotos ausgeschnitten und entsprechend dem durchgeführten Experiment zusammengesetzt.
Zur Quantifizierung werden die Rohdaten mit Hilfe von GeneTools Syngene
(Synoptics, Cambridge, UK) ausgewertet. Dabei werden die zu untersuchenden
Banden markiert, die Hintergrundfärbung wird mathematisch entfernt und die
entsprechenden Grauwerte der Banden werden als Integral aus ihren Peaks
gemessen. Im nächsten Schritt werden die Proben gegen das in gleicher Weise
gemessene House-keeping-Protein normalisiert um Pipettierfehler auszugleichen. Jetzt können die Ergebnisse auf einen Standard 1-Punkt-kalibriert und
miteinander verglichen werden. Die graphische Aufarbeitung erfolgt mit GraphPad Prism 4.0.3 (GraphPad Software, San Diego, USA).
4.1.6 quantitative RT-PCR
Die polymerase-chain-Reaktion (PCR) ist ein Verfahren zur Vermehrung von
kleinen DNA-Stücken. Der Zweck der in dieser Arbeit durchgeführten PCRs
besteht darin, die in einem Zellverband vorhandene mRNA als Ausdruck der
Aktivierung eines Gens zu untersuchen. Da RNA nicht sehr stabil ist, wird diese
zunächst nach Separation auf Reinheit und Qualität getestet und dann in DNA
24
revers transkribiert. Es entsteht die sog. cDNA. Von allen RNAs, die in cDNA
umgeschrieben wurden, interessieren jetzt allerdings nur einige Zielgene. Diese
Zielgene werden in der PCR mit kurzen spezifischen Oligonukleotiden, sog.
Primern, markiert, so dass nur die Gene transkribiert werden, die von Interesse
sind. DNA kann mit bestimmten Fluoreszenzfarbstoffen, z.B. SYBR® Green,
markiert werden, die wiederum bei Anregung umso heller leuchten je mehr
Farbstoff an DNA gebunden ist, bzw. je mehr DNA vorhanden ist. Bei der realtime PCR erfolgt nach jedem Zyklus der PCR eine Fotodokumentation der angeregten Immunfluoreszenz, die abhängig von der initial vorhandenen cDNAMenge im Laufe der PCR-Zyklen eine immer größere Intensität aufweist. Damit
kann bei der quantitativen real-time PCR, die für diese Dissertation verwendet
wurde36, auf die ursprüngliche relative Menge eines Zielgens zurückgeschlossen werden. Zunächst muss noch zum sog. House-keeping-Gen normalisiert
werden. Beim House-keeping-Gen handelt es um ein Gen, das in allen Zellen
gleich exprimiert und nicht durch die Experimente beeinflusst wird. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten werden ähnliche Standards verwendet, wie sie
bereits in Publikationen gefordert werden3.
4.1.6.1 RNA-Isolation
Nach Beendigung eines Experimentes werden die zu untersuchenden Zellen
zunächst wie oben in 4.1.1.1 beschrieben mit Trypsin/EDTA in Suspension gebracht, dann abzentrifugiert. Der Überstand wird jetzt verworfen. Daraufhin wird
das
Pellet
mit
350µl
RLT-Puffer/Beta-Mercaptoethanol
(10µl
Beta-
Mercaptoethanol auf 1ml RLT-Puffer, Qiagen, Hilden) resuspendiert, in ein Eppendorf-Cup umgefüllt und daraufhin dreimal durch eine 25G-Kanüle gezogen
zur Zellmembranzerstörung. Daraufhin wird in die Lösung 350µl 70% unvergällter Ethanol gegeben. Die daraus entstehenden 700µl werden auf eine QiagenSäule gegeben (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Hilden) und für 15 Sekunden bei
13000 rpm abzentrifugiert. Das Eluat wird verworfen und auf die Säule wird jetzt
350µl RW1-Puffer (Qiagen, Hilden) gegeben. Jetzt wird wieder für 15 Sekunden
bei 13000 rpm zentrifugiert. Im nächsten Schritt erfolgt der Verdau der genomischen DNA, die ansonsten die Ergebnisse der nachfolgenden Schritte verfälschen würde. Dazu wird 80µl DNAse-Lösung (10µl DNAse-Stock-Lösung auf
70µl RDD-Puffer, Qiagen, Hilden) für 15 Minuten auf die Säule gegeben. Danach werden wieder 350µl RW1-Puffer auf die Säule gegeben und für 15 Se-
25
kunden bei 13000 rpm zentrifugiert. Als nächstes folgen 2 Waschschritte mit 2x
500µl RPE-Puffer (Qiagen, Hilden) und je 2x 15 Sekunden Zentrifugieren bei
13000 rpm. Jetzt ist die Aufreinigung der RNA abgeschlossen und die RNA wird
aus der Säule eluiert. Dazu wird 30 µl RNAse freies Wasser auf die Säule gegeben und die Säule wird für 2 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Im Eluat
befindet sich das konzentrierte RNA-Eluat der gesammelten Zellen. Dieses wird
aliquotiert, eine Probe von 3 µl wird abgenommen zur Qualitäts- und Quantitätsbestimmung, der Rest bei mindestens -70°C eingefroren.
4.1.6.2 RNA-Qualitäts und Quantitätsbestimmung
Die Qualitäts- und Quantitätsbestimmung der RNA erfolgt mittels des Agilent
RNA 6000 Nano Kit entsprechend der Bedienungsanleitung (RNA 6000 Nano
Kit, Agilent Technologies Inc., Waldbronn) in einem Agilent 2100 Bioanalyzer
(Agilent Technologies Inc., Waldbronn). Bei diesem Verfahren erhält man sowohl die RNA-Konzentration einer Probe als auch die Aussage, ob die RNA zu
irgendeinem Zeitpunkt in ihrer Integrität zerstört oder verunreinigt wurde.
4.1.6.3 Reverse Transkription
Für die weiteren Versuche wird die instabile RNA jetzt in cDNA revers transkribiert. Unter Verwendung des Omniscript RT Kits (Omniscript RT Kit, Qiagen,
Hilden) und dem dazugehörigen Protokoll von Qiagen und werden die RNAProben zunächst so mit RNAse freiem Wasser verdünnt, dass pro Probe maximal 2µg Gesamt-RNA vorhanden sind. Jetzt wird 1 µl Oligo-dT-Primer (Fermentas GmbH, St-Leon-Rot) hinzugegeben. Dieser Primer hat die Eigenschaft nur
mRNA zu markieren, so dass im Weiteren auch nur diese in cDNA umgeschireben wird. Die Mischung wird für 10 Minuten bei 70°C in einer PCR-Maschine
(GeneAmp 9700, Applied Biosystems, USA) inkubiert um Querverbindungen
der RNA aufzulösen. Danach werden die Proben wieder auf Eis gelagert. Jetzt
wird in jede Probe der Master-Mix der Reaktion bestehend aus RNAse-Inhibitor,
dNTP-Mix, Omniscript reverse Transcriptase und RT-Puffer (alles aus dem
Omniscript-RT-Kit, Qiagen) hinzugegeben, gevortext, abzentrifugiert und dann
in die PCR-Maschine gegeben für 60 Minuten bei 37°C. Danach wird die reverse Transcriptase bei 94°C denaturiert und die jetzt entstandene cDNA steht für
die nun folgenden realtime-PCRs zur Verfügung.
26
4.1.6.4 quantitative real-time-PCR
Für die realtime-PCRs wird ein vorgemischter Master-Mix der Firma ABgene®
verwendet (Absolute™ qPCR SYBR® GREEN Mixes, AB-1219/b, ABgene Limited. UK). Dieser Mix benötigt laut Protokoll von ABgene Primer in einer Konzentration von 5 µM, die übrigen Komponenten sind in diesem Kit vorhanden.
Als Primer werden die entsprechend vorverdünnten QuantiTect Primer (QuantiTect Primer Assays, Qiagen, Hilden) verwendet. Die Messung wird in einem iQ
iCycler Real-Time PCR-Detection System (BioRad Laboratories GmbH, München) in einer 96-well Platte (ABgene, UK) durchgeführt. Für alle Untersuchungen dieser Arbeit wird das gleiche PCR-Programm verwendet:
1x
15 Minuten 94°C
30 Sekunden 94°C
42x
30 Sekunden 60°C
30 Sekunden 72°C
1x
60 Sekunden 94°C
1x
80x in 0,5°C Schritten
ansteigend ab 55°C –
„melt-curve“
1x
∞ 4°C
Abbildung 1
Nach Beendigung des Programms wird das Ergebnis vom Cycler-Gerät als Datei abgespeichert und kann entsprechend weiter ausgewertet werden.
4.1.6.5 Analyse der Ergebnisse
Die Analyse von real-time PCRs umfasst grundsätzlich mehrere Schritte. Im
ersten Schritt muss evaluiert werden, ob in der PCR in den verschiedenen wells
einer Untersuchung sinnvolle Ergebnisse erzeugt werden. Dazu wird zunächst
mit Hilfe der sog. melt-curve festgestellt, ob nur ein PCR-Produkt pro well synthetisiert wird und ob alle PCR-Produkte eines Primer-Paares den gleichen
Schmelzpunkt haben. Da grundsätzlich in allen Versuchen die cDNA als Ver-
27
dünnungsreihe (z.B. 1:1, 1:10 und 1:100) in die Reaktion gegeben wird, kann
nachvollzogen werden ob eine optimale Verdünnung für dieses Experiment vorliegt und die Transkription optimal gearbeitet hat. Außerdem wird jede Probe
pro Experiment als Triplet angelegt. Die daraus resultierenden Ergebnis-Kurven
sollten nahezu deckungsgleich sein. Sind alle Vorbedingungen erfüllt, kann im
zweiten Schritt die Konzentration einer mRNA im Verhältnis zu anderen Proben
normalisiert zu einem house-keeping-gen über mathematische Systeme36 ermittelt werden. Hier wird die ΔΔCT-Methode verwendet.
4.1.7 adSMAD7
Adenoviren können die Basis für nützliche Vektor-Expressions-Systeme sein,
da ihre Genomgröße (35kb) das Einsetzten von großen DNA-Fragmenten erlaubt41. Nach Kopplung von Smad7 an einen adenoviralen Vektor wird dieses
Konstrukt in die Fibroblasten eingebracht und somit eine artifizielle Überexpression von Smad7 erzeugt.
4.1.7.1 Konstruktion
Die für die Versuche erforderlichen Adenoviren wurden freundlicherweise von
der Arbeitsgruppe Prof. Dr. rer. nat. Steven Dooley, Leiter der Sektion Molekulare Alkoholforschung in der Gastroenterologie der II. Medizinische Klinik, der
Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg zur Verfügung
gestellt.
4.1.7.2 Virusamplifikation
Entsprechend dem Protokoll von Clontech/Takara zur Virusamplifikation werden
in zwei 175cm2 Zellkulturflaschen (Greiner BioOne) kultivierte HEK-Zellen bei
80% Konfluenz mit DMEM, 0,5% FCS und Penicillin/Streptomycin in üblicher
Konzentration über 12 Stunden inkubiert, um dann mit Adenovirus-StockLösung infiziert zu werden. Nach ca. drei Tagen Inkubation und Zugabe von 25
ml D 0,5+ tritt der gewünschte zytopathische Effekt52 ein, d.h. die infizierten Zellen werden kugelig und lösen sich vom Flaschenboden ab. Dies gilt als Hinweis,
dass sie komplett mit Virus gefüllt ist.
Zur Adenovirus-Gewinnung werden die Zellen in 50 ml Falcons überführt und
durch dreimaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem 37°C
28
Wasserbad lysiert. Nach dem Zentrifugieren für 5 Minuten bei 2000 rpm wird
der Überstand abpipettiert und das Pellet verworfen.
Um ein Viruskonzentrat zu erzeugen wird das AdenoX Virus Purification Kit
(Clontech-Takara, Saint-Germain-en-Laye, Frankreich) verwendet. Es besteht
aus mehreren Konzentrationsschritten. Zunächst wird das HEK-Zellen-VirusLysat durch einen 0,45 Mikron-Filter filtriert um Zellrückstände aus der Suspension zu eleminieren.
Danach werden in einem 2. Schritt die sich im Vorfiltrat befindlichen Viren auf
den mitgelieferten Virus-Filter des Kits geladen. Zur Vorbereitung des VirusFilters wird zunächst 25 ml steriles PBS in eine 50 ml Spritze aufgezogen und
langsam ohne Luftbläschen durch den Filter gespritzt. Anschließend wird das
mit Dilution Buffer verdünnte Vorfiltrat zur Aufladung des Virus langsam durch
den Filter gedrückt. Es folgt ein Waschvorgang mit dem kompletten 1x Wash
Buffer (12 ml 5x Wash Buffer + 48 ml H2O, Clontech-Takara)
Zur Virus-Eluation d.h. zur Auslösung der Viren aus dem Filter, wird eine 5 ml
Spritze mit 3 ml Elution Buffer befüllt und 1 ml Elution Buffer in den Filter gespritzt. Das Eluat wird in einem 15 ml Falcon aufgefangen. Nach 5 Minuten Inkubation wird der Rest des Virus mit dem Rest des Elution Buffers und zum
Schluss der Rest des Elution Buffers mit Luft aus dem Filter gedrückt. Das Virus-Konzentrat kann nun aliquotiert und bei - 80°C eingefroren werden.
4.1.7.3 Konzentrationsbestimmung
Um standardisierte Virusmengen in den Experimenten verabreichen zu können
wird zur Konzentrationsbestimmung des Viruskonzentrates das AdenoTM Rapid
Titer Kit (Clontech-Takara, Saint-Germain-en-Laye, Frankreich) verwendet.
Über eine immunhistochemische Färbung von Adenovirus-Hexon-Anteilen,
standardisierte Verdünnungen des Konzentrates und standardisierte Zellmengen kann mit Hilfe einer vorgegebenen statistischen Auswertung ein Rückschluss auf die ursprüngliche Konzentration der aktiven Viren im Eluat gezogen
werden.
Gemäß der Anleitung wird eine 12-well-Platte (Greiner BioOne) zur Zellinfektion
mit je 1 ml HEK-Zellen (= 50000 Zellen /ml) in oben beschriebenem Medium
vorbereitet und eine Verdünnungsreihe der Virus-Lösung in PBS oder Medium
von 10-2 bis 10-7 angesetzt. Tropfenweise wird dann 100 µl von verdünnter Viruslösung in jedes Well gegeben und die Platte für 48 h bei 37°C im Brut-
29
schrank inkubiert. Anschließend wird das Medium vorsichtig abgesaugt und die
Zellen ca. 5 min trocknen gelassen.
Die Fixierung der Zellen erfolgt mit jeweils 1 ml -20°C 100%kaltem Methanol.
Nach Inkubation der Platte für 10 Minuten bei -20°C erfolgt ein dreimaliger
Waschvorgang mit je 1 ml PBS + 1 % BSA. Dann wird 0,5 ml eines gegen das
Hexon-Protein des Adenovirus gerichtete Primärantikörpers (Mouse-anti-Hexon
[1:1000 in PBS/1 % BSA] ClonTech-Takara) pro well pipettiert und für 1 h bei
37°C inkubiert. Nach drei weiteren Waschvorgängen mit PBS/1 % BSA wird 0,5
ml des entsprechenden horseradish-peroxidase-gelabelten Sekundärantikörpers (Rat-anti-Mouse HRP [1:500 in PBS/ 1 % BSA] Clontech-Takara) pro well
zugegeben und für 1h bei 37°C inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit PBS/ 1 % BSA und der Zugabe von je 500 µl
DAB working solution (Verdünnen des 10x DAB-Substrates 1:10 in 1x Stable
Peroxidase Buffer, Clontech-Takara) zum Anfärben erfolgt die Inkubation bei
Raumtemperatur für 10 min.
Dann wird je 1 ml PBS in die wells pipettiert zum leichteren Mikroskopieren mit
einem Zellmikroskop. Für die Quantifizierung werden mindestens 3 Gesichtsfelder unter Verwendung eines 20x Objektivs digital fotografiert. Braune/Schwarze
(= positive) Zellen werden ausgezählt, um ein Hochrechnen entsprechen dem
statistischen System von Clontech-Takara in infektiöse Einheiten pro µl (ifu/µl)
zu ermöglichen.
30
4.2 Ergebnisse
4.2.1 IFNG induziert über JAK1 und STAT1 eine zeitabhängige SMAD7Expression
Um zu zeigen, dass das Fibrosemodell des DD, wie in der Literatur beschrieben, nach Stimulation mit IFNG zu einer Exprimierung von SMAD7 führt, wird
ein Versuchsaufbau mit 8-Kammer-Chamber-Slides verwendet. Dafür werden
zunächst DF °II ausgesät. Nach Erreichen von ca. 80% Konfluenz der Zellen,
werden diese durch Reduktion des FCS im Medium auf 0,5% für 12 Stunden
gehungert und damit synchronisiert. Daraufhin werden alle Zellen mit 1000 U/ml
IFNG stimuliert. Im Folgenden werden zu festgelegten Zeitpunkten in je 2
Kammern das Medium entfernt und die Zellen mit 100% 4°C kaltem Ethanol
fixiert. Die Zeitpunkte sind nach 30, 60, 90, 120, 150 und 180 Minuten. Nach
180 Minuten wird das Experiment beendet.
Daraufhin werden die Kammern der Chamberslides entfernt und die fixierten
Zellen werden in der in Kapitel 4.1.3.2 beschriebenen Weise mit primären Antikörpern für JAK1, STAT1 und SMAD7 sowie mit entsprechenden sekundären
multi-labeling Antikörpern, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gegen cy2®, cy3®,
bzw. cy5® markiert sind, inkubiert. Der Versuch wird zweimal wiederholt an Zellen anderer Patienten. Da die Ergebnisse nahezu vollständig übereinstimmen,
werden im Folgenden nur Färbungen eines Patienten gezeigt.
In der Fluoreszenzmikroskopie ist 30 Minuten nach IFNG-Stimulation eine geringe Expression von JAK1 nachweisbar. Ein signifikanter Nachweis von STAT1
und SMAD7 ist nicht zu zeigen. Die Färbung ist über das Zytoplasma verteilt,
eine Färbung in den Kernen zeigt sich nicht.
31
JAK1
+ Kernfärbung
Stimulation mit
1000 U/ml IFNG
30 Minuten nach
Stimulation
STAT1
+ Kernfärbung
SMAD7
+ Kernfärbung
Abbildung 2:
Immunfluoreszenzfärbung von DF °II als Dreifachfärbung von JAK1 (gelb), STAT1
(grün), SMAD7 (rot) und DAPI als Kernfärbung. Repräsentative Fotos werden mit einer
63fachen Vergrößerung aufgezeichnet. Die kleineren Fotos links zeigen die Proteine einzeln mit Kernfärbung, im großen Foto sind die Fotos überlagert arrangiert. 30 Minuten nach
Beginn des Experimentes ist ein geringer Nachweis von JAK1 möglich; STAT1 und SMAD7
sind nicht nachweisbar.
Nach 60 Minuten ist JAK1 maximal exprimiert. Zu diesem Zeitpunkt ist JAK1 vor
allem im Bereich des Zytoplamas nachweisbar. Weiterhin kann keine relevante
Expression von STAT1 oder SMAD7 gezeigt werden.
JAK1
+ Kernfärbung
Stimulation mit
1000 U/ml IFNG
60 Minuten nach
Stimulation
STAT1
+ Kernfärbung
SMAD7
+ Kernfärbung
Abbildung 3:
Immunfluoreszenzfärbung von DF °II als Dreifachfärbung von JAK1 (gelb), STAT1
(grün), SMAD7 (rot) und DAPI als Kernfärbung. Repräsentative Fotos werden mit einer
63fachen Vergrößerung aufgezeichnet. Die kleineren Fotos links zeigen die Proteine einzeln mit Kernfärbung, im großen Foto sind die Fotos überlagert arrangiert. 60 Minuten nach
Beginn des Experimentes ist JAK1 maximal exprimiert; STAT1 und SMAD7 sind weiterhin
nicht nachweisbar.
90 Minuten nach Stimulation kann ein Anstieg der STAT1-Exprimierung nachgewiesen werden, der sich vor allem auf die Zellmembran konzentriert. Die
JAK1-Exprimierung ist etwas schwächer und zeigt sich jetzt vermehrt in Kernnähe. Später fällt die Konzentration von JAK1 auf ein geringeres Level ab, ist
32
allerdings bis zum Endes des Experimentes weiterhin deutlich nachweisbar. Die
SMAD7-Expression hat noch keinen nennenswerten Level erreicht.
JAK1
+ Kernfärbung
Stimulation mit
1000 U/ml IFNG
90 Minuten nach
Stimulation
STAT1
+ Kernfärbung
SMAD7
+ Kernfärbung
Abbildung 4
Immunfluoreszenzfärbung von DF °II als Dreifachfärbung von JAK1 (gelb), STAT1
(grün), SMAD7 (rot) und DAPI als Kernfärbung. Repräsentative Fotos werden mit einer
63fachen Vergrößerung aufgezeichnet. Die kleineren Fotos links zeigen die Proteine einzeln mit Kernfärbung, im großen Foto sind die Fotos überlagert arrangiert. Zu diesem Zeitpunkt kann ein Anstieg der STAT1-Exprimierung nachgewiesen werden, der sich vor allem
auf die Zellmembran konzentriert. Die JAK1-Exprimierung ist etwas schwächer und zeigt
sich vermehrt im Kern. SMAD7 hat noch keinen nennenswerten Level erreicht.
120 Minuten nach Stimulation ist das Maximum der STAT1-Expression erreicht,
wobei es zunehmend in Kernnähe nachzuweisen ist. Die JAK1-Expression ist
inzwischen deutlich geringer und nun vor allem im Kern darstellbar. Außerdem
ist SMAD7 zu diesem Zeitpunkt das erste Mal deutlich exprimiert.
JAK1
+ Kernfärbung
Stimulation mit
1000 U/ml IFNG
120 Minuten nach
Stimulation
STAT1
+ Kernfärbung
SMAD7
+ Kernfärbung
Abbildung 5
Immunfluoreszenzfärbung von DF °II als Dreifachfärbung von JAK1 (gelb), STAT1
(grün), SMAD7 (rot) und DAPI als Kernfärbung. Repräsentative Fotos werden mit einer
63fachen Vergrößerung aufgezeichnet. Die kleineren Fotos links zeigen die Proteine einzeln mit Kernfärbung, im großen Foto sind die Fotos überlagert arrangiert. 120 Minuten
nach Stimulation ist ein Maximum der STAT1-Expression erreicht, wobei es zunehmend in
Kernnähe nachzuweisen ist. JAK1 ist inzwischen deutlich geringer und vor allem im Kern
nachweisbar. Außerdem ist SMAD7 zu diesem Zeitpunkt das erste Mal deutlich exprimiert.
33
Nach 150 Minuten ist der SMAD7-Nachweis maximal mit einer deutlichen Färbung des gesamten Zytoplasmas. STAT1 zeigt sich weiterhin vor allem in
Kernnähe, JAK1 ist in seiner Expression unverändert im Vergleich zu den vorherigen Messzeitpunkten.
JAK1
+ Kernfärbung
Stimulation mit
1000 U/ml IFNG
150 Minuten nach
Stimulation
STAT1
+ Kernfärbung
SMAD7
+ Kernfärbung
Abbildung 6
Immunfluoreszenzfärbung von DF °II als Dreifachfärbung von JAK1 (gelb), STAT1
(grün), SMAD7 (rot) und DAPI als Kernfärbung. Repräsentative Fotos werden mit einer
63fachen Vergrößerung aufgezeichnet. Die kleineren Fotos links zeigen die Proteine einzeln mit Kernfärbung, im großen Foto sind die Fotos überlagert arrangiert. Nach 150 Minuten ist der SMAD7-Nachweis maximal mit einer deutlichen Färbung des gesamten Zytoplasmas. STAT1 ist vor allem in Kernnähe nachweisbar, JAK1 ist in seiner Expression unverändert im Vergleich zum letzten Zeitpunkt.
Nach 180 Minuten zum Ende des Experimentes haben sich die Verhältnisse der
Expression nur wenig verändert: SMAD7 ist weiterhin maximal exprimiert, JAK1
und STAT1 sind aktiviert, allerdings nicht mehr maximal.
Damit ist auch in Myofibroblasen aus Dupuytren’schen Kontrakturen nach Stimulation mit IFNG über eine entsprechende intrazelluläre Signaltransduktion
durch JAK1 und STAT1 eine Expression des I-SMAD SMAD7 nachzuweisen,
das
wiederum
als
Signaltransduktion wirkt.
negativer
Feedback-Mechanismus
der
TFGB1-
34
4.2.2 IFNG ist in Fibroblasten und Myofibroblasten endogen exprimiert
4.2.2.1 IFNG und JAK1 können immunhistochemisch in Paraffinschnitten aus
Dupuytren’schen Kontrakturen nachgewiesen werden.
Um zu zeigen, dass IFNG in Myofibroblasten in-vivo nachweisbar ist, werden
Paraffinschnitte aus Dupuytren’schen Kontrakturen, die Operationsresektaten
entstammen, immunhistochemisch gegen IFNG gefärbt. Um eine Wirkung von
IFNG auf diese Zellen zu untersuchen wird außerdem eine Färbung auf JAK1
durchgeführt (Abbildung 7). Es zeigt sich nach Färbung und Auszählung von 3
repräsentativen Gesichtsfeldern von 3 Paraffinschnitten von insgesamt 5 verschiedenen Patienten, dass 95% der ausgezählten Zellen einen positiven
IFNG- und auch JAK1-Nachweis haben. Bei immunhistochemischer Färbung
von Paraffinschnitten aus Ringbändern auf IFNG und JAK1 ist kein Nachweis
von IFNG oder JAK1 möglich.
DF °III
10x
40x
100x
IFNG
JAK1
Abbildung 7
Immunhistochemische Färbung von Paraffinschnitten aus Dupuytren’schen Kontrakturen auf IFNG und JAK1. Repräsentative Fotos werden mit 10x, 40x und 100x Vergrößerung wie beschriftet aufgezeichnet. Die kleinen inlay-Fotos sind Negativkontrollen ohne primären Antikörper. IFNG und JAK1 ist in allen Vergrößerungen nachweisbar. Bei der 100x
Vergrößerung lässt sich erkennen, dass nicht alle Zellen positiv sind. Bei systematischer
Auszählung von 3 Gesichtsfeldern pro Schnitt sind 95% positiv.
35
4.2.2.2 Nachweis der de-novo Synthese von IFNG in DF und CF durch Western Blot und real-time PCR
Bei intraoperativer Resektion eines kompletten Dupuytren-Knotens ist davon
auszugehen, dass im Resektat auch andere Zellen, wie zum Beispiel
Makrophagen, vorhanden sind, die unter anderem auch IFNG exprimieren können. Allerdings erscheint auch eine Eigensynthese mit parakriner Wirkung in
den Fibroblasten und Myofibroblasten möglich. Um die de-novo-Synthese
nachzuweisen, wird folgender in-vitro-Versuchsaufbau gewählt.
Es wird mit reinen Zellkulturen aus DF °II, DF °III und CF gearbeitet. Nach Erreichen von 80% Konfluenz werden die Zellen durch Reduktion von FCS auf
0,5% für 48 Stunden gehungert und damit synchronisiert. Daraufhin wurde das
Gesamtprotein und die mRNA in bereits beschriebener Weise gewonnen. Jetzt
werden Western Blots (Abbildung 8)
und quantitative real-time-PCRs
(Abbildung 9) zum Nachweis von IFNG durchgeführt. Überraschenderweise
kann jetzt auch mit diesen sensitiveren Methoden IFNG in CF ohne weitere
Stimulation nachgewiesen werden. Bei der quantitativen Auswertung der Western Blots ist die IFNG-Expression in unstimulierten DF °II höher und in DF °III
signifikant höher als die Expression in CF.
CF
DF°II
DF°III
IFNG
TUBA1A
IFNγ/TUBA1A (%)
100
75
*
50
25
0
CF
DF°II
DF°III
Abbildung 8
Repräsentativer Western Blot von unstimulierten CF, DF °II und DF °III mit Nachweis
von IFNG. In der unteren Grafik ist eine quantitative Auswertung von 4 individuellen
Experimenten gezeigt. Als house-keeping-Protein, das zur Normalisierung dient, wird
TUB1A1 (alpha-Tubulin) verwendet. Bei der Auswertung zeigt sich nach Normalisierung,
dass in den Lysaten aus Myofibroblasten (DF°II 46,6 rel. Grauwert, DF°III 56,1 rel. Grauwert) mehr IFNG vorhanden ist als in den Lysaten aus Kontrollfibroblasten (33,5 rel. Grauwert). Der Unterschied zwischen CF und DF°III ist signifikant. Zur statistischen Auswertungen wurde das „One-Way-ANOVA“-Testverfahren mit anschließenden Bonferroni-PostTests verwendet. Dabei gelten folgende Signifikanzniveaus: ***: p<0,001, **: p<0,01, *:
p≤0,05, ns: p>0,05
36
Auch bei der Auswertung der real-time PCR zeigt sich eine höhere Expression
von IFNG in den Dupuytren’schen Fibroblasten. Die mRNA-Level sind bei DF°II
signifikant um 5,9fach (p<0,01) bzw. bei den DF °III um 3,8fach (p<0.05) erhöht
im Verhältnis zum mRNA-Level der CF. Die de-novo Synthese von IFNG in Dupuytren’schen Fibroblasten und Kontrollfibroblasten ist in der Zellkultur damit
bewiesen. Außerdem zeigt sich eine signifikant höhere IFNG-Expression in Myofibroblasten im Vergleich zu Kontrollfibroblasten.
100
*
mRNA IFNG
80
**
60
40
20
0
CF
DF °II
DF °III
Abbildung 9
quantitative Auswertung von 4 individuellen Experimenten mit Nachweis von IFNGmRNA durch real-time PCR in CF, DF°II und DF°III. Als Hauskeeping-Gen dient ACTB
(beta-Aktin). Es zeigt sich eine IFNG-Eigensynsthese von Fibroblasten und Myofibroblasten. Diese ist bei den Kontrollfibroblasten deutlich geringer als bei den Dupuytren’schen Fibroblasten. In DF°II ist 5,9x mehr IFNG-mRNA vorhanden (p<0.01) im Vergleich zu CF. In DF°III ist 3,8x mehr IFNG-mRNA vorhanden (p<0,05) im Vergleich zu CF.
Zur statistischen Auswertungen wird das „One-Way-ANOVA“-Testverfahren mit anschließenden Bonferroni-Post-Tests verwendet. Dabei gelten folgende Signifikanzniveaus: ***:
p<0,001, **: p<0,01, *: p≤0,05, ns: p>0,05
4.2.2.3 In DF°II kann ohne weitere Stimulation eine gleichzeitige Expression
von ACTA2 und IFNG gezeigt werden
Die für diese Arbeit verwendeten Fibroblasten haben sich in ihrer Genexpression nicht verändert. Dies soll nachgewiesen werden, indem für DF°II gezeigt
wird, dass diese weiterhin die für sie nachgewiesenermaßen üblichen Proteine
(z.B. ACTA2) und gleichzeitig IFNG exprimieren.
Dafür werden DF°II in Chamberslides ausgesät. Nach Erreichen von 80% Konfluenz wird das FCS im Medium für 48 Stunden auf 0,5% reduziert um die Zellen zu hungern und zu synchronisieren. Danach erfolgt die Fixierung der Zellen
mit 100% 4°C kaltem Ethanol.
37
Im Anschluss werden die Zellen mit primären Antikörpern gegen IFNG und ACTA2
markiert.
Als
Sekundärantikörper
dienen
multi-labeling-Sekundär-
antikörper, die mit cy3® oder cy5® gekoppelt sind.
Jetzt werden die Zellen im Immunfluoreszenzmikroskop auf eine gleichzeitige
Expression von IFNG und von ACTA2 untersucht, die für die untersuchten
Fibroblasten nachgewiesen wird.
DF°Il
ACTA2
IFNG
„Overlay“
Abbildung 10
Immunfluoreszenzfärbung von DF°II als Zweifachfärbung von ACTA2 (grün), IFNG
(rot) und DAPI als Kernfärbung. Repräsentative Fotos werden mit einer 63fachen Vergrößerung aufgezeichnet. Das linke Foto zeigt eine Färbung ACTA2 mit Kernfärbung, das
mittlere IFNG mit Kernfärbung, das rechte Foto ist übereinander gelagert arrangiert. In den
gehungerten Zellen zeigt sich eine typische strangförmig angeordnete ACTA2-Färbung mit
geringer Kernbeteiligung, IFNG ist im Zytoplasma disseminiert vorhanden ohne wesentliche
Kernbeteiligung.
4.2.3 SMAD7 inhibiert die Expression von IFNG und die davon abhängige
Signaltransduktion in DF und CF
Nach Nachweis der endogenen Expression von IFNG in DF und CF interessieren im nächsten Schritt die davon abhängigen Folgen. IFNG führt zu einer Induktion von SMAD747. Jetzt ist zu untersuchen, inwieweit eine SMAD7Überexpression die davon abhängige TGFB1-Signaltransduktion beeinflusst
und ob umgekehrt eine Wirkung auf die IFNG-Signaltransduktion vorhanden ist.
SMAD7 gehört zur Gruppe der I-SMADs. Es wird durch TGFB1 induziert und
wirkt inhibitorisch auf die TGFB1-Signaltransduktion und ist damit Teil eines
negativen feedback-Mechanismus32,
47
. Um die Wirkung der Induktion von
SMAD7 auf die IFNG-Signaltransduktion zu untersuchen werden CF, DF°II und
DF°III mit adSMAD7, einem Typ5-Adenovirus transfiziert. Die Transfektion mit
38
adSMAD7 führt zu einer Überexpression von SMAD7 in den Zellen unabhängig
von TGFB124.
4.2.3.1 Überexpression von SMAD7 in DF durch Transfektion mit adSMAD7
hemmt IFNG und die davon abhängige Signaltransduktion in der Immunhistologie
Zunächst sollen DF°II und DF°III in Chamberslides untersucht werden. Nach
Aussähen und Erreichen von 80% Konfluenz werden die Zellen für 24 Stunden
durch Reduktion von FCS auf 0,5% gehungert und synchronisiert. Jetzt werden
50% der Zellen mit adSMAD7 transfiziert und für 12 Stunden inkubiert. Danach
werden alle Zellen nach Entfernung des Mediums durch 4°C 100% Ethanol fixiert.
Jetzt werden die Zellen mit Antikörpern gegen IFNG, JAK1 und STAT1 markiert
und immunhistochemisch gefärbt. Mayers-Hämalaun dient als Kernfärbung.
Sowohl bei DF°II als auch bei DF°III zeigt sich eine deutliche Reduktion von
IFNG (Abbildung 11). JAK1 ist bei DF°II und DF°III weiterhin vorhanden, wenn
auch geringer ausgeprägt (Abbildung 12). STAT1 ist bei den mit adSMAD7
transfizierten Zellen in der Immunfluoreszenz kaum noch nachzuweisen
(Abbildung 13).
IFNG
adSmad7
–
+
DF °II
DF °III
Abbildung 11
Immunhistochemische Färbung von DF°II und DF°III auf IFNG. 50% der Zellen werden
mit adSMAD7 transfiziert. Alle Zellen werden nach 12 Stunden fixiert. Repräsentative
Fotos werden groß mit 100x-Vergrößerung gezeigt. Die kleinen inlay-Fotos zeigen eine
40x-Vergrößerung. IFNG ist bei den nicht transfizierten Zellen im gesamten Zytoplasma und
Kern nachweisbar, nach Transfektion mit adSMAD7 ist eine deutliche Reduktion sichtbar.
IFNG kann bei den transfizierten Zellen vor allem intranukleär bzw. extrazellulär nachgewiesen werden.
39
JAK1
adSmad7
–
+
DF °II
DF °III
Abbildung 12
Immunhistochemische Färbung von DF°II und DF°III auf JAK1. 50% der Zellen werden
mit adSMAD7 transfiziert. Alle Zellen werden nach 12 Stunden fixiert. Repräsentative
Fotos werden groß mit 100x-Vergrößerung gezeigt. Die kleinen inlay-Fotos zeigen eine
40x-Vergrößerung. JAK1 ist bei den nicht transfizierten Zellen im gesamten Zytoplasma und
Kern nachweisbar, nach Transfektion mit adSMAD7 ist nur eine geringe Reduktion sichtbar.
JAK1 kann bei allen Zellen intranukleär bzw. im Zytoplasma nachgewiesen werden.
STAT1
adSmad7
–
+
DF °II
DF °III
Abbildung 13
Immunhistochemische Färbung von DF°II und DF°III auf STAT1. 50% der Zellen werden mit adSMAD7 transfiziert. Alle Zellen werden nach 12 Stunden fixiert. Repräsentative Fotos werden groß mit 100x-Vergrößerung gezeigt. Die kleinen inlay-Fotos zeigen eine
40x-Vergrößerung. STAT1 ist bei den nicht transfizierten Zellen im gesamten Zytoplasma
und Kern nachweisbar, nach Transfektion mit adSMAD7 ist nur eine geringe Reduktion
sichtbar. STAT1 kann bei allen Zellen intranukleär bzw. im Zytoplasma nachgewiesen werden.
40
4.2.3.2 Überexpression von SMAD7 in CF, DF°II und DF°III durch Transfektion
mit adSMAD7 hemmt IFNG und die davon abhängige Signaltransduktion im Western-Blot
Zunächst werden CF, DF°II und DF°III ausgesät. Nach Erreichen von 80% Konfluenz werden die Zellen durch Reduktion des Mediums auf 0,5% FCS gehungert und synchronisiert. Jetzt werden 50% der ausgesäten Zellen mit adSMAD7
transfiziert. Nach 12 Stunden wird das Medium entfernt und das Gesamtprotein
wird in beschriebener Weise gewonnen. Nach Durchführung von Western Blots
wird jetzt die Proteinexpression von IFNG, pJAK1, pSTAT1 und SMAD7 untersucht.
Überraschenderweise zeigt IFNG in der quantitativen Analyse bei allen Zellen
einen Abfall, bei DF°II und DF°III war dieser signifikant (p<0,001). Bei Testung
auf SMAD7 kommt es erwartungsgemäß zu einem signifikanten Anstieg bei
allen mit adSMAD7 transfizierten Zellen (p<0,001).
Bei der Untersuchung der Signaltransduktionskette des IFNG werden Antikörper verwendet, die nur die aktivierte phosphorylierte Form von JAK1 (pJAK1)
oder STAT1 (pSTAT1) detektieren, um eine Verfälschung der Ergebnisse zu
vermeiden.
Es zeigt sich bei den mit adSMAD7 transfizierten CF (p<0,001) und DF°II
(p<0,001) ein signifikanter Abfall von pJAK1. Bei DF°III ist kein signifikanter Unterschied nachweisbar. Bei der Untersuchung für pSTAT1 zeigt sich bei allen
mit adSMAD7 transfizierten CF, DF°II und DF°III ein signifikanter Abfall (jeweils
p<0,001).
41
CF
DF°II
DF°III
CF
DF°II
DF°III
-
-
-
+
+
+
adSmad7
IFNG
pJAK1
pSTAT1
SMAD7
TUBA1A
IFNG
SM AD7
300
***
[
100
[
50
25
0
CF
0
CF
unstimuliert
+ adSmad7
***
[
CF
pJak1/TUBA1A (%)
pSTAT1/TUBA1A (%)
DF°II DF°III
75
50
25
0
***
[
0
[
50
***
***
[
100
DF°II DF°III
pSTAT1
100
[
***
***
100
DF°II DF°III
pJAK1
150
200
[
***
Smad7/TUBA1A (%)
***
75
[
IFNG/TUBA1A (%)
[
***
CF
DF°II DF°III
Abbildung 14
Repräsentative Western Blots von CF, DF°II und DFIII, die zu 50% mit adSMAD7 transfiziert werden, mit Nachweis von IFNG, SMAD7, pJAK1 und pSTAT1. In der unteren
Grafik ist eine quantitative Auswertung von 4 individuellen Experimenten gezeigt. Als
house-keeping-Protein, das zur Normalisierung dient, wird TUB1A1 (alpha-Tubulin) verwendet. Bei der Auswertung zeigt sich nach Normalisierung, dass in den transfizierten Lysaten aus Myofibroblasten (DF°II 42,9 rel. Grauwert, DF°III 68,1 rel. Grauwert) signifikant
mehr IFNG vorhanden ist als in den Lysaten aus nicht transfizierten Myofibroblasten (DF°II
20,7 rel. Grauwert, DF°III 14,2 rel. Grauwert), Bei den CF ist der Unterschied zwischen
transfiziert und nicht-transfiziert nicht signifikant (37,3 rel. Grauwert zu 33,7 rel. Grauwert).
Bei der Testung auf SMAD7 zeigen die transfizierten CF, DF°II und DF°III signifikant höhere
Werte (CF 55,0 rel. Grauwert zu 196,3 rel. Grauwert; DF°II 94,3 rel. Grauwert zu 239,9 rel.
Grauwert; DF°III 39,0 rel. Grauwert zu 268,8 rel. Grauwert). Für das pJAK1 kann ein signifikanter Abfall für CF (35,6 rel. Grauwert zu 5,0 rel. Grauwert) und DF°II (119,4 rel. Grauwert
zu 73,6 rel. Grauwert) nachgewiesen werden. Der Abfall von pJAK1 ist bei den DF°III nicht
signifikant (19,5 rel. Grauwert zu 16,6 rel. Grauwert). Zur statistischen Auswertungen wird
das „Two-Way-ANOVA“-Testverfahren mit anschließenden Bonferroni-Post-Tests verwendet. Dabei gelten folgende Signifikanzniveaus: ***: p<0,001, **: p<0,01, *: p≤0,05, ns:
p>0,05
42
4.2.3.3 Überexpression von SMAD7 in CF, DF°II und DF°III durch Transfektion
mit adSMAD7 senkt in der quantitativen real-time-PCR die mRNA-Level
von IFNG, JAK1 und STAT1 signifikant
Es wird der gleiche Versuchsaufbau wie in 4.2.3.2 gewählt. Nach 12 Stunden
Inkubation mit adSMAD7 werden die Zellen lysiert und die mRNA wird in der in
oben beschriebener Weise gewonnen und in cDNA transkribiert.
In der quantitativen real-time PCR können erwartungsgemäß bei den mit
adSMAD7 transfizierten Zellen (CF, DF°II und DF°III) deutlich überexprimierte
SMAD7-mRNA-Level nachgewiesen werden (jeweils p<0,001).
Außerdem ist überraschenderweise die mRNA für IFNG, ähnlich wie in den
Western-Blot-Untersuchungen zuvor, bei allen transfizierten Zellen signifikant
erniedrigt (CF p<0,05, DF°II und DF°III p<0,001). Auch bei der IFNGabhängigen Signaltransduktion kann dieses Phänomen im Sinne von signifikant
erniedrigten JAK1-mRNA-Leveln (CF p<0,001, DF°II p<0,001, DF°III p<0,05)
und zum Teil signifikant erniedrigten STAT1-mRNA-Leveln (CF p<0,001, DF°II
nicht signifikant, DF°III p<0,001) gezeigt werden. Dies könnte darauf hinweisen,
dass über den bekannten IFNG-TGFB1-cross-talk nicht nur auf die TGFB1Signaltransduktion Einfluss genommen wird, sondern dass dieser ebenso umgekehrt zu funktionieren scheint. In der Literatur werden verschiedene Proteine
beschrieben, die den sog. IFNG-TGFB1-crosstalkt vermitteln könnten. Unter
anderem wird das Ypsilon-box-bindende-Protein (YBX1) genannt. Diesem wird
ein großer Teil der antifibrotischen Wirkung von IFNG zugeschrieben10.
In mit adSMAD7 transfizierten Fibroblasten sind die mRNA-Level für CF und
DF°II signifikant (p<0,001) erniedrigt. Bei DF°III ist der Unterschied nicht signifikant (Abbildung 15).
Somit ist davon auszugehen, dass das Zusammenspiel zwischen IFNG und
TGFB1 nicht einer Einbahnstraße gleicht, in der allein IFNG eine antifibrotische
Wirkung auf die TGFB1-Signaltransduktion entwickelt. Es erscheint zumindest
möglich, dass TGFB1 in umgekehrter Weise IFNG und die davon abhängige
Signaltransduktionskette beeinflusst.
43
IFNG
JAK1
80
150
STAT1
700
[
*
500
200
150
***
***
[
***
600
[
50
[
*
[
20
100
mRNA STAT1
[
***
40
mRNA JAK1
***
60
[
mRNA IFNG
[
***
100
50
0
0
CF
DF°II
DF°III
CF
DF°II
0
DF°III
CF
YBX1
***
***
unstimuliert
+ adSmad7
150
100
50
mRNA SMAD7
1000
***
[
mRNA YBX1
***
[
200
SMAD7
1500
[
[
***
DF°III
[
250
DF°II
500
5.0
2.5
0.0
0
CF
DF°II
DF°III
CF
DF°II
DF°III
Abbildung 15
Quantitative Auswertung von 4 individuellen Experimenten von CF, DF°II und DF°III,
die zu 50% mit adSMAD7 transfiziert werden; Nachweis von IFNG-mRNA, SMAD7mRNA, JAK1-mRNA, STAT1-mRNA und YBX1-mRNA durch real-time PCR. Als housekeeping-Gen dient ACTB. Es zeigt sich erwartungsgemäß eine signifikante SMAD7Überexpression in den mit adSMAD7-transfizierten Zellen (CF 664fach mehr, DF°II 910fach
mehr und DF°III 962fach mehr als in den unstimulierten Zellen, jeweils p<0,001). Außerdem
zeigt sich eine signifikante Reduktion von IFNG in den transfizierten Zellen (CF 22,5fach
geringer p<0,05, DF°II 34,4fach geringer p<0,001 und DF°III 9,3fach geringer p<0,001 als in
nicht transfizierten Zellen). Die davon abhängige Signaltransduktion zeigt ebenso verminderte mRNA-Level für JAK1 (CF 2,1fach geringer p<0.001, DF°II 3,9fach geringer p<0,001,
DF°III 1,5fach geringer p<0,05) und auch für STAT1 (CF 1,47fach geringer p<0,001, DF°II
1,1fach geringer p>0,05, DF°III 1,6fach geringer p<0,001). Bei der Untersuchung auf YBX1
zeigen sich ebenso eine geringere mRNA-Level bei den mit adSMAD7 transfizierten Zellen
(CF 2,8fach geringer p<0,001, DF°II 3,7fach geringer p<0,001, DF°III 1,64fach geringer
p>0,05. Zur statistischen Auswertungen wird das „Two-Way-ANOVA“-Testverfahren mit anschließenden Bonferroni-Post-Tests verwendet. Dabei gelten folgende Signifikanzniveaus:
***: p<0,001, **: p<0,01, *: p≤0,05, ns: p>0,05
4.2.4 IFNG und TGFB1 führen zu einer endogenen Expression von IFNG
und induzieren die von IFNG abhängige Signaltransduktionskette
Es wird vermutet, dass TGFB1 einen IFNG-induzierenden Effekt hat. Dies
müsste in einer Aktivierung bzw. Phosphorylierung der IFNG-abhängigen
Signaltransduktion, bestehend aus JAK1, STAT1, YBX1 und SMAD7, resultieren. Dies wird im Folgenden näher untersucht.
44
4.2.4.1 Immunhistochemisch lässt sich nach Stimulation mit rekombinantem
TGFB1 eine erhöhte Expression von TGFBR1, ACTA2, IFNG, JAK1,
STAT1 und SMAD7 nachweisen
Es werden DF°II und DF°III auf Chamberslides ausgesät. Nach Erreichen von
80% Konfluenz werden die Zellen durch Reduktion von FCS auf 0,5% gehungert bzw. synchronisiert. Nach 12 Stunden werden 50% der Zellen mit rekombinantem TGFB1 in einer Konzentration von 5ng/ml stimuliert und für 24 Stunden
inkubiert. Danach wird das Medium entfernt und die Zellen durch 4°C 100%
Ethanol fixiert. Danach werden die Zellen in schon beschriebener Weise immunhistochemisch gefärbt.
Wie erwartet werden durch eine Stimulation mit TGFB1 sowohl der Typ1Rezeptor als auch ACTA2 als typisches Effektor-Protein des TGFB1 induziert
(Abbildung 16). Auch SMAD7 wird durch Stimulation mit TGFB1 erwartungsgemäß induziert. Überraschenderweise lässt sich ebenso eine induzierende
Wirkung von rekombinantem TGFB1 auf die IFNG-Expression in Myofibroblasten nachweisen (Abbildung 17). Diese lässt sich auch für die davon
abhängige Signaltransduktion (JAK1 und STAT1) zeigen (Abbildung 18).
45
TGFBR1
ACTA2
+ TGFB1
DF °II
unstimuliert
+ TGFB1
DF °III
unstimuliert
Abbildung 16
Immunhistochemische Färbung von DF°II und DF°III auf TGFBR1 und ACTA2. 50%
der Zellen werden mit rekombinantem TGFB1 mit einer Zielkonzentration von 5ng/ml
im Medium stimuliert. Alle Zellen werden nach 24 Stunden Stimulationszeit fixiert.
Repräsentative Fotos werden mit 100x-Vergrößerung gezeigt. Die jeweils oberen Fotos
beider Gruppen zeigen stimulierte, die jeweils unteren Fotos unstimulierte Fibroblasten.
TGFBR1-positives Protein zeigt sich bei allen Zellen in Kernnähe, bei den DF°II ist nur ein
geringer Unterschied zwischen Stimulation und Kontrollgruppe sichtbar. An den DF°III ist
ein deutlicherer Intensitätsunterschied durch Stimulation nachweisbar. Bei Färbung auf
ACTA2 zeigt sich nach 24 Stunden Stimulation eine eindeutige Induktion.
46
SMAD7
IFNG
+ TGFB1
DF °II
unstimuliert
+ TGFB1
DF °III
unstimuliert
Abbildung 17
Immunhistochemische Färbung von DF°II und DF°III auf SMAD7 und IFNG. 50% der
Zellen werden mit rekombinantem TGFB1 mit einer Zielkonzentration von 5ng/ml im
Medium stimuliert. Alle Zellen werden nach 24 Stunden Stimulationszeit fixiert. Repräsentative Fotos werden mit 100x-Vergrößerung gezeigt. Die jeweils oberen Fotos beider
Gruppen zeigen stimulierte, die jeweils unteren Fotos unstimulierte Fibroblasten. SMAD7
wird durch Stimulation eindeutig mehr exprimiert als in Ruhe, eine gewisse Grundexpression ist allerdings nachzuweisen. Für IFNG zeigt sich in Ruhe die schon beschriebene Expression intrazellulär, aber auch extrazellulär, was auf eine parakrine Wirkung hindeuten
könnte. Nach Stimulation mit TGFB1 wird IFNG deutlich induziert. Es kann jetzt in großer
Menge intrazelluär im Zytoplasma nachgewiesen werden.
47
JAK1
STAT1
+ TGFB1
DF °II
unstimuliert
+ TGFB1
DF °III
unstimuliert
Abbildung 18
Immunhistochemische Färbung von DF°II und DF°III auf JAK1 und STAT1. 50% der
Zellen werden mit rekombinantem TGFB1 mit einer Zielkonzentration von 5ng/ml im
Medium stimuliert. Alle Zellen werden nach 24 Stunden Stimulationszeit fixiert. Repräsentative Fotos werden mit 100x-Vergrößerung gezeigt. Die jeweils oberen Fotos beider
Gruppen zeigen stimulierte, die jeweils unteren Fotos unstimulierte Fibroblasten. Nach Stimulation mit TGFB1 lässt sich eine deutliche Induktion von JAK1 in den Fibroblasten nachweisen. Diese konzentriert sich um und im Zellkern. Auch bei STAT1 lässt sich eine Induktion nachweisen, wobei diese eher auf das Zytoplasma verteilt ist.
Die unerwartete induzierende Wirkung von rekombinantem TGFB1 auf IFNG
erscheint als ein weiteres Indiz für den vermuteten bidirektionalen cross-talk der
beiden Signaltransduktionswege.
48
4.2.4.2 Stimulation mit rekombinantem IFNG und TGFB1 führt zu einer erhöhten endogenen Expression von IFNG und induziert die davon abhängige Signaltransduktion im Western Blot
Um die jeweilige Wirkung von IFNG und TGFB1 auf die Signaltransduktion und
Produktion von IFNG beschreiben zu können, werden CF, DF°II und DF°III
nach Stimulation mit IFNG oder TGFB1 auf ihre Proteinexpression hin untersucht.
Zunächst werden Zellen ausgesät, nach Erreichen von 80% Konfluenz, werden
die Zellen für 24 Stunden durch Reduktion von FCS auf 0,5% gehungert und
damit synchronisiert.
Jetzt werden die Zellen in 3 Gruppen aufgeteilt: die erste Gruppe dient als Kontrollgruppe, die nicht weiter stimuliert wird. Die zweite Gruppe wird mit 1000
U/ml rekombinantem IFNG stimuliert, die dritte Gruppe wird mit 5ng/ml rekombinantem TGFB1 stimuliert. Die Stimulationsdauer beträgt 24 Stunden. Danach
werden die Zellen lysiert und es wird das Gesamtprotein extrahiert, das dann im
nächsten Schritt in Western Blots weiter untersucht wird.
Es werden IFNG, die aktivierten phosphorylierten Formen von JAK1 und STAT1
(pJAK1 und pSTAT1), YBX1 und SMAD7 evaluiert (Abbildung 19).
Bei IFNG zeigen sich Unterschiede zwischen den Fibroblasten und Myofibroblasten. CF haben im Western Blot keine signifikanten Unterschiede in der
IFNG Expression zwischen stimulierten Zellen und Kontrollzellen. Bei DF°II
zeigt sich eine deutlichere IFNG-Expression bei Stimulation mit IFNG als bei
Stimulation mit TGFB1. Dies verhält sich umgekehrt bei DF°III.
pJAK1 wird sowohl nach Stimulation mit IFNG, als auch nach Stimulation mit
TGFB1 induziert. Bei CF, DF°II und DF°III ist nach IFNG-Stimulation der Anstieg der Proteinexpression signifikant, nach TGFB1-Stimulation ist der Anstieg
nur bei CF und DF°II signifikant.
Beim phosporylierten STAT1 verhält es sich erwartungsgemäß ähnlich wie bei
pJAK1. Insgesamt steigt nach Stimulation mit IFNG die Proteinexpression von
pSTAT1 signifikant, aber auch nach Stimulation mit TGFB1 steigt die Expression in allen Gruppen signifikant.
Bei YBX1 zeigen sich wieder Unterschiede zwischen den Fibroblasten und Myofibroblasten. Während der Anstieg bei Kontrollfibroblasten nach Stimulation mit
IFNG oder TGFB1 nur gering ist, ist der Unterschied der Proteinexpression bei
49
den Myofibroblasten sowohl nach IFNG-Stimulation als auch nach TGFB1Stimulation signifikant höher.
Bei SMAD7 reagieren die CF interessanterweise deutlich sensitiver auf die Stimulation mit IFNG als auf die Stimulation mit TGFB1 mit einer deutlich erhöhten
IFNG-Expression. Die INFG-Expression bei CF liegt auch höher als nach
TGFB1-Stimulation. Die schon transformierten Myofibroblasten reagieren wiederum signifikant erhöht nach Stimulation mit TGFB1. Eine Stimulation mit
IFNG führt nur bei DF°II zu einer erhöhten Proteinexpression.
50
TGFB1
IFNG
CF
-
DF°II
-
DF°III
-
CF
+
DF°II
+
DF°III
+
CF
+
-
DF°II
+
-
DF°III
+
-
IFNG
pJAK1
pSTAT1
YBX1
SMAD7
TUBA1A
IFNG
*
***
[
***
***
[
IFNG/TUBA1A (%)
200
150
untreated
+ IFNgamma
+ TGF beta
100
50
0
CF
DF°II
DF°III
pSTAT1
50
0
CF
DF°II
pSTAT1/TUBA1A (%)
[
***
150
***
***
DF°III
0
CF
0
CF
DF°II
DF°III
Smad7/TUBA1A (%)
YBX1/TUBA1A (%)
10
50
**
***
***
***
25
0
***
[
[
***
***
*
DF°III
[
[
20
DF°II
50
SMAD7
***
***
30
***
***
100
YBX1
40
*
***
[
**
***
200
[
100
[
150
***
***
[
200
[
pJAK1/TUBA1A (%)
pJAK1
CF
DF°II
DF°III
Abbildung 19
Repräsentative Western Blots von CF, DF°II und DFIII, die zu einem Drittel mit 1000
U/ml IFNG stimuliert werden, zu einem weiteren Drittel mit 5ng/ml TGFB1 stimuliert
werden und das letzte Drittel ist die Kontrollgruppe. Es erfolgt der Nachweis von
IFNG, pJAK1, pSTAT1, YBX1 und SMAD7. In den unteren Grafiken sind quantitative
Auswertungen von 4 individuellen Experimenten gezeigt. Als house-keeping-Protein,
das zur Normalisierung dient, wird TUB1A1 (alpha-Tubulin) verwendet. Bei der Auswertung
von IFNG zeigen sich Unterschiede zwischen den Fibroblasten und Myofibroblasten. CF
haben im Western Blot keine signifikant unterschiedlichen Proteinexpressionen (unstimuliert
131,2 rel. Grauwert, +IFNG 144,4 rel. Grauwert, +TGFB1 130,7 rel. Grauwert). Bei DF°II
zeigt sich eine deutlichere IFNG-Expression bei Stimulation mit IFNG als bei Stimulation mit
TGFB1 (unstimuliert 126,9 rel. Grauwert, +IFNG 164,8 rel. Grauwert p<0,001, +TGFB1
147,2 rel. Grauwert p<0,05). Dies verhält sich umgekehrt bei DF°III (unstimuliert 111,3 rel.
Grauwert, +IFNG 142,0 rel. Grauwert p<0,001, +TGFB1 164,8 rel. Grauwert p<0,001).
pJAK1 wird sowohl nach Stimulation mit IFNG, als auch nach Stimulation mit TGFB1 induziert. Bei CF (unstimuliert 42,7 rel. Grauwert, +IFNG 85,9 rel. Grauwert p<0,001, +TGFB1
57,7 rel. Grauwert p<0,01), DF°II (unstimuliert 81,2 rel. Grauwert, +IFNG 143,8 rel. Grau-
51
wert p<0,001, +TGFB1 110,4 rel. Grauwert p<0,001) und DF°III (unstimuliert 38,4 rel.
Grauwert, +IFNG 61,3 rel. Grauwert p<0,001, +TGFB1 39,7 rel. Grauwert)ist nach IFNGStimulation der Anstieg der Proteinexpression signifikant, nach TGFB1-Stimulation ist der
Anstieg nur bei CF und DF°II signifikant. Bei pSTAT1 verhält es sich so, dass nach Stimulation mit IFNG die Proteinexpression von pSTAT1 signifikant ansteigt (CF: unstimuliert 29,5
rel. Grauwert, +IFNG 150 rel. Grauwert p<0,001; DF°II unstimuliert 58,0 rel. Grauwert,
+IFNG 176,8 rel. Grauwert p<0,001; DF°III unstimuliert 26,7 rel. Grauwert, +IFNG 122,6 rel.
Grauwert p<0,001). Aber auch nach Stimulation mit TGFB1 steigt die Proteinexpression in
allen Gruppen signifikant an (CF: unstimuliert 29,5 rel. Grauwert, +TGFB1 57,7 rel. Grauwert p<0,001; DF°II unstimuliert 58,0 rel. Grauwert, +TGFB1 110,4 rel. Grauwert p<0,001;
DF°III unstimuliert 26,7 rel. Grauwert, +TGFB1 39,7 rel. Grauwert). Bei YBX1 ist für die CF
nur ein geringer Unterschied der Prtoeinexpression zu evaluieren (unstimuliert 6,6 rel.
Grauwert, +IFNG 10,1 rel. Grauwert, +TGFB1 10,7 rel. Grauwert p<0,05). Im Unterschied
dazu ist die Proteinexpression bei den Myofibroblasten sowohl nach IFNG-Stimulation als
auch nach TGFB1-Stimulation signifikant höher (DF°II: unstimuliert 8,6 rel. Grauwert,
+IFNG 28,9 rel. Grauwert p<0,001, +TGFB1 14,9 rel. Grauwert p<0,001; DF°III: unstimuliert
12,4 rel. Grauwert, +IFNG 18,9 rel. Grauwert p<0,001, +TGFB1 18,0 rel.Grauwert p<0,001).
Die SMAD7-Expression der CF ist nach Stimulation mit IFNG und TGFB1 signifikant erhöht
(unstimuliert 14,6 rel. Grauwert, +IFNG 35,9 rel. Grauwert p<0,001, +TGFB1 20,3
rel.Grauwert p<0,01). Die schon transformierten Myofibroblasten reagieren wiederum signifikant erhöht nach Stimulation mit TGFB1 (DF°II: unstimuliert 11,2 rel. Grauwert, +TGFB1
41,0 rel. Grauwert p<0,001; DF°III: unstimuliert 16,7 rel. Grauwert, +TGFB1 25,4 rel. Grauwert p<0,001). Eine Stimulation mit IFNG führt nur bei DF°II zu einer signifikant erhöhten
Proteinexpression (DF°II: unstimuliert 11,2 rel. Grauwert, +IFNG 22,8 rel. Grauwert
p<0,001; DF°III: unstimuliert 16,7 rel. Grauwert, +IFNG 19,8 rel. Grauwert).
52
5 Diskussion
Die Entdeckung, dass IFNG in Fibroblasten und Myofibroblasten endogen
exprimiert wird, zeigt eine neue Facette im Gesamtbild der fibrotischen Umbauvorgänge, vor allem im Hinblick auf den in dieser Arbeit vorgeschlagenen
„cross-talk“
zwischen
der
TGFB1-Signaltransduktion
und
IFNG-
Signaltransduktion.
Bei immunhistochemischen Untersuchungen aus in Operationen gewonnen
Präparaten kann überraschenderweise gezeigt werden, dass Myofibroblasten
in-vivo IFNG exprimieren (Abbildung 7). Außerdem wird IFNG, wie zum ersten
Mal überhaupt gezeigt werden kann, in unstimulierten Fibroblasten und Myofibroblasten ohne gleichzeitige Anwesenheit von anderen Zelltypen wie z.B.
Immunzellen, de-novo synthetisiert und exprimiert (Abbildung 8, Abbildung 9).
Das Ausmaß der IFNG-Expression ist anscheinend sogar mit TGFB1 positiv
korreliert, da in Myofibroblasten im Vergleich zu CF erhöhte IFNG-Level nachgewiesen werden können (Abbildung 17, Abbildung 19). Andere Zelltypen wie
z.B. NK-Zellen (natürliche Killerzellen) sind im Gegensatz dazu bekannt ihre
IFNG-Produktion komplett einzustellen, wenn sie mit TGFB1 stimuliert werden2,
16, 53
. Ob und inwieweit das IFNG aus Dupuytren’schen Myofibroblasten auch in-
vivo eine Wirkung entfaltet, sollte der Gegenstand weiterer Forschung sein.
Gegebenenfalls ist eine ähnliche parakrine oder autokrine Wirkung zu diskutieren, wie bei der Transdifferenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten durch
TGFB16-8.
SMAD7 wird über die TGFB1-Signaltransduktion induziert und wirkt antagonistisch zum TGFB1-Signalweg im Sinne eines negativen Feedbackmechanismus23, 26, 27. Überexpression von SMAD7 blockt den TGFB1-Signalweg auf Rezeptorlevel57, 58, indem es sich an den TGFBR1 bindet und damit die Phosphorylierung der R-SMADs (SMAD2 und SMAD3) verhindert47. SMAD7 hat allerdings auch noch andere Wirkungen. Es kann zu einer Degradation von RSMADs und Co-SMADs über E3-Ubiquitin-Ligasen führen, wenn es sich mit
SMURF1 zu einem Komplex verbindet11 und mit dem TGFBR1 verschmilzt18.
Dies führt zu erniedrigten Konzentrationen von TGFB1 abhängigen funktionel-
53
len Proteinen24, 47, z.B. COL1A1 (Kollagen Typ1 alpha1), FN1 (Fibronektin), und
ACTA2. Andere Daten zeigen, dass SMAD7 auch unabhängig vom TGFBR1
wirken kann, indem es direkt im Zellkern die Transkription von SMAD2, SMAD3
und SMAD4 durch Bindung seiner MH2-Domaine an ein spezifisches sog.
„smad-responsive-element“ der DNA56 hemmt. Übereinstimmend mit diesen
Daten kann in der Immunhistochemie und –fluoreszenz dieser Arbeit SMAD7
auch intranukleär gezeigt werden (Abbildung 6, Abbildung 17).
Die Genregulation von IFNG und die Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von IFNG und TGFB1 ist schon seit einiger Zeit ein Thema der aktuellen Forschung. Die größten IFNG-Produzenten in-vivo sind unter anderem TZellen und NK-Zellen2. Starke IFNG-Expression in diesen Zellen wird unter anderem über eine Hemmung von T-Box-21 (TBX21) herbeigeführt. T-Box-21 ist
ein Protein, das für die IFNG-Expression von CD4-positiven T-Zellen essentiell
zu sein scheint44. TBX21 wird wiederum über direkte Interaktion an seinem
Promotor durch das R-SMAD SMAD3 induziert54,
55
, was auf einen IFNG-
inhibierenden Effekt von TGFB1 hinweist. Andererseits konnte in anderen Studien für T-Zellen gezeigt werden, dass TBX21 nicht direkt essentiell für die
IFNG-Expression ist. TBX21 hemmt nämlich das GATA-binding-protein 3 (GATA3), das bekanntermaßen ein inhibitorischer Transkriptionsfaktor von IFNG
ist48.
In dieser Arbeit wird ein neuer Regulationsmechanismus für die IFNGRegulation vorgeschlagen, indem nachgewiesen wird, dass SMAD7 einen inhibitorischen Effekt auf die IFNG-Expression in mit adSMAD7 transfizierten CF
und DF hat. Als Folge davon werden JAK1 und STAT1 herunterreguliert. Damit
wird ein neuer intrinsischer Regulationsmechanismus im Sinne eines negativen
feedback-Mechanismus der IFNG-Expression über eine Überexpression des ISMADs SMAD7 in CF und DF beschrieben.
In der Literatur ist beschrieben, dass IFNG die ACTA2-Expression reduzieren
und die Transdifferenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten verhindern
kann14, 34, 42, 45. In der Folgezeit wurden die Hintergründe näher untersucht, dabei wird ein sog. „IFNG-TGFB1-crosstalk“ vermutet35,
47
. Dieser konnte unter
anderem am Beispiel der Leberfibrose gezeigt werden10, 49. In Übereinstimmung
mit der Literatur kann in CF und DF nach Stimulation mit rekombinantem IFNG
54
der antifibrotische Effekt nachvollzogen werden, da in diesen Zellen erhöhte
JAK1, STAT1 und vor allem SMAD7-Level nachgewiesen werden können
(Abbildung 19). Außerdem scheint ein fester zeitlicher Rahmen des Beginns der
SMAD7-Expression erkenntlich (Abbildung 5, Abbildung 6), da DF°II 2 Stunden
nach rekombinanter Stimulation mit IFNG deutlich SMAD7 exprimieren.
Als potentieller Mittler zwischen der IFNG und der TGFB1 Signaltransduktion
wird immer wieder YBX1 vorgeschlagen. Es ist bekannt, dass YBX1 ein negativer Transkriptionsfaktor der Kollagensynthese ist. Dafür stehen 2 Mechanismen
zur Verfügung: Entweder bindet sich YBX1 an ein IFNG-response-element im
Bereich des COL1A1-Promotors, oder aber es bindet sich an eine Induktionsstelle im SMAD7-Promotor und führt damit zur SMAD7-Transkription10. Die in
dieser Arbeit präsentierten Daten bestätigen YBX1 als entscheidendes Verbindungsprotein der beiden Signaltransduktionswege. Auch bei CF und DF kann
gezeigt werden, dass Stimulation mit IFNG über erhöhte Level von JAK1 und
STAT1 zu erhöhter Expression von YBX1 führt (Abbildung 19). Im weiteren Verlauf sind erhöhte Werte von SMAD7 zu detektieren (Abbildung 5, Abbildung 6).
TGFB1 führt über seinen spezifischen Signaltransduktionsweg über SMADProteine als Transkriptionsfaktoren zur Gen-Aktivierung und -hemmung29. Unter
anderem inhibiert TGFB1 die Keratinozytenproliferation und aktiviert die Produktion von Extrazellulärmatrix in Fibroblasten28. Außerdem führt eine massive
TGFB1-Ausschüttung über Chemotaxis im Rahmen der Wundheilung zur Anwesenheit von Monozyten im Gewebe28. Andererseits konnte gezeigt werden,
dass TGFB1 eine essentielle Rolle hat bei der Regulation und Kontrolle der TZell-Hämostase, was eine normale Immunantwort zulässt und umgekehrt Autoimmunprozesse verhindert12. Damit hat TGFB1 je nach Gegebenheit sowohl
eine Rolle bei fibrotischen Umbauvorgängen als auch bei der Steuerung von
Immunantworten.
Es ist eine neue Erkenntnis aus den vorliegenden Experimenten, dass
Fibroblasten und Myofibroblasten IFNG endogen exprimieren, und dass mit
TGFB1 stimulierte aktivierte Myofibroblasten signifikant erhöht IFNG de-novo
exprimieren. Als Folge wird die davon abhängige Signaltransduktion mit einer
erhöhten Expression von JAK1 und STAT1 induziert (Abbildung 18, Abbildung
19). Außerdem können nach TGFB1-Stimulation signifikant erhöhte Werte von
YBX1 gemessen werden (Abbildung 19). Dies wiederum führt zu einer erhöhten
55
SMAD7-Produktion, womit sich der Kreislauf schließt. Im in-vitro-Experiment
kann damit einerseits die antifibrotische Wirkung von IFNG nachvollzogen werden, andererseits zeigt sich umgekehrt ein zusätzlicher negativer feedbackMechanismus der TGFB1-Signaltransduktion über IFNG, JAK1, STAT1, YBX1
und das I-SMAD SMAD7.
Abbildung 20
Bidirektionaler
crosstalk
zwischen
dem
klassischen
IFNG-JAK-STATSignaltransduktionsweg und dem TGFB1-SMAD-Signaltransduktionsweg. IFNG bindet an
seinen spezifischen zellmembranständigen Rezeptor. Dieser zweiteilige Rezeptor ist assoziiert mit JAK1 und JAK2. Nach Aktivierung des Rezeptors und Phosphorylierung von JAK1
und JAK2 wird STAT1 phosphoryliert und damit aktiviert. Dies führt zu einem
STAT1/STAT1-Homodimer, das in den Nukleus transloziert wird. Dort bindet sich das Konstrukt an sog. „IFNG-activated sequences“ (GAS) in durch IFNG induzierbaren Genen37.
GAS ist an mehreren Promotoren präsent und führt zum Beispiel zur Transkription von
YBX1, das ein mögliches verbindendes Element zwischen dem IFNG- und TGFB1Signaltransduktionsweg darstellt10. Bindung von TGFB1 an seinen spezifischen Typ2Rezeptor (TGFBR2), führt zur Komplexierung von TGFBR1 und TGFBR2. Das führt zur Aktivierung des TGFBR1 und damit zur Phosphorylierung von SMAD2 und SMAD3. Daraufhin
wird ein Komplex aus SMAD2, SMAD3 und SMAD4 gebildet, der in den Nukleus transloziert27. Im Kern rekrutiert der SMAD-Komplex Ko-Aktivatoren (z.B. p300) und wird mit sog.
„DNA-binding transcription factors (SP1) assoziiert. Dies führt zur Acetylierung von Histonen und Gen-Transkription31, z.B. COL1A15, ACTA29, plasminogen-activator-inhibitor 1
(PAI1)50 und SMAD720. SMAD7 ist der zentrale Mediator des negativen feedback Mechanismus von TGFB1 in CF und DF, da SMAD7 zur Dephosphorylierung und damit Inaktivierung der R-SMADs führt47 und außerdem nach Komplexbildung mit SMURF1 die Ubiquitination und damit Verdauung von R-SMADs und Co-SMADs verursacht11. In dieser Arbeit kann ein SMAD7 abhängiger Abfall von IFNG in CF und DF nachgewiesen werden,
was auf einen zusätzlichen negativen feedback-Mechanismus hinweist. Außerdem kann
überraschenderweise gezeigt werden, das IFNG nach Stimulation mit TGFB1 transkribiert
wird. Als Folge können über erhöhte Werte von JAK1 und STAT1 erhöhte Level von YBX1
und SMAD7 gemessen werden.
56
Dies führt zu einer neuen Sicht der Dinge im Verständnis der Fibrose, der kutanen Wundheilung und der Steuerung von Immunantworten. Es kann davon
ausgegangen werden, dass die beiden Signaltransduktionswege unter mehreren Gesichtspunkten miteinander verknüpft sind als zuvor angenommen. Außerdem kann aus der Kenntnis der hier vorliegenden Experimente vorgeschlagen werden, dass der oben beschriebene „IFNG-TGFB1-crosstalk“ zumindest
in aktivierten Fibroblasten und Myofibroblasten in beide Richtungen funktioniert.
Die genauen Regulationsmechanismen sind allerdings noch nicht genau beschrieben und sollten Ziel weiterer Forschung sein.
57
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62
7 Abkürzungsverzeichnis
ACTA2: alpha smooth muscle actin
ACTB: beta-Actin
adSMAD7: ein Typ5-Adenovirus, der zur Überexpression von SMAD7 führt
CF: Konrollfibroblasten aus Ringbändern der Hand
COL1A1: Procollagen Typ 1 αlpha1
Co-SMAD: mediierendes SMAD-Protein
DD: Morbus Dupuytren
DF: Myofibroblasten aus Dupuytren’schen Kontrakturen
DF°II: Myofibroblasten aus 2-gradigen Dupuytren’schen Kontrakturen
DF°III: Myofibroblasten aus 3-gradigen Dupuytren’schen Kontrakturen
DMSO: Dimethylsulfoxid
DNA: Desoxyribonukleinsäure
DS: Esel-Serum
FCS: fetales Kälber Serum
FN1: Fibronektin
GAS: IFNG-aktivierte Sequenzen
GATA3: GATA bindendes Protein 3
IFN: Interferone
IFNG: Interferon gamma
I-SMAD: inhibierendes SMAD-Protein
JAK1: Janus-Kinase-1
kB: kilo-Basen
MMP: Magermilchpulver
m-RNA: messenger-RNA
PAI1: Plasminogen Activator Inhibitor 1
PBS: phosphate-buffered-saline Puffer
PCR: polymerase-chain-reaction
pJAK1: phosphoryliertes JAK1
pSTAT1: phosphoryliertes STAT1
RNA: Ribonukleinsäure
rpm: rounds-per-minute
R-SMAD: rezeptor-assoziierter SMAD
SMAD2: mothers against decapentaplegic homolog 2
63
SMAD3: against decapentaplegic homolog 3
SMAD4: against decapentaplegic homolog 4
SMAD7: against decapentaplegic homolog 7
SMURF1: SMAD spezifische E3 Ubiquitin Protein Ligase 1
SP1: DNA-binding transcription factors
STAT1: signal transducer and activator of transcription 1
TBS: tris-buffered-saline-Puffer
TBST: tris-buffered-saline-Puffer mit Tween versetzt
TBX21: T-Box-21 Protein
TGFB1: transforming growth factor beta 1
TGFBR1: transforming growth factor beta receptor 1
TGFBR2: transforming growth factor beta receptor 2
TUB1A1: alpha-Tubulin
YBX1: Ypsilon-box-protein 1
64
8 Vorveröffentlichungen
1. Gerdes B, Gitei E, Akkermann O, Prasse-Badde J, Schmidt C (2009)
Laparoscopic cholecystectomy without visible scar. Combined suprapubic and transumbilical approach: the „Minden cholecystectomy“. Endoscopy 41 Suppl 2:E 49-50.
2. Seyhan H, Kopp J, Beier JP, Vogel M, Akkermann O, Kneser U,
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surfaces of modified gel mammary protheses cause a different impact on
fibroproliferative properties of dermal fibroblasts. J Plast Reconstr
Aesthet Surg [epub ahead of print]
65
9 Anhang
Tabelle 1: Primäre Antikörper
Primäre Antikörper
Abkürzung
Bestellnummer
Firma
Herstellerland
m0851
Dako Deutschland GmbH
Hamburg,
Deutschland
sc-1377
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
sc-277
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
3331
Cell Signaling
Technology
MCA77G
AbD Serotec
Heidelberg,
Deutschland
New England
Biolabs GmbH
Frankfurt/Main,
Deutschland
Düsseldorf,
Deutschland
sc-464
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
9171
Cell Signaling
Technology
New England
Biolabs GmbH
Frankfurt/Main,
Deutschland
sc-7004
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Ypsilon-boxYBX1-Antikörper binding-protein-1
Antikörper
2749
Cell Signaling
Technology
TGFBR1Antikörper
Transforminggrowth-factorbeta-receptortype-1 Antikörper
3712
Cell Signaling
Technology
pSMAD2Antikörper
phosphorylierterSMAD2 Antikörper
3101
Cell Signaling
Technology
ACTA2Antikörper
IFNG-Antikörper
JAK1-Antikörper
pJAK1Antikörper
TUB1A1Antikörper
STAT1Antikörper
pSTAT1Antikörper
SMAD7Antikörper
Name
alpha-smoothmuscle-actin
Antikörper
interferongamma Antikörper
Janus-Kinase-1
Antikörper
phosphorylierter
Janus-Kinase-1
Antikörper
alpha-Tubulin-1
Antikörper
Signaltransducer-andactivator-oftranscriptionfactor-1 Antikörper
phosphorylierter
Signaltransducer-andactivator-oftranscriptionfactor-1 Antikörper
SMAD7 Antikörper
Heidelberg,
Deutschland
New England
Biolabs GmbH
Frankfurt/Main,
Deutschland
New England
Biolabs GmbH
Frankfurt/Main,
Deutschland
New England
Biolabs GmbH
Frankfurt/Main,
Deutschland
66
Tabelle 2: Sekundäre Antikörper
Sekundäre Antikörper
Name
goat-anti-rabbit-Antikörper
biotin konjugiert
goat-anti-rabbit-Antikörper
horseradish-peroxidase
konjugiert
goat-anti-mouseAntikörper biotin konjugiert
goat-anti-mouseAntikörper horseradishperoxidase konjugiert
donkey-anti-goatAntikörper biotin konjugiert
donkey-anti-goatAntikörper horseradishperoxidase konjugiert
Goat-anti-rat-Antikörper
horseradish-peroxidase
konjugiert
Bestellnummer
Firma
Herstellerland
sc-2040
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
sc-2004
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
sc-2039
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
sc-2005
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
sc-2042
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
sc-2020
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
sc-2006
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
Heidelberg,
Deutschland
Cy2®-Donkey-anti-Mousemulti-labeling Antikörper
715-225-150
Cy3®-Donkey-anti-Goatmulti-labeling Antikörper
705-165-147
Cy5®-Donkey-anti-Rabbitmulti-labeling Antikörper
711-175-152
Jackson Immuno
Research, Europe
Ltd.
Jackson Immuno
Research, Europe
Ltd.
Jackson Immuno
Research, Europe
Ltd.
Suffolk, United
Kingdom
Suffolk, United
Kingdom
Suffolk, United
Kingdom
67
10 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei all den Menschen bedanken, die mir bei
der Entstehung und Fertigstellung dieser Arbeit mit Rat und Tat zur Seite standen. Mein besonderer Dank gebührt hierbei:
Herrn Univ.-Prof. Dr. med. R.E. Horch für seine freundlichen und konstruktiven
Anregungen, zum Beispiel im Rahmen der Forschungsbesprechungen, sowie
die organisatorische Unterstützung und Bereitstellung von Materialien und Einrichtungen.
Herrn PD Dr. med. J. Kopp für die Überlassung des Themas, dafür dass er mir
das wissenschaftliche Arbeiten näher brachte, die wohlmeinende Kritik, seine
umfassende und aufgeschlossene Betreuung zu nahezu jeder Tages- und
Nachtzeit.
Herrn Dr. med. H. Seyhan für seine durchweg geduldige, freundliche und zuverlässige Unterstützung insbesondere bei der Einarbeitung in die Zellkulturtechniken.
Frau Elke Pausch für ihre außergewöhnlich motivierte, hilfsbereite und selbstlose Unterstützung bei der Durchführung der Versuche, der Auswertung molekularbiologischer, histologischer und mikroskopischer Untersuchungen sowie Unterstützung der Organisation des Laboralltags.
Frau Dr. med. K.J. Messingschlager für ihre mentale Unterstützung, die Geduld,
auch mal schlechte Laune zu ertragen, und das Herstellen einer Umgebung, die
schlussendlich zur Fertigstellung dieser Arbeit führte.
Den hier nicht genannten Kolleginnen und Kollegen aus dem Labor der plastischen Chirurgie sowie aus dem Nikolaus-Fiebiger-Zentrum für die gute Zusammenarbeit und die große Unterstützung bei der Etablierung der molekularbiologischen Techniken in unserem Labor.
68
Und nicht zuletzt meiner Familie für die immerwährende Unterstützung, Verständnis und Motivation.
69
11 Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Oke Akkermann
Geburtsdatum:
05.02.1980
Geburtsort:
Pegnitz
Konfession:
evangelisch-lutherisch
Familienstand:
ledig, keine Kinder
Eltern:
Dipl-Ing. Hans W. Akkermann, 11.04.1947
Inke C. Akkermann, geb. Gerdsen, 08.04.1953
Geschwister:
Kerstin Akkermann, 21.07.1982
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Ausbildung:
1986-1990
Hermann-Hedenus-Grundschlule Erlangen
1990-1999
Gymnasium Fridericianum Erlangen
Juni 1999
Abitur (Leistungskurse: Altgriechisch und Biologie)
Sept. 1999 – Juli 2000
Zivildienst als Krankenpflegehelfer in der Neurochirurgischen Klinik der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg (FAU)
2000-2007
Studium der Humanmedizin an der FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Sept. 2002
Ärztliche Vorprüfung
Sept. 2003
1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
März 2006
2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Okt. 2007
3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Nov. 2007
Approbation als Arzt (erteilt durch die Regierung Unterfranken)
Praktisches Jahr (10/2006-09/2007):
1. Tertial
Innere Medizin
Medizinische Klinik 2 der Universität Erlangen-Nürnberg unter der Leitung von
Herrn Univ.-Prof. Dr. med. W.G. Daniel
70
2. Tertial
Chirurgie
Chirurgische Klinken 1 und 2 des Akademischen Lehrkrankenhauses Klinikum
Fürth unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. med. H. Rupprecht und Herrn Priv. Doz.
Dr. med. R. Wölfel
3. Tertial
Plastische und Handchirurgie – Wahlfach
Klinik für Plastische und Handchirurgie der Universität Erlangen-Nürnberg unter der
Leitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. med. R.E. Horch
Bisherige und aktuelle Beschäftigung:
Seit April 2008 Assistenzarzt in der Weiterbildung zum Facharzt für Allgemeinchirurgie in der Klinik für Allgemeinchirurgie – Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie – im Klinikum Minden unter der Leitung von Prof. Dr. med. B. Gerdes
Hobbys:
Skifahren, Tauchen, Reisen
Hannover, 19.12.2010
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