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Enterisches virenpanel Echtzeit-PCR Kit - Diagenode Diagnostics

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DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
DBDG-10-4-L096
Diagenode
BD
442987
Version 1
Ausgabedatum: 28.03.2013
Enterisches virenpanel
Echtzeit-PCR Kit
Gebrauchsanleitung
Vertrieben durch
ZUR VERWENDUNG MIT DEM BD MAXTM SYSTEM
Page |1
Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50
// E - Mail: info@diagenodediagnostics.com
DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
1. EINLEITUNG .................................................................................................................................... 3
2. ALLGEMEINE INFORMATIONEN ...................................................................................................... 4
2.1 VERWENDUNGSZWECK ....................................................................................................................... 4
2.2 INFORMATIONEN ZUM KRANKHEITSERREGER ........................................................................................ 4
2.3 INHALT DES KITS ............................................................................................................................... 4
3. MATERIAL ....................................................................................................................................... 5
3.1 BENÖTIGTES MATERIAL (NICHT MITGELIEFERT) ..................................................................................... 5
3.2 AUSRÜSTUNG UND MATERIAL IN KOMBINATION MIT DIAGENODE ENTERISCHES VIRENPANEL ECHTZEIT-PCR
KIT (NICHT MITGELIEFERT) .................................................................................................................. 5
4. ÜBERPRÜFUNG............................................................................................................................... 5
5. QUALITÄTSKONTROLLE .................................................................................................................. 6
6. LAGERUNG DER REAGENZIEN, HANDLING UND STABILITÄT .......................................................... 7
7. PROBENAHME, LAGERUNG UND TRANSPORT ................................................................................ 7
7.1 ART DER PROBENAHME ...................................................................................................................... 7
7.2 PROBENLAGERUNG ............................................................................................................................ 7
7.3 PROBENTRANSPORT .......................................................................................................................... 7
8. WARN- UND VORSICHTSHINWEISE ................................................................................................. 8
9. PROTOKOLL .................................................................................................................................... 9
9.1 PROBEN- UND KONTROLLVORBEREITUNG ............................................................................................ 9
9.2 ECHTZEIT-PCR MISCHUNGSVORBEREITUNG ........................................................................................ 9
9.3 BD MAXTM SYSTEMVERSTÄRKUNG .................................................................................................... 10
10. ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 13
11. ANLEITUNG ZUR PROBLEMLÖSUNG ........................................................................................... 14
12. LEISTUNGSBEWERTUNG ............................................................................................................. 15
12.1 ANALYTISCHE SENSITIVITÄT ............................................................................................................ 15
12.2 PRÄZISION .................................................................................................................................... 15
12.3 ANALYTISCHE SPEZIFIZITÄT............................................................................................................. 16
12.4 KLINISCHE LEISTUNGSFÄHIGKEIT .................................................................................................... 17
13. TESTBESCHRÄNKUNGEN ............................................................................................................ 18
14. QUALITÄTSZERTIFIZIERUNG ....................................................................................................... 18
15. REFERENZEN .............................................................................................................................. 19
16. SYMBOLERKLÄRUNG .................................................................................................................. 20
17. KAUFHINWEIS ............................................................................................................................ 21
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Die Polymerase Kettenreaktion (PCR), auch quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) genannt, ist
eine Nukleinsäureamplifikationstechnik, welche verwendet wird, um bestimmte DNA-Sequenzierungen
aufzufinden und zu quantifizieren.
Diese Quantifizierung kann in absoluter oder relativer Anzahl von Kopien gemessen werden.
Diese Echtzeit-PCR-Technologie ermöglicht eine schnelle, genaue und quantitative Messung der Gene,
welche von ansteckenden Krankheiten, Krebs oder genetischen Anormalitäten betroffen sind.
Diese beeindruckende Technologie wird in Kits der Firma Diagenode für eine genaue Erkennung von
Krankheitserregern genutzt.
Eine der markanten Eigenschaften der qPCR Technologie ist, dass die amplifizierte DNA während der
Vermehrung in der Echtzeit-Reaktion für jeden PCR Zyklus quantifiziert wird, was wiederum weitaus
genauere Messungen als mit herkömmlichen Endpunkt-PCR erlaubt. Die Quantifizierung von Signalen,
die von fluoriszierenden Farbstoffen abgegeben werden, welche mit der je Zyklus entstehenden
Doppelstrang-DANN interkalieren, ermöglichen diese Echtzeitmessungen. Alternativ kann man doppelt
mit fluoriszierenden Farbstoffen (z.B. TaqMan® Sonde) markierte DNA (Oligonukleotide) als Sonden
verwenden, welche sich dann mit der komplementären DNA kreuzen, um die Echtzeitmessung während
der qPCR zu ermöglichen. Die dann folgenden fluoriszierenden Signale können mit einem Instrument,
wie etwa einem für die qPCR programmierten Thermalzykler, genau beobachtet und gemessen werden.
Abbildung 1: Technologie unter Nutzung von dual-labeled Hydrolyseproben
Abbildung 2: Spezifische Hybridisierung von Primer und Sonden zum gesuchten Gen
Abbildung 3: Verlängerung und Freisetzung des Reporterfarbstoff durch Taq-Polymerase
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DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
2.1 Verwendungszweck
Das Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit wie es im BD MAX™ System implementiert ist,
ist ein automatisiertes in-vitro Diagnostikprodukt für die qualitative Erkennung der Norovirus
(Genogruppen I und II) und Rotavirus Spezies in Stuhlproben von Patienten mit Anzeichen und
Symptomen von Gastroenteritis. Die Erkennung von Noroviren- und Rotaviren-Nukleinsäure von
symptomatischen Patienten hilft bei der Diagnose von vermuteten Margen-Darm-Infektionen. Dieser
Test ist nicht zur Unterscheidung von Genogruppen von Noroviren bestimmt.
2.2 Informationen zum Krankheitserreger
Rotaviren sind die häufigste Ursache für schwere Durchfallerkrankungen bei Neugeborenen und jungen
Kindern (1), und zählt zu jenen Viren, die oft als „Magengrippe” bezeichnete Infektionen, die allerdings
nichts mit der Influenza-Grippe zu tun haben, auslösen können. Es ist eine Gattung von
doppelsträngigem RNA-Virus und zählt zur Familie der Reoviridae. Mit einem Alter von 5 Jahren war
weltweit bereits fast jedes Kind zumindest einmal mit einem Rotavirus infiziert. (2). Allerdings entwickelt
sich mit jeder Infektion eine Immunität wodurch folgende Infektionen weniger stark ausfallen (3), und
Erwachsene kaum mehr betroffen sind (4). Es gibt 5 Spezies dieses Virus welche mit A,B,C,D und E
bezeichnet werden. Rotavirus A, welcher am häufigsten auftritt, verursacht mehr als 90% aller
Infektionen an Menschen.
Norovirus ist ein RNA Virus welcher in etwa 90% aller epidemischen nicht-bakteriellen Ausbrüche von
Gastroenteritis weltweit verursacht (5), und außerdem für vermutlich 50% aller lebensmittelbedingten
Ausbrüche von Gastroenteritis in den USA verantwortlich ist. (6). Norovirus I und II sind die beiden
wichtigsten Genogruppen beim Menschen und betreffen Leute aller Altersschichten. Die Viren werden
über mit Fäkalien verseuchtes Wasser oder Nahrung, von Mensch zu Mensch oder durch Aerosolbildung
des Virus und daraus folgende Kontamination von Gebieten, übertragen.
2.3 Inhalt des Kits
Das Kit wird mit dem BD MAXTM System verwendet.
Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit für 96 PCR Reaktionen (12,5 µL PCR Volumen),
eine Box :
I. Enteric Viral Panel and internal control RNA double-dye probe & primers (4 Röhrchen):
Enterisches Virenpanel mit doppelgefärbten Sonden & Primern mit Noro I (FAM, 520 nm),
Noro II (YD, 549 nm), Rota (TR, 603 nm), und RNA Extraktions- und Inhibitionskontrolle mit
doppelt gefärbte Sonden & Primer (Cy5, 662 nm): 65 µL je rotem Röhrchen.
II. Enteric Viral Panel positive control (positivkontrolle): 120 µL, grünes Röhrchen.
III. Enteric Viral Panel negative control (H2O PCR grade)(Negativkontrolle): 120 µL, himmelblaues
Röhrchen.
IV. H2O (PCR grade): 500 µL, himmelblaues Röhrchen.
V. Optima PLUS Master Mix: 720 µL, weißes Röhrchen
VI. RNA virus culture inactivated (interne Kontrolle): 1000 µL, gelbes Röhrchen
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3.1 Benötigtes Material (nicht mitgeliefert)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Mikrozentrifuge
Pipetten (präzise zwischen 1-1000 µL)
Sterile Pipettenspitzen mit Filtern
Puderfreie Handschuhe
Vortex-Mixer
Arbeitsmantel
RNase/DNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 und/oder 2 ml)
RNase/DNase-freies Wasser
Laminar-Flow-Haube
Trockene Sterilisationsbehälter für die Sammlung von Stuhlproben
Stoppuhr oder Timer
Präzisionswaage
3.2 Ausrüstung und Material in Kombination mit Diagenode Enterisches Virenpanel
Echtzeit-PCR Kit (nicht mitgeliefert)
•
•
Echtzeit-PCR Instrument: BD MAX™ System (Ref: 441916)
BD MAX™ RNA Extraktions-Kit RNA-3 (Ref : 437522): RNA Extraktionsreagenz (E2-R)
RNA Probenvorbereitungsreagenz (SP2-R)
DNase Reagenz (D1)
RNA vereinheitlichte Reagenzstreifen
•
BD MAX™ PCR Kartuschen (Ref : 437519)
Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit wurde auf die Einhaltung der unten angegebenen
Parameter hin überprüft:
Gesammelte Proben
Stuhlmassen
PCR Plattform
BD MAXTM System
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DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
-
-
Anforderungen an die Qualitätskontrolle sind in Übereinstimmung mit örtlichen, Landesund/oder Bundesrichtlinien oder Zulassungsbestimmungen und den in Ihrem Laboratorium
üblichen Verfahren zur Qualitätskontrolle zu erfüllen.
Qualitätskontrollverfahren sind dazu bestimmt, Reagenzien- und Test-Performance-Kontrollen
zu überwachen.
Kontrolltyp
Positiv
Negativ
Intern
Zur Überwachung der folgenden Reagenzien und Test-Performance
Elementares Versagen der Reagenzien inklusive Primer und Integrität der Sonde
Reagenz- und/oder Umweltkontamination
Versagen bei Lyse- und Extraktionsverfahren
PCR-Hemmung bei Einzelproben und Reagenzienversagen oder Prozessfehler
• Überprüfen Sie alle Positivkontrollen und die interne Kontrolle bevor Sie Proben mit jedem neuen Kit
durchführen, um die einwandfreie Funktion aller Reagenzien und Kit-Bestandteile sicherzustellen.
• Gemäß guter Laborpraxis sollte die interne Kontrolle in jedem Nukleinsäure-Isolationsverfahren
inkludiert werden. Die interne Kontrolle sollte als Probe behandelt werden.
• Die Positivkontrolle darf niemals durch ein Nukleinsäure-Isolationsverfahren geführt werden.
• Inklusion einer Negativkontrolle und zumindest einer Positivkontrolle wird für jeden durchgeführten
Verstärkungs-/Erkennungsdurchlauf empfohlen.
• Das Versagen von Kontrollen macht den Durchlauf ungültig und die Ergebnisse sollten nicht gewertet
werden.
- Falls die Positivkontrolle nicht innerhalb der spezifizierten Ct-Bandbreite positiv ist, aber die
Negativkontrolle gültig ist, sollte eine Wiederholungsprüfung ausgeführt werden, die mit der
Originalprobe beginnt und aliquote neue Anteile der Positivkontrolle nutzt. Falls die
Wiederholungsergebnisse noch immer ungültig sind, sollten die Ergebnisse nicht berichtet und
der Test wiederholt werden. Eine neue Probe sollte gesammelt und getestet werden.
- Falls die interne kontrolle nicht innerhalb der spezifizierten Ct-Bandbreite positiv ist oder die
Negativkontrolle ungültig ist, sollte eine Wiederholungsprüfung mit Beginn der Originalprobe
unter Verwendung einer neuen internen Kontrolle und einer neuen Negativkontrolle durchgeführt
werden. Falls Wiederholungsergebnisse noch immer ungültig sind, sollten die Ergebnisse nicht
berichtet werden und eine neue Probe sollte gesammelt und getestet werden (siehe Punkt
11.Anleitung zur Problemlösung).
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Lagern Sie alle Reagenzien (geöffnet oder ungeöffnet) bei ≤ -20°C bis zum Verfallsdatum wie
nachstehend definiert:
Zustand
Ungeöffnete Reagenz
Lagertemperatur
≤ -20°C
Stabilität
Verfallsdatum
auf
angegeben
Packung
Achten Sie immer auf das Verfallsdatum auf den Reagenzetiketten.
Es wird empfohlen, die Reagenz nicht mehr als 6 Einfrier-/Abtauzyklen auszusetzen um die Zersetzung
der Komponenten zu verhindern.
Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wird eingefroren versandt, sollte eingefroren
geliefert werden und sollte nach Erhalt eingefroren bei ≤-20°C gelagert werden. Falls die Inhalte des
Kits nicht eingefroren sind, kontaktieren Sie bitte Ihren lokalen BD Vertreter.
Die Reagenzien vor Licht schützen.
Vorsicht
Lagerung des Kit bei Raumtemperatur kann zum Abbau der Komponenten des Kits führen. Dies führt zu
einer reduzierten Sensibilität weshalb die Verwendung eines neuen Kit dringendst empfohlen wird.
7.1 Art der Probenahme
Der PCR-Test wird durchgeführt unter Verwendung von flüssigen oder weichen Stuhlproben.
Standard Sammelverfahren sind geeignet um rohen Stuhl zu sammeln. Roher Stuhl sollte in ein steriles
und fest schließendes Schraubglas gegeben werden.
7.2 Probenlagerung
Stuhlproben müssen bei 2 bis 8°C für bis zu 24 Stunden oder gefroren bei -20°C bis -70°C für Lagerung
länger als 24 Stunden aufbewahrt werden.
Stuhlproben sollten in sterilem Behälter mit Schraubverschluss gelagert werden.
Die Empfindlichkeit des PCR könnte durch wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Stuhlproben
reduziert werden; daher vermeiden Sie bitte Einfrier-/Auftauzyklen.
7.3 Probentransport
Die Stuhlproben müssen in einem Sterilisationsbehälter transportiert werden.
Die Proben müssen gemäß den lokalen und nationalen Vorschriften für den Transport von ätiologischen
Mitteln verpackt werden.
Um den Abbau von Nukleinsäure zu vermeiden empfehlen wir den Versand bei -20°C falls die
Transportzeit mehr als 24 Stunden beträgt.
Im Labor können die Proben bei Raumtemperatur transportiert werden.
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DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
Falls Sie ein beschädigtes Paket oder aufgetaute Kits erhalten sollten,
kontaktieren Sie bitte unseren lokalen BD –Vertreter.
Allgemeine Hinweise
• Lesen Sie diese Bedienungsanleitung sorgfältig durch bevor Sie das Experiment durchführen.
• Die Verwendung dieses Produktes sollte auf Personal beschränkt werden, das mit den Echtzeit-PCRTechniken vertraut ist.
• Nur zur Verwendung als In vitro-Diagnostik geeignet.
• Dieser Assay ist zur Verwendung mit flüssigen oder weichen Stuhlproben bestimmt.
Schutzvorkehrungen
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Verwenden Sie das Kit nicht falls das Label, das die äußere Box versiegelt, gebrochen ist.
Verwenden Sie die Reagenzien nicht falls die Schutzbox bei der Lieferung offen oder zerrissen ist.
Verwenden Sie die Reagenzien nicht falls die Sonde geöffnet oder beschädigt wurde.
Vermischen Sie keine Reagenzien aus verschiedenen Kits oder Kitchargen.
Verwenden Sie keine verfallenen Reagenzien oder Materialien.
Vermischen Sie keine Kappen zwischen Sonden oder verzichten Sie auf die Wiederverwendung von
Kappen da Kontamination auftreten könnte und die Testergebnisse beeinträchtigen könnte.
Aerosol-resistente Spitzen müssen für alle PCR-Gemische verwendet werden.
Die Durchführung des Tests außerhalb der empfohlenen Zeitabstände kann ungültige Resultate
verursachen. Tests die nicht innerhalb der angegebenen Zeitspanne durchgeführt werden sollten
wiederholt werden.
Das PCR Labor (Sicherheitswerkbank, DNA/ RNA Extraktionsplattform, Schutzmantel, etc.) müssen
nach jedem PCR-Experiment mit geeigneten Lösungen gereinigt werden.
Das Testen zusätzlicher Kontrollen kann gemäß den Richtlinien oder Anforderungen von örtlichen,
Landes- und/oder Bundesbestimmungen oder akkreditierten Organisationen erforderlich sein.
Für den Fall das andere PCR-Tests in dem selben allgemeinen Teil des Labors durchgeführt werden
müssen geeignete Maßnahmen getroffen werden, damit das Diagenode Enterisches Virenpanel
Echtzeit PCR-Kit, BD MAX™ RNA Extraktions-kit RNA-3, jegliche weiteren für den Test benötigten
Reagenzien und das BD MAX™ System nicht kontaminiert werden. Die Handschuhe müssen vor dem
Manipulieren der Reagenzien oder Kartuschen gewechselt werden.
Entsorgen Sie das Kit bei Verdacht auf Kontamination.
Handhaben Sie Proben immer als ob diese ansteckend wären und in Einhaltung von Regeln zum
sicheren Ablauf von Labortätigkeit, wie etwa in lokaler Gesetzgebung dokumentiert.
Tragen Sie Schutzkleidung und geeignete Einweghandschuhe während Sie mit den Reagenzien des
Kits hantieren. Waschen und desinfizieren Sie Ihre Hände gründlich, nachdem Sie den Test
durchgeführt haben.
Das Kit sollte nicht von einer Person benutzt werden, die Symptome jener Krankheit zeigt, die durch
das Kit erkannt werden soll.
Nicht mit dem Mund pipettieren.
Verschlucken Sie keine Komponenten des Kits.
In Bereichen, in denen Proben oder Kit Reagenzien verwendet werden, darf nicht geraucht, getrunken
oder gegessen werden.
Die Experimente sollten nicht während einer Schwangerschaft durchgeführt werden, da dies Risiken
für das ungeborene Baby mit sich bringt.
Entsorgen Sie ungebrauchte Reagenzien und Abfälle gemäß den geltenden Bundes-, Landes- oder
örtlichen Vorschriften.
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Entnehmen Sie die Proben und beschriften Sie diese passend (s. oben unter 7.1 Art der
Probenentnahme)
9.1 Proben- und Kontrollvorbereitung
9.1.1 Probenvorbehandlung
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Es werden 100mg der Stuhlproben mit einer Präzisionswaage eingewogen.
Fügen Sie den Stuhl mit einer Flachspachtel in 1ml PBS hinzu.
1 Minute lang in einem Vortex-Mischer mischen.
Die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.
Erneut 1 Minute lang in einem Vortex-Mischer mischen.
15 Sekunden bei 1500 rpm zentrifugieren.
Verdünnen Sie den Überstand im Verhältnis 1/10 in PBS.
Pipettieren Sie 500 µL des Überstands und 10 µL der internen RNA-Kontrolle ( gelbes Röhrchen)
in ein Probenaufbereitungreagenzienröhrchen.
Schließen Sie jedes einzelne Probenaufbereitungreagenzienröhrchen und mischen Sie diese für
10 Sekunden in einem Vortexer.
9.1.2 Vorbereitung der Negativ- und Positivkontrolle von Diagenode (optional)
Um die PCR-Reaktion zu überprüfen und die Ergebnisse zu analysieren müssen eine Positiv- und eine
Negativkontrolle durchgeführt werden.
•
•
Für die Positivkontrolle:
Pipettieren Sie 10 µL der internen RNA-Kontrolle (gelbes Röhrchen) und 500 RNase/DNasefreies Wasser in ein Probenaufbereitungsreagenzienröhrchen. Schließen Sie das Röhrchen,
mischen Sie im Vortexer und entfernen Sie den Deckel des Röhrchen vor dem Gebrauch.
Für die Negativkontrolle:
Pipettieren Sie 10 µL der Negativkontrolle von Diagenode (himmelblaues Röhrchen) und 10 µL
der internen RNA-Kontrolle (gelbes Röhrchen) und 490 µL RNase/DNase-freies Wasser in ein
Probenaufbereitungsreagenzienröhrchen. Schließen Sie das Röhrchen, mischen Sie im Vortexer
und entfernen Sie den Deckel des Röhrchen vor dem Gebrauch.
9.2 Echtzeit-PCR Mischungsvorbereitung
1. Zählen Sie die Gesamtzahl der Proben und Kontrollen die in dem Durchlauf getestet werden sollen.
2. Beginnen Sie - kurz bevor Sie den Testdurchlauf starten – mit der Vorbereitung des folgenden
kompletten Master-Mix indem Sie jedes Komponentenvolumen mit der Gesamtzahl an Proben
multiplizieren, plus 20% um Pipettierfehler zu berücksichtigen (siehe unten stehende Tabelle).
Optima PLUS Master-Mix (weißes Röhrchen).…………………..6,75 µL
Enteric Viral Panel Primer und Sonden (rote Sonde).…………2,5 µL
H2O (PCR Grad) (himmelblaues Röhrchen).………………………3,25 µL
Endvolumen eines Streifens:……………………………..……… 12.5 µL
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DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
Beispielberechnung für mehrere Streifen/Reaktionen:
Anzahl der
Proben
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Prozentuale
Fehler beim
Pipettieren
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
20%
Primer/Sonde
(µL)
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
Optima PLUS
Master-Mix
(µL)
24,3
32,4
40,5
48,6
56,7
64,8
72,9
81,0
89,1
97,2
105,3
113,4
121,5
129,6
137,7
145,8
153,9
162,0
170,1
178,2
186,3
194,4
H2O
(PCR Grad)
(µL)
11,7
15,6
19,5
23,4
27,3
31,2
35,1
39,0
42,9
46,8
50,7
54,7
58,6
62,5
66,4
70,3
74,2
78,1
82,0
85,9
89,8
93,7
Gesamt
(µL)
45,0
60,0
75,0
90,0
105,0
120,0
135,0
150,0
165,0
180,0
195,0
210,1
225,1
240,1
255,1
270,1
285,1
300,1
315,1
330,1
345,1
360,1
9.3 BD MAXTM Systemverstärkung
Hinweis: Weitere Informationen hierzu finden Sie in der BD MAX™ System Bedienungsanleitung
9.3.1 Erstellung eines Diagenode EVP-Tests (Enteric Viral Panel)
Hinweis : Falls Sie bereits den Diagenode EVP-Test erstellt haben können Sie Schritt 9.3.1 überspringen
und direkt mit Punkt 9.3.2 weiter machen.
1. Auf dem « Run » Bildschirm des BD MAXTM Systems wählen Sie das Registerblatt « Test Editor »
2. Klicken Sie den « Create Test » Button.
3. Im « Test Name » Fenster benennen Sie Ihren Test: Diagenode EVP.
4. Bei der « Extraction Type » Auswahlliste wählen Sie RNA-3.
5. Wählen Sie bei der « Master Mix Format » Auswahlliste « Research MM, Probes/Primers Add
Manually».
6. Bei den « Channel Settings », setzen Sie « Gains » und « Threshold » wie folgt:
P a g e | 11
Channel
475/520
530/565
585/630
630/665
680/715
Gain
40
60
60
60
0
Threshold
150
250
300
150
/
7. Im « GuardRail », wählen Sie « Default »
8. Bei den « Test Details », geben Sie Ihr PCR-Profil ein :
New Step
Cycle
Type
1
Profile type Hold
Time (s)
Temp (°C)
1800.0
50.3
Detect

New Step
Cycle
Type
1
Profile type Hold
Time (s)
Temp (°C)
600.0
95.0
Detect

New Step
Cycle
Type
9.
Profile type 3-Temperature
Time (s)
Temp (°C)
Detect
30.1
95.0

30.0
55.0

30.0
68.0

Klicken Sie auf das « Spectral Cross Talk » Registerblatt und geben Sie die folgenden Parameter
ein:
475/520
Excitation
Channel
10.
45
475/520
530/565
585/630
630/665
680/715
1.2
0.0
0.0
0.0
False Receiving Channel
530/565
585/630
2.1
0.0
0.0
0.03
0.0
4.9
0.0
0.0
630/665
0.0
0.0
2.7
4.7
Wählen Sie den « Save Test » Button.
Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 – 3.Stock // Avenue de l’Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgien // Telefon: (+32) 4 364 20 50
// E - Mail: info@diagenodediagnostics.com
680/715
0.0
0.0
0.0
0.0
DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
9.3.2 BD MAXTM System Rack Einstellungen
Weitere Informationen hierzu finden Sie in der BD MAX™ Gebrauchsanweisung.
1.
2.
3.
4.
Beladen Sie die BD MAX™ Racks mit der entsprechenden Anzahl an RNA Unitized Reagent Strips
(URS).
Unter leichtem Anklopfen jedes URS auf eine harte Oberfläche vergewissern Sie sich, dass sich die
Flüssigkeiten am Boden befinden.
Lassen Sie die RNA Extraktionsreagenzienröhrchen (weiße Folie) und die DNase
Reagenzienröhrchen (gelbe Folie) in ihre jeweiligen Positionen in der URS einrasten. (siehe
Abbildung 1).
Pipettieren Sie 12.5 μl des kompletten Master-Mix (vorbereitet in Abschnitt 9.2) in das zum
Einrasten vorbestimmte RNA Röhrchen (Position 3) des RNA URS. Vergewissern Sie sich, dass keine
Luftbläschen bestehen und, dass sich die Flüssigkeit sich am Boden befindet.
Pipettieren Sie für die Positivkontrollprobe des URS 1 μl der Positivkontrolle (grünes Röhrchen) in
das dafür vorgesehene RNA Röhrchen (Position 3) zusätzlich zum Mastermix.
9.3.3 BD MAXTM Instrumenteinstellung
1. Wählen Sie die <Work List> Registerkarte auf dem <Run> Bildschirm des BD MAX™ Systems.
2. Wählen Sie In der “Assay” Auswahlliste den Diagenode EPV (falls dieser noch nicht erstellt wurde
gehen Sie bitte zum Abschnitt 9.3.1).
3. Geben Sie den Barcode des Probenvorbereitungsreagenzienröhrchens für jede entsprechende
Probe/Patienten oder kontrollieren Sie diesen per Barcodescanner oder manuell. Beginnen Sie mit
Position 1 des Rack A.
4. Bringen Sie das Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen in seine entsprechende Position im BD
MAXTM Rack(s).
5. Geben Sie die Informationen zur Identifikation der Proben/Patienten in die Arbeitsliste ein, entweder
per Barcodescanner oder manuelle Eingabe. Setzen Sie diesen Vorgang fort bis alle
Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen eingegeben wurden. Vergewissern Sie sich, dass die
Proben/Patienten-ID und Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen richtig übereinstimmen.
P a g e | 13
6. Laden der Rack(s) in das BD MAX™ System (Rack A befindet sich auf der linken Seite des BD MAX™
System und Rack B auf der rechten Seite).
7. Laden Sie die BD MAXTM PCR Kartusche(n).
8. Schließen Sie die Tür des BD MAX™ System.
9. Klicken Sie auf “Start Run”
1. Klicken Sie im Hauptmenü auf den “Results” Button.
2. Doppelklick auf den Durchlauf in der Liste und klicken Sie auf das neue Registerblatt “Run …..”
3. Im “Print” Registerblatt, wählen Sie: Result 
Protocol Details 
PCR 
4. Klicken Sie auf “Create Report” und dann auf den “Print Report” Button.
Ergebnisinterpretation mit der BD MAX™-System Software 2.7.4 oder 2.7.0
1.
Damit ein Durchlauf gültig ist (optional):
a. Es darf keine BD MAXTM Systemausfälle geben.
b. Die Negativkontrolle hat einen CT-Wert von -1 für alle Kanäle außer 630/665.
c. Die Positivkontrolle hat einen CT-Wert von 30 ± 3.3 für die Kanäle 475/520, 530/565, und 585/630.
2.
Falls der Durchlauf gültig ist, bewerten Sie die Probenergebnisse wie in der folgenden Grafik
beschrieben:
a. Ein CT-Wert von 0 bedeutet, dass kein CT-Wert berechnet wurde und die Probenkurve manuell
überprüft werden muss mit einer Anpassung der Grenzwertlinie um einen neuen CT-Wert zu
berechnen.
b. Ein CT-Wert von -1 bedeutet, dass keine Verstärkung passiert ist.
c. Jeder andere CT-Wert zeigt, dass seine Verstärkung stattgefunden hat. In der nachfolgenden
Tabelle finden Sie mehr Informationen zur Ergebnisinterpretation.
CT 475/520
Norovirus I
CT 530/565
Norovirus II
CT 585/630
Rotavirus
CT 630/665
interne Kontrolle
-1
-1
-1
≤ 36
Norovirus I/II und Rotavirus-RNA
nicht erkannt.
ANY
-1
-1
ANY
Norovirus I/II-RNA wurden erkannt.
Ergebnisinterpretation
Rotavirus-RNA wurde nicht erkannt.
-1
ANY
-1
ANY
-1
-1
ANY
ANY
ANY
ANY
-1
ANY
ANY
-1
ANY
ANY
Norovirus I/II-RNA wurden erkannt.
Rotavirus-RNA wurde nicht erkannt.
Rotavirus-RNA wurde erkannt.
Norovirus I/II-RNA wurden nicht
erkannt.
Norovirus I/II –RNA wurden erkannt.
Rotavirus-RNA nicht erkannt.
Norovirus I/II- und Rotavirus-RNA
wurden erkannt.
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DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
-1
ANY
ANY
ANY
Norovirus I/II- und Rotavirus-RNA
wurden erkannt.
ANY
ANY
ANY
ANY
Norovirus I/II- und Rotavirus-RNA
wurden erkannt.
> 36
Hemmende Probe. *
-1
-1
-1
oder -1
Aus diesem Test kann keine
Diagnose abgeleitet werden.
*Für hemmende Proben: Wiederholen Sie den Test mit den ursprünglichen Proben, die Sie zwischen 28°C gelagert haben indem Sie ein neues Probenvorbereitungsreagenzienröhrchen mit verdünnten (mit
PBS) oder unverdünnten Proben vorbereiten. Alternativ können Sie eine neuentnommene Probe testen.
Nähere Informationen entnehmen Sie bitte dem Teil zur “Problemlösung” im BD MAX TM System
Benutzerhandbuch.
Beschreibung
Ziel- und interne Kontrolle verstärken
sich nicht.
Das Ziel verstärkt sich, aber nicht die
interne Kontrolle.
Mögliche Ursachen
PCR wird durch exogene
oder endogene
Substanzen gehemmt
Korrekturmaßnahmen
Probentest wiederholen.
Liquid-Handling
Probleme
Überprüfen Sie die URS und
Mikrofluidik-Kartusche um
festzustellen, wo die LiquidHandling Probleme aufgetreten
sind und wiederholen Sie die
Probe. Falls das Problem
weiter besteht kontaktieren Sie
Ihren lokalen BD-Vertreter.
Das Ziel hat die interne
Kontrolle um die
Ressourcen gebracht
während der Reaktion.
Verifizieren Sie, dass die Probe
eine Frühversorgung hat.
Überprüfen Sie, dass das
Spannungsschwankungen System mit dem URS
verbunden ist.
Prüfen Sie das Verfallsdatum
Primer oder
des Kits und ob das das Kit
Sondenverfall
korrekt gelagert wurde.
Sehr geringe Fluoreszenz in allen
Proben, auch der internen Kontrolle
Näheres entnehmen Sie bitte
Problem mit dem
dem BD MAX™
Instrument
Benutzerhandbuch.
Bei weiteren Fragen zu Problemlösung und Problembehebung kontaktieren Sie bitte Ihren lokalen
BD Vertreter oder den Diagenode-Kundenservice.
Spikes treten in allen
Verstärkungskurven gleichzeitig auf.
P a g e | 15
12.1 Analytische Sensitivität
Die analytische Nachweisgrenze unter Berücksichtigung des Reinigungsvorgangs (LOD) wurde für
Norovirus I und II in der Stuhl-Matrix bewertet. Die analytische Nachweisgrenze unter Berücksichtigung
des Reinigungsvorgangs wird unter Verwendung von quantifizierten inaktiven Norovirus I und II
Krankheitserregern bewertet. Zum Zeitpunkt der Durchführung des analytischen Empfindlichkeitstest
waren keine Genomstandards für die Rotaviren verfügbar. Daher wurde der LOD für die Rotaviren mit
direkt in die PCR-Master-Mix-Lösung hinzugefügte Plasmid-DNA durchgeführt. Die Anzahl der
Kopien/Reaktion wurde dann in theoretische Kopien/ml der Probe umgewandelt bei Annahme einer
Extraktionseffizienz von 100%.
Um die analytische Sensitivität unter Berücksichtigung des Reinigungsvorgangs des Diagenode
Enterisches Virenpanel Echteit-PCR-Kit für die Erkennung von Norovirus (I/II) in den Stuhlproben zu
ermitteln, wurden Verdünnungsproben in Pools von negativen Stuhlproben durchgeführt.
Um die analytische Sensitivität des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit für die
Erkennung von Rotavirus zu ermitteln, wurden Verdünnungsproben eines bestimmten Plasmid, welcher
die Rotavirus-Zielsequenz beinhaltet, direkt in die PCR-Master-Mix-Lösung vermischt.
Proben wurden auf dem BD MAXTM –Instrument in Kombination mit dem Diagenode Enterisches
Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit analysiert. Für Rotavirus wurde der Extraktionsschritt ausgelassen. Das
Testen wurde an verschiedenen Tagen mit 24 Replikaten durchgeführt. Die Ergebnisse wurden durch
eine Probit-Analyse bestimmt. Analytische Sensitivität (LOD) definiert als die niedrigste Konzentration
bei der ≥ 95% der Replikate positive getestet werden sind der unteren Tabelle zu entnehmen:
Norovirus I
Norovirus II
Rotavirus
Kopien/PCR
NA
NA
30
LOD 95%
Kopien/mL
5 151 (312 to 10 000)*
587
397
* Die Sensitivität von Norovirus I ist stark durch die Stuhlprobe beeinflusst.
In der vorliegenden Sensitivitätsstudie variierte die Bestimmungsgrenze
(LOD) von 312 bis 10 000 Kopien/mL je welches Pool für den Stuhl verwendet
wurde
12.2 Präzision
Die Präzisionswerte des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wurden mittels des BD
MAXTM- Instrument gesammelt und ermöglichen die Bestimmung der Variabilität innerhalb der
Durchläufe (Variabilität von mehreren Probenergebnissen der selben Konzentration innerhalb eines
Experiments) und der Variabilität zwischen der Durchläufe (Variabilität von mehreren Ergebnissen des
durchgeführten Vorgang mittels vier an verschiedenen Tagen gestarteter Durchläufe) von Norovirus I/II
and Rotavirus. Die gesammelten Daten wurden zur Bestimmung der Standardabweichung und dem
Variationskoeffizienten für die erkannten Erreger verwendet.
Präzisionswerte für Norovirus I und II wurden mit Verwendung der Stuhlmatrix unter Hinzugabe von den
entsprechenden inaktiven Krankheitserregern bei hoher und niedriger (nahe den entsprechenden LODs)
Konzentration der Krankheitserreger bestimmt. Kein quantifizierter Genomstandard für Rotavirus war
zum Zeitpunkt der Durchführung der Präzisionstests verfügbar. Daher wurden Präzisionswerte für
Rotavirus mittels direkt in den Master-Mix hinzugefügter Plasmid-DNA bei hoher und niedriger (nahe
den entsprechenden LODs) Konzentration des Rotavirus gesammelt.
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DIAGENODE Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR GEBRAUCHSANWEISUNG
Die Tests wurden durch verschiedene Mitarbeiter an verschiedenen Tagen durchgeführt. Die
Präzisionswerte wurden auf Basis von Ct-Werten der Amplifikationskurven wie folgt berechnet: IntraAssay Variation = mittlerer Variationskoeffizient (CV) jedes Durchlaufs; Inter-Assay Variation =
Variationskoeffizient (CV) des mittleren Ct-Wertes jedes einzelnen Durchlaufs. Die Ergebnisse werden in
der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
Test
Intra-Assay Noro I
Inter-Assay Noro I
Intra-Assay Noro II
Inter-Assay Noro II
Intra-Assay Rota
Inter-Assay Rota
Matrix
Keimkonzentration
Mittlerer
Ct-Wert
Stuhl
Stuhl
Stuhl
Stuhl
Stuhl
Stuhl
Stuhl
Stuhl
NA
NA
NA
NA
312 k/mL
10 000 k/mL
312 k/mL
10 000 k/mL
2500 k/mL
625 k/mL
2500 k/mL
625 k/mL
532 k/mL
2128 k/mL
532 k/mL
2128 k/mL
34.6
32.5
34.6
32.5
30.6
31.5
30.6
31.5
33.3
31.8
33.3
31.8
VariationsStandardkoeffizienz
abweichung1
(%)2
1.26
3.54
0.53
0.85
1.25
3.62
2.35
0.67
0.45
1.46
0.35
1.12
0.55
1.81
0.43
1.38
0.50
1.51
0.25
0.78
0.50
1.32
0.31
0.97
Werte entsprechen der mittleren Standardabweichung jedes einzelnen Durchlaufs nach intra-Assay
Variation und der Standardabweichung des mittleren Ct-Wertes jedes einzelnen Durchlaufs für die
inter-Assay Variation
2Werte entsprechen dem mittleren Variationskoeffizienten jedes einzelnen Durchlaufs nach intra-Assay
Variation und dem Variationskoeffizient des mittleren Ct-Wertes jedes einzelnen Durchlaufes für die
inter-Assay Variation
1
12.3 Analytische Spezifizität
Die Spezifizität des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wird zunächst und vor allem
durch die Auswahl an Primern und Sonden gewährleistet, als auch durch die Auswahl an strengen
Reaktionsbedingungen. Die Primer und Sonden wurden auf mögliche Homologien zu allen in Genbanken
veröffentlichen Sequenzen durch Sequenzvergleichsanalyse überprüft .
Um die experimentelle Spezifizität des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit zu
bestimmen, wurden die in der folgenden Tabelle aufgezählten Erreger auf Kreuzreaktivität getestet.
Keiner dieser getesteten Keime war reaktiv.
Erreger
Bacillus cereus
Campylobacter jejuni
Clostridium difficile
Clostridium perfringens
Cryptosporidium hominis
Cryptosporidium parvum
Entamoeba dispar
Entamoeba histolytica
Enterocytozoon bieneusi
Enterovirus 71
Giardia intestinalis
Humanes Coxsavirus B4
P a g e | 17
Humanes Echovirus 13
Parechovirus 1
Salmonella enterica
Shigella flexneri
Staphylococcus aureus
Yersinia enterocolitica
12.4 Klinische Leistungsfähigkeit
Die Leistungsmerkmale des Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit wurden während einer
retrospektiven Studie in einem Referenzlabor im Vergleich zu einer validierten PCR-Referenzmethode
getestet.
Ingesamt wurden 225 Proben (100 Negativproben, 25 Norovirus I Positivproben, 50 Norovirus-II
Positivproben und 50 Rotavirus Positivproben) retrospektive mit dem Diagenode Enterisches Virenpanel
Echtzeit-PCR-Kit auf dem BD MAXTM-System getestet. Die Proben bestanden aus 100 mg Stuhl
ausgebreitet in 0.4 mL phosphat-gebufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% Polyvinylpolypyrolidone für
die Referenzmethode und in 1mL phosphat-gebufferter Kochsalzlösung (PBS) für das Diagenode
Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR-Kit. 200 µL Probenüberstand wurden zunächst extrahiert auf
MagNa-Pure LC, Roche mittels des TNAI High Performance-Kit (50 µL Eluat) und analysiert mit der
Multiplex Echtzeit-PCR-Referenzmethode(9) in Kombination mit dem BioRad CFX96 Echtzeit-System,
dem Biorad 5x iScript RT und dem Supermix Qiagen 2x HotStar Mastermix. 500 µL Probenüberstand
1/10 vorverdünnt in PBS wurde in die BD MAXTM Kartusche gefüllt. Proben mit invalider Höhe (keine ICErkennung und keine zielbestimmte Erkennung) und eine Rotavirus-überladene Probe (die Software
konnte keinen Ct-Wert ermitteln, weil die Virusmenge zu hoch war) wurden von der statistischen
Analyse ausgenommen.
Diagnostische Sensitivität, diagnostische Spezifizität und Genauigkeit wurden für Rotavirus und
Norovirus (I/II) berechnet. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst:
Rotavirus
Norovirus
Enterisches VirenpanelKit auf BD MAXTM
0
7
160
Negativ
(I/II)
Positiv
(I/II)
Positiv
49
Positiv
(I/II)
64
(21/43)
6
(0/6)
Negativ
(I/II)
Negativ
Referenzmethode
Positiv
Negativ
Referenzmethode
Enterisches VirenpanelKit auf BD MAXTM
5
(4/1)
142
(N/A)
Diagnostische Sensitivität (unterer Grenzwert 95%CI):
100% (93%)
91% (83%)
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Diagnostische Spezifizität (unterer Grenzwert
95%CI):
96% (92%)
Genauigkeit:
Κ = 0.91
(nahezu perfekte Abstimmung)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
97% (92%)
Κ = 0.88
(nahezu perfekte Abstimmung)
Alle Reagenzien dürfen ausschließlich für in vitro Diagnostik genutzt werden.
Eine strikte Einhaltung der Benutzungsanleitung ist für die Erzielung optimaler Ergebnisse nötig.
Dieser Test wurde für die Verwendung mit flüssigen und weichen Stuhlproben validiert.
Dieser Test wurde für die Verwendung mit dem BD MAXTM -System Version 2.7.0 oder 2.7.4 validiert.
Dieser Test wurde für die Erkennung von Norovirus und Rotavirus validiert und ermöglicht keine
Unterscheidung zwischen Norovirus-Genogruppen.
Ein negatives Ergebnis kann eine Infektion nicht ausschließen und sollte nicht als alleinige Grundlage
für Diagnose, Behandlung und weitere Behandlungsentscheidungen herangezogen werden.
Die Erkennung von viralen Nukleinsäuren benötigt eine sachgemäße Entnahme der Proben,
Handhabung, Transport, Lagerung und Vorbereitung. Nichtbeachtung von angemessenen Verfahren
bei einem dieser Schritte kann zu falschen Ergebnissen führen. Es besteht die Gefahr von falsch
negativen Werten als Ergebnis von unsachgemäß gesammelten, transportierten oder gehandhabten
Proben.
Es besteht weiters die Gefahr von falsch negativen Werten aufgrund der Präsenz von
Sequenzvarianten in den viral Targets des Verfahrens, Verfahrensfehler, Amplifikationsinhibitoren in
Proben, oder einer inadäquaten Anzahl von Organismen zur Amplifikation.
Falsch negative Werte können auch durch Verlust von Nukleinsäure entstehen. Die
Inhibitionskontrolle wurde dem Test hinzugefügt um bei der Identifizierung von Proben zu helfen,
welche Inhibitoren zur PCR-Amplifikation beinhalten. Die Kontrolle zeigt nicht an, ob Nukleinsäure
aufgrund von unsachgemäßer Sammlung, Transport oder Lagerung der Proben verloren wurde.
Es besteht die Gefahr von falsch positiven Werten als Resultat von Kreuzkontamination durch
Zielorganismen, deren Nukleinsäure oder amplifiziertes Produkt, oder von nicht-spezifischen
Signalen im Verfahren.
Diagenode hat das ISO 9001 und das ISO 13485 Zertifikat für Design, Herstellung und Verkauf von IVD
Geräten mit Nukleinsäuretechnologie für Infektionskrankheiten erhalten.
Das Diagenode Enterisches Virenpanel Echtzeit-PCR Kit ist auf zuvor festgelegte Spezifikationen hin
überprüft um Produktqualität zu garantieren.
P a g e | 19
(1) Dennehy PH (2000). "Transmission of rotavirus and other enteric pathogens in the home". Pediatr.
Infect. Dis. J. 19 (10 Suppl): S103–5.
(2) Velázquez FR, Matson DO, Calva JJ, Guerrero L, Morrow AL, Carter-Campbell S, Glass RI, Estes MK,
Pickering LK, Ruiz-Palacios GM (1996). "Rotavirus infections in infants as protection against subsequent
infections". N. Engl. J. Med. 335 (14): 1022–8.
(3) Linhares AC, Gabbay YB, Mascarenhas JD, Freitas RB, Flewett TH, Beards GM (1988). "Epidemiology
of rotavirus subgroups and serotypes in Belem, Brazil: a three-year study". Ann. Inst. Pasteur Virol. 139
(1): 89–99.
(4) Bishop RF (1996). "Natural history of human rotavirus infection". Arch. Virol. Suppl. 12: 119–28.
(5) Lindesmith L, Moe C, Marionneau S, et al. (2003). "Human susceptibility and resistance to Norwalk
virus infection". Nat. Med. 9 (5): 548–53.
(6) Widdowson MA, Sulka A, Bulens SN, et al. (2005). "Norovirus and foodborne disease, United States,
1991-2000". Emerging Infect. Dis. 11 (1): 95–102.
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(8) Said MA, Perl TM, Sears CL (November 2008). "Healthcare epidemiology: gastrointestinal flu:
norovirus in health care and long-term care facilities". Clinical Infectious Diseases : an Official
Publication of the Infectious Diseases Society of America 47 (9): 1202–8.
(9) Diagnosis of viral gastroenteritis by simultaneous detection of Adenovirus group F, Astrovirus,
Rotavirus group A, Norovirus genogroups I and II, and Sapovirus in two internally controlled multiplex
real-time PCR assays. Noortje M. van Maarseveen1, Els Wessels, Caroline S. de Brouwer, Ann C.T.M.
Vossen, Eric C.J. Claas. Journal of Clinical Virology 49 (2010) 205–210
Noortje M. van Maarseveen, Els Wessels, Caroline S. de Brouwer, Ann C.T.M. Vossen, Eric C.J. Claas
“Diagnosis of viral gastroenteritis by simultaneous detection of Adenovirus group F, Astrovirus,
Rotavirus group A, Norovirus genogroups I and II, and Sapovirus in two internally controlled multiplex
real-time PCR assays”. Journal of Clinical Virology 49 (2010) 205–210
S.-Q. Zeng, A. Halkosalo, M. Salminen, E.D. Szakal, L. Puustinen, T. Vesikari.
“One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis”.
Journal of Virological Methods 153 (2008) 238–240
Young Bin Park, You-Hee Cho, GwangPyo Ko
“A duplex real-time RT-PCR assay for the simultaneous genogroup-specific detection of noroviruses in
both clinical and environmental specimens”. Virus Genes (2011) 43:192–200
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Biologisches Risiko
Kontrolle
Negativkontrolle
Positivkontrolle
Vor direkter Sonneneinstrahlung schützen
Hersteller
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Dieses Produkt ist für die Verwendung in der Polymerase Kettenreaktion (PCR) vorgesehen, welche
durch Patente der Roche Molecular Systems, Inc., und F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche) geschützt
wird. Durch den Kauf dieses Produktes werden weder direkt noch indirekt Lizenzrechte zur Nutzung des
PCR-Verfahrens erworben.
Eine Lizenz zur Verwendung des PCR-Prozess für bestimmte Forschung- und Entwicklungstätigkeiten
geht mit dem Kauf bestimmter Reagenzien von lizenzierten Lieferanten einher, wenn diese in
Kombination mit einem genehmigten Thermalzykler verwendet werden bzw. sind diese erhältlich durch
Applied Biosystems. Für weitere Informationen zum Erwerb von Lizenzen zur Durchführung des PCRProzess wenden Sie sich an den Director of Licensing bei Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive,
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