close

Anmelden

Neues Passwort anfordern?

Anmeldung mit OpenID

HYDRAGEL ISO-CK K20 - sebia

EinbettenHerunterladen
HYDRAGEL ISO-CK K20
Ref. 3024
2012/03
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
ANWENDUNGSBEREICH
Der HYDRAGEL ISO-CK K20 Kit dient der Identifikation und Quantifizierung der drei Kreatinkinase (CK) -Isoenzymen in humanem Serum durch
Gelelektrophorese auf alkalisch gepufferten (pH 8.4) Agarosegelen. Die resultierenden Gele können visuell und durch Densitometrie abgelesen werden,
um akkurate relative Quantifizierungen individueller Zonen zu erhalten.
Jedes Agarosegel im HYDRAGEL ISO-CK K20 Kit ist für 7 Proben bestimmt.
Nur für den diagnostischen in vitro Gebrauch.
TESTPRINZIP
Die Kreatinkinase-Isoenzyme bestehen aus je zwei Untereinheiten: M ("Muskel") und B ("Brain", Gehirn), die Dimere bilden. Die drei resultierenden
Kombinationen bilden die drei Isoenzyme: MM, ist prinzipiell im Herz und Skelettmuskel, MB im Herzmuskel und BB in zerebralen Geweben lokalisiert.
Jede Untereinheit besitzt eine spezifische Ladung, die den individuellen Kreatinkinase-Isoenzymen eine charakteristische elektrphoretische Mobilität
verleiht. Auf HYDRAGEL 7 ISO CK/LD Gelen ist die BB-Fraktion die anodischste, die MM-Fraktion die kathodischste und die MB-Fraktion liegt zwischen
den beiden.
Der hauptsächliche Wert der Elektrophorese von Kreatinkinase liegt in der Bestätigung des Herzinfarktes (MI). Die Konzentration von MB erhöht sich
nach dem Infarkt nach 4 - 8 Stunden. Die CK-Isoenzymanalyse wird generell zusammen mit der Bestimmung der LD (Lactatdehydrogenasen)Isoenzyme und / oder anderen frühen kadiologischen Markern um die Diagnose eines Herzinfarktes zu bestätigen oder auszuschließen, seine Heftigkeit
zu bewerten und den Zustand des Patienten zu überwachen.
Alle CK-Isoenzyme katalysieren dieselbe reversible Reaktion, die auch für ihre Anfärbungen verwendet wird. Bei der HYDRAGEL ISO-CK K20 Prozedur,
werden die Serumproben elektrophoretisch getrennt und die aufgetrennten CK-Isoenzyme werden mit einem spezifischen Substrat gemäß folgender
Reaktionen angefärbt:
Kreatin-Phosphate + ADP
ATP + D-Glucose
Glucose-6-Phosphat + NADP
CK
Kreatin + ATP
HEXOKINASE
Glucose-6-Phosphat + ADP
G-6-PDH
NADPH + 6-Phosphogluconolacton
NADPH + PMS
NADP+ PMSH
PMSH + TNBT
Die Menge des resultierenden Formazanpräzipitats ist proportional zur CK Enzymaktivität.
PMS + TNBT reduziert
Präzipitat von Formazan
ABKÜRZUNGEN:
CK : Kreatinkinase
HK : Hexokinase
G-6-PDH : Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase
ADP: Adenosin 5’ Diphosphat
ATP: Adenosin 5’ Triphosphat
NADP: Nicotinamid Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NADPH: reduziertes Nicotinamid Adenin-Dinukleotid-Phosphat
PMS: Phenazin-Methosulfat
PMSH: reduziertes Phenazin-Methosulfat
TNBT: Tetranitro-Blau-Tetrazolium
MITGELIEFERTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN IM HYDRAGEL ISO-CK K20 KIT
WARNUNG : Siehe Sicherheitsdatenblätter.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ARTIKEL
Agarosegele (gebrauchsfertig)
HYDRAGEL ISO CK/LD Puffer (Stammlösung)
Aktivierungslösung (gebrauchsfertig)
Substratlösungsmittel (gebrauchsfertig)
Chromogen (Stammlösung)
ISO-CK Substrat (gefriergetrocknet)
ISO CK/LD Blockierlösung (gebrauchsfertig)
Entfärbelösung (Stammlösung)
Applikatoren 7 Zähne (gebrauchsfertig)
Filterpapier - Dünn
Filterpapier - Dick
ART.-NR. 3024
10 Gele
3 Fläschchen, jeweils 100 ml
1 Fläschchen, 0,75 ml
1 Fläschchen, 40 ml
1 Fläschchen, 3 ml
10 Fläschchen
1 Fläschchen, 40 ml
1 Fläschchen, 100 ml
1 Pack mit 10
1 Pack mit 10
1 Pack mit 10
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Bei einem Transport kann das Kit 15 Tage ohne Kühlung (15 - 30 °C) aufbewahrt werden, ohne dass sich dies nachteilig auf ihre Eigenschaften
auswirkt.
- 15 -
SEBIA ARBEITSANLEITUNG - Deutsch
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
FÜR OPTIMALE ERGEBNISSE :
Alle Reagenzien eines Kits müssen immer zusammen, gemäß den Instruktionen der Packungsbeilage benutzt werden.
BITTE DIE PACKUNGSBEILAGE SORGFÄLTIG LESEN.
1. AGAROSEGELE
Vorbereitung
Die Agarosegele sind gebrauchsfertig. Jedes Gel enthält : Agarose ; Pufferlösung, pH 8,4 ± 0,5 ; Additive, die in den eingesetzten Konzentrationen
ungefährlich und für eine optimale Leistung erforderlich sind.
Gebrauch
Hilfsmittel zur elektrophoretischen Trennung der Kreatinkinase-Isoenzyme.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Gele horizontal in der Originalverpackung bei Raumtemperatur (15 - 30 °C) oder gekühlt (2 - 8 °C) lagern. Die Gele sind bis zum Ablauf des
Verfallsdatums auf der Kitschachtel oder auf der Gelverpackung stabil. (Der Pfeil auf der Vorderseite des Kits muss nach oben zeigen).
Gele nicht in der Nähe eines Fensters oder einer Hitzequelle lagern. Bedeutsame Temperaturschwankungen vermeiden.
NICHT EINFRIEREN.
Das Gel verwerfen, wenn:
(I) sich Kristalle oder Präzipitate auf der Geloberfläche bilden oder die Geltextur sehr weich wird (dies alles resultiert vom Einfrieren des Gels) ;
(II) bakterielles - oder Pilzwachstum erscheint ;
(III) sich eine abnormale Flüssigkeitsmenge in der Gelschachtel befindet (Absonderungen von Puffer aus dem Gel durch nicht korrekte Lagerbedingungen).
2. HYDRAGEL ISO CK/LD PUFFER
Vorbereitung
Jedes Fläschchen der Puffer-Stammlösung muss mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 1 Liter verdünnt werden.
Nach Verdünnung enthält die Arbeitslösung : Pufferlösung, pH 8,4 ± 0,5 ; Additive, die in den eingesetzten Konzentrationen ungefährlich und für eine
optimale Leistung erforderlich sind.
Gebrauch
Elektrophoresepuffer.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Puffer-Stammlösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist für mehrere Jahre, mindestens bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der
Kitschachtel oder auf dem Etikett der Pufferfläschchen stabil. Verdünnte Pufferlösung ist bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Flasche für 1 Jahr stabil.
Den verdünnten Puffer verwerfen, wenn sich sein Aussehen verändert, z. B., wenn er durch mikrobielle Kontamination trübe wird.
HINWEIS: Während der Lagerung kann die Puffer-Stammlösung nach gelb umschlagen ohne nachteilige Effekte für die Durchführung.
3. AKTIVIERUNGSLÖSUNG*
Vorbereitung
Die Aktivierungslösung ist gebrauchsfertig. Sie enthält: ß-Mercaptoethanol.
Gebrauch
Zur Vorbehandlung der Seren vor der elektrophoretischen Auftrennung.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Aktivierungslösung gekühlt lagern. Sie ist bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Kitschachtel oder auf dem Etikett des
Aktivierungslösungsfläschchen stabil.
Die Aktivierungslösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z. B., wenn sie durch mikrobielle Kontamination trübe wird.
Die Aktivierungslösung muss frei von Ausfällungen sein.
WICHTIG: Nach jedem Gebrauch das Fläschchen mit der Aktivierungslösung verschließen, um Abbaureaktionen durch Oxidation zu vermeiden.
ZU BEACHTEN: Die ISO-CK Aktivierungslösung riecht normalerweise stark nach ß-Mercaptoethanol. Schwacher oder fehlender Geruch ist
symptomatisch für eine verringerte oder völlig fehlende Aktivität. Die Aktivierungslösung kann durch die Addition von reinem ß-Mercaptoethanol
regeneriert werden. Dazu müssen 7 % (v/v) zu der verbliebenen Aktivierungslösung hinzugefügt werden.
4. SUBSTRAT-LÖSUNGSMITTEL
Vorbereitung
Das Substratlösungsmittel ist gebrauchsfertig. Es enthält : Pufferlösung, pH 6,7 ± 0,5 ; Additive, die in den eingesetzten Konzentrationen ungefährlich
und für eine optimale Leistung erforderlich sind.
Gebrauch
Zur Vorbereitung der Anfärbelösung, wie in Abschnitt 6 beschrieben.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Das Substrat-Lösungsmittel bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Es ist bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Kitschachtel oder auf dem
Etikett des Substrat-Lösungsmittel Fläschchens stabil.
Das Substrat-Lösungsmittel verwerfen, wenn sich sein Aussehen verändert, z. B., wenn es durch mikrobielle Kontamination trübe wird.
Das Substrat-Lösungsmittel muss frei von Ausfällungen sein.
- 16 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
5. CHROMOGEN *
Vorbereitung
Das Chromogen ist gebrauchsfertig. Es enthält: TNBT (Tetranitroblau-Tetrazolium) in Dimethylformamid (DMF).
Gebrauch
Zur Vorbereitung der Entwicklungslösung, wie im Abschnitt 6 beschrieben.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Das Chromogen gekühlt (2 bis 8 °C). Es ist bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Kitschachtel oder auf dem Etikett desChromogenfläschchens
stabil.
6. ISO-CK SUBSTRAT *
Vorbereitung
Jedes Substratfläschchen enthält: Rinderalbumin, Glucose, ADP (Adenosin- 5’-Diphosphat), NADP (Nicotinamid Adenin-Dinukleotid- Phosphat),
Hexokinase (aus Bäckerhefe), Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (aus Bäckerhefe), PMS (Phenazin-Methosulfat), Zusätze, ungefährlich bei den
eingesetzten Konzentrationen, nötig für die optimale Durchführung.
Die Entwicklungslösung fern von Licht 20 Minuten vor der Verwendung vorbereiten (unmittelbar nach dem Starten der Migration).
Zum ISO-CK Substratfläschchen (1/2), 2 ml Substrat-Lösungsmittel zufügen. Das Fläschchen verschließen und vorsichtig mischen. Bei
Raumtemperatur stehen lassen. Unmittelbar vor Gebrauch 0,15 ml Chromogen zufügen und mischen.
Gebrauch
Zur Anfärbung der elektrophoretisch getrennten Kreatinkinase-Isoenzyme.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Das Substrat gekühlt lagern. Es ist bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Kitschachtel oder auf dem Etikett des Substratfläschchens stabil.
7. ISO CK/LD BLOCKIERLÖSUNG
Vorbereitung
Die Blockierlösung ist gebrauchsfertig. Sie enthält eine saure Lösung, pH ≈ 2.
Gebrauch
Zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion des Substrats nach der Inkubation des Gels für eine vorgegebene Zeit.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Blockierlösung kann bei Raumtemperatur oder gekühlt gelagert werden und ist bis zum angegebenen Verfallsdatum auf dem Fläschchen stabil.
8. ENTFÄRBELÖSUNG
Vorbereitung
Das Fläschchen der Entfärbe-Stammlösung muss auf 100 Liter mit destilliertem oder deionisiertem Wasser verdünnt werden. Es ist vorteilhaft, jeweils
nur 1 ml der Stammlösung auf 1 Liter zu verdünnen.
Nach Verdünnung enthält die Arbeitsentfärbelösung eine saure Lösung mit pH ≈ 2.
Gebrauch
Zum Spülen des Gels nach dem Einlesen.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Stammlösung der Entfärbelösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Etikett
des Entfärbelösungs-Fläschchen stabil. Die verdünnte Entfärbelösung ist bis zu einer Woche bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Flasche
stabil.
Die verdünnte Entfärbelösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z.B., wenn sie durch mikrobielle Kontamination trübe wird.
Kein Natriumazid zufügen.
Um mikrobielles Wachstum in der verdünnten Entfärbelösung bei Lagerung von mehr als einer Woche zu verhindern, sind 5 µl/dl ProClin 300 zu
zufügen.
Die mit ProClin versetzte, gebrauchsfertige Entfärbelösung ist in der verschlossenen Flasche bei Zimmertemperatur oder gekühlt bis zum
Verfallsdatum stabil, das auf der Verpackung oder auf den Flaschenetiketten angegeben ist.
9. APPLIKATOREN
Gebrauch
Applikatoren für den einmaligen Gebrauch zum Auftrag der Probe.
Lagerung
Die Applikatoren an einem trockenen Platz bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern.
10. FILTERPAPIERE – DÜNN
Gebrauch
Für den einmaligen Gebrauch, um überschüssige Feuchtigkeit von der Geloberfläche vor der Probenaufgabe.
Lagerung
dünnes Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.
11. DICKES FILTERPAPIER
Gebrauch
Filterpapier für den einmaligen Gebrauch zum Abblotten von überschüssiger Blockierlösung von der Geloberfläche vor dem Trocknen.
Lagerung
dickes Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.
* HINWEIS: Während des Transports können, die Aktivierungslösung, das Chromogen, und das ISO-CK Substrat ungekühlt bei (15 – 30 °C) ohne
nachteiligen Effekt für die Durchführung für 15 Tage aufbewahrt werden.
- 17 -
BENÖTIGTE REAGENZIEN (NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
PHYSIOLOGISCHE KOCHSALZLÖSUNG
Vorbereitung
Stellen Sie eine 0,15 M (0,9 g/dl) NaCl-Lösung in destilliertem oder deionisiertem Wasser her.
Gebrauch
Zur Verdünnung der Serumproben, um ein CK-Gesamtaktivität von 750 IU/l einzustellen, wenn die Aktivität > 750 IU/l ist.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Die Lösung nach drei Monaten verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z.B., wenn sie durch mikrobielle
Kontamination trübe wird. Für längere Lagerperioden, Natriumazid zugeben, 0,1 g/dl.
HINWEISE :
Die zur Validierung der Reagenzien durchgeführten Proben zeigten, dass für die verschiedenen Lösungen und bei Anwendung einer angepassten
Ausrüstung für das Rekonstitutionsvolumen eine Abweichung von ± 5 % am Endvolumen keine negative Auswirkung auf die Analyse hat.
Das zur Rekonstitution der Lösungen eingesetzte destillierte oder deionisierte Wasser muss frei von Bakterienproliferation und Schimmelpilz sein
(benutzen Sie einen 0.22 µm Filter) und einen Widerstand von über 10 Megaohm x cm haben.
NICHT MITGELIEFERTE ABER BENÖTIGTE AUSRÜSTUNG UND ZUBEHÖR
Netzgerät: MG 300 SEBIA, Art.-Nr. 1302 oder MG 500 SEBIA, Art.-Nr. 1303.
HYDRAGEL K20 APPLIKATOR SEBIA, Art.-Nr. 1409, enthält den HYDRAGEL K20 Applikatorträger.
HYDRAGEL ENZ K20 ZUBEHÖR Kit, SEBIA, Art.-Nr. 1422, enthält den HYDRAGEL K20 Schablonenträger und die Reagenzauftragsschablone R1.
Feuchte Kammer, Art.-Nr. 1270.
Elektrophorese Kammer: K20 SEBIA, Art.-Nr. 1400.
Behälter und Gelhalter zum Abarbeiten der Gele: HYDRAGEL K20 Zubehörkit SEBIA, Art.-Nr. 1420.
Pipetten: 10 µl, 200 µl und 5 ml.
Inkubator-Trockner: IS 80 SEBIA, Art.-Nr. 1430.
Densitometer / Scanner, für das Scannen von 82 x 51 mm Gelplatten ausgelegt : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA oder PHORESIS-Software für Flachbettscanner. Siehe die Herstelleranweisungen bezüglich der Bedienung und den Kalibrierverfahren.
10. Qualitätskontrollmaterialien (Enzymkontrolle SEBIA, Art.-Nr. 4790).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
ANALYSENPROBEN
Probensammlung und Lagerung
Für die Analyse werden frische Serumproben empfohlen. Die Proben sollten gemäß den etablierten Regeln zur Probenentnahme für klinische Proben
gewonnen werden. Die Proben sollten nach der Entnahme sobald wie möglich bei 2 – 8 °C gekühlt und können so für bis zu einer Woche aufbewahrt
werden.
Probenvorbereitung
500 µl der Serumprobe mit 5 µl Aktivierungslösung mischen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Serumprobe mit physiologischer
Kochsalzlösung verdünnen, um eine CK-Gesamtaktivität von ungefähr 750 IU/l einzustellen, wenn die CK-Aktivität > 750 IU/l beträgt.
Nicht verwendbare Proben
Keine hämolysierten Proben verwenden. Die Enzyme der Erythrozyten könnten mit der Nachweisreaktion interferieren.
Keine Proben mit Inhibitoren der CK-Enzymaktivität für die Analyse einsetzen, wie EDTA, Citrat, Fluoride oder Jodazetat.
PROZEDUR
I. MIGRATIONSSCHRITT
1. Den HYDRAGEL K20 Applikatorträger auf eine flache Oberfläche legen (Abb. 1) und den Applikatorträger hochklappen.
2. 120 µl destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser auf das untere Drittel des Rahmens geben, der auf dem HYDRAGEL K20
Applikatorträger aufgedruckt ist.
3. Das HYDRAGEL Agarosegel auspacken.
4. Ein dünnes Filterpapier schnell und gleichmäßig auf die Oberfläche legen um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Das Filterpapier sofort
wieder entfernen.
WARNUNG: Das Filterpapier nicht zu lange auf dem Gel lassen, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.
5. Das Gel (Gelseite nach oben) mit seinem Rand gegen den Halter am Boden des aufgedruckten Rahmens (Abb. 2) legen.
6. Das Gel biegen und auf den Wasservorrat legen (Abb. 2). Sicherstellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, dass sich Wasser
unter dem gesamten Gel befindet, und dass das Gel sich in einer Linie mit dem aufgedruckten Rahmen befindet.
7. Den Applikatorträger bis zur mittleren Position (mit hochgestelltem Hebel) herabsenken.
8. Einen Applikator so auf eine flache Oberfläche legen, dass die Nummern (Vertiefungen) nach oben zeigen (Abb. 3).
- 18 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
9. In die Vertiefungen des Applikators je 10 µl Probe auftragen: Den Applikator innerhalb von 2 Minuten beladen.
- Den Applikator ohne Verzögerung verwenden.
- Bei späterem Gebrauch (bis zu 8 Stunden) den Applikator in der feuchten Kammer mit den Zähnen nach oben platzieren (die Applikatoren
am Zahnschutzrahmen anfassen). Die gesamte Kammer muss gekühlt aufbewahrt werden und das Gel soll erst unmittelbar vor Gebrauch
auf dem HYDRAGEL K20 Applikatorträger eingesetzt werden.
Für weitere Details siehe: Bedienungsanleitung „Feuchte-Kammer“
10. Den Schutzrahmen für die Applikatorzähne abnehmen.
11. Den Applikator mit den Proben in die Position 6 auf dem Applikatorträger einlegen.
WICHTIG: Die aufgedruckten Nummern auf den Applikatoren müssen zum Bediener zeigen (Abb. 4).
12. Den Applikatorträger durch Drehen des Hebels absenken, sodass der Applikator die Geloberfläche berührt. DEN TRÄGER NICHT
VOLLSTÄNDIG HERUNTERDRÜCKEN.
13. Nach 10 Minuten den Applikator durch Drehen des Hebels hochfahren und verwerfen.
14. Das Gel in eine passende Elektrophoresekammer mit den Proben zur kathodischen Seite überführen. Beim Verwenden der SEBIA K20
Kammer, das HYDRAGEL auf die Brücke mit der Gelseite nach unten platzieren. Das Gel sollte an jeder Seite ungefähr 1 cm in den Puffer
eintauchen.
Für weitere Details siehe Bedienungsanleitung der Kammer K20.
15. Die Kammer mit dem Netzgerät verbinden.
|
|
|
|
|
|
MIGRATIONS-BEDINGUNGEN
Puffervolumen pro Kammer
Gesamtpuffervolumen
Migrationszeit
Konstante Spannung
Einschaltstrom (ein Gel)
|
|
|
|
|
|
SEBIA K20
150 ml
300 ml
20 Minuten
80 V
10 ± 2 mA
|
|
|
|
|
|
16. Nach der Migration, den Stromfluss in der Kammer unterbrechen und das Gel entfernen.
II. ANFÄRBUNG
WICHTIG : Es wird empfohlen, den Inkubator-Trockner vor dem Einstellen des K20-Maskenträgers mit dem zu inkubierenden Gel für 5 Minuten
bei der nachstehend angegebenen Temperatur vorzuheizen.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Den Schablonenhalter auf eine flache Oberfläche legen (Abb. 5).
120 µL destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser auf das untere Drittel des Rahmens geben, der auf dem Schablonenträger aufgedruckt ist.
Das Gel (Gelseite nach oben) mit seinem Rand gegen den Halter am Boden des aufgedruckten Rahmens (Abb. 6) positionieren.
Das Gel biegen und in den Wasservorrat hineindrücken (Abb. 6). Sicherstellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, dass sich
Wasser unter dem gesamten Gel befindet, und dass das Gel sich in einer Linie mit dem aufgedrucktem Rahmen befindet.
Die Auftragungsschablone R1 wie folgt auf der Schablonenführung aufsetzen (Abb. 7):
- Die Führung für die Auftragungsschablone auf den Haltestiften positionieren.
- Die Verschlussklappe auf die Schablone halten und die Aussparungen in die Führungsmarkierung legen.
Nachdem das Chromogen und das Substrat in einem Gläschen angemischt wurden, 2 ml ISO-CK-Substratlösung, wie folgt auftragen (Abb. 8):
- Die Pipette senkrecht halten.
- Die Pipettenspitze leicht in das Loch der Schablone pressen.
- Vorsichtig das Reagenz kontinuierlich ohne Luftblasen zu erzeugen unter die Schablone pipettieren.
Die Abdeckung des Schablonenhalters schließen (Abb. 9).
Den Schablonenhalter in den Inkubationstrockner legen und bei 37 °C für 30 Minuten trocknen.
III. SUBSTRAT ELIMINIERUNG UND AUFTRAG VON BLOCKIERLÖSUNG
1. Nach der Inkubation, den Schablonenträger aus dem Inkubator-Trockner entfernen und auf eine flache Oberfläche legen.
2. Die Abdeckung öffnen.
3. Die verbliebene Substratlösung entfernen:
- Die Pipette senkrecht halten und die Pipette leicht in die Vertiefung der Schablone pressen.
- Vorsichtig und kontinuierlich das Substrat absaugen.
4. Mit einer Pipette 2 mL der Blockierlösung zugeben. Keine Luftblasen erzeugen.
5. Die Abdeckung des Schablonenträgers verschließen.
6. Den Schablonenträger für 10 Minuten in den Inkubator-Trockner bei 37 °C legen.
IV. ELIMINIERUNG DER BLOCKIERLÖSUNG, FILTERPAPIEREINSATZ UND GELTROCKNUNG
1. Den Schablonenträger aus dem Inkubator-Trockner nehmen und die Abdeckung öffnen.
2. Die Blockierlösung entfernen (Siehe SUBSTRAT ELIMINIERUNG).
3. Die Schablone entfernen:
- Die Schablone an der Lasche anfassen.
- Die Schablone anheben und entfernen.
4. Das Gel auf der Platte des Schablonenhalters belassen.
5. Ein dickes Filterpapier auf das Gel legen:
- Das Filterpapier im Winkel von 45° neigen.
- Den unteren Rand des Filterpapiers am Rand des Gels ausrichten.
- Das Filterpapier auf das Gel herunterlassen.
- Die gesamte Oberfläche des Filterpapiers andrücken, sodass ein perfektes Anliegen sichergestellt ist.
- 19 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
6.
7.
8.
9.
10.
Die Abdeckung des Schablonenträgers schließen.
Den Schablonenträger für 3 Minuten bei 37 °C in den Inkubator-Trockner legen.
Nach 3 Minuten den Schablonenträger aus dem Inkubator-Trockner herausnehmen und die Abdeckung öffnen.
Das Filterpapier entfernen und das Gel bei 51 °C trocknen.
Die Schablone mit destilliertem Wasser oder Alkohol spülen und sie gründlich mit weichem Filterpapier trocknen. Vor erneutem Gebrauch
sicherstellen, dass die Schablone vollständig trocken ist.
V. GEL EINLESEN
1. Die Rückseite des getrockneten Gels mit einem feuchten saugfähigem Papier reinigen.
2. Bei Bedarf sämtliche Fussel vom Gel mit saugfähigem (soft) Papier entfernen.
3. Mit einem Densitometer / Scanner unter Auswahl des geeigneten Scanprogramms scannen.
VI. DAS GEL ABWASCHEN
Nach dem Einlesen das Gel abspülen um die Haltbarkeit des Elektropherogramms zu verbessern (zur Vermeidung einer Hintergrundfärbung).
1. Das Gel für 10 Minuten in Entfärbelösung eintauchen.
2. Das Gel mit Heißluft bei 51 °C trocknen.
ERGEBNISSE
Qualitätskontrolle
Es wird empfohlen bei jedem Lauf eine Serumkontrolle (wie Enzymkontrolle SEBIA, ART.-Nr. 4790) mitlaufen zu lassen.
Wertes
Wenn die Probe keine MB- oder BB-Fraktion enthält ist ein Einlesen nicht erforderlich.
Humanes Serum kann drei Fraktionen zeigen:
• die MM-Fraktion, überwiegt in normalem humanen Serum, mit einer sehr geringen Beweglichkeit (Gamma Fraktion),
• die MB-Fraktion mit der mittleren Mobilität (Beta-Fraktion),
• die BB-Fraktion mit der höchsten Mobilität (Alpha-1-Fraktion).
Normalwerte (cf. LITERATUR: 4, 9 und 20):
CK MM
CK-MB
CK-MB
CK BB
:
:
:
:
97 bis 100 %
0 bis 3 % bei einer CK-Aktivität zwischen 15 und 500 IU/l
0 bis 4 % bei einer CK-Aktivität von mehr als 500 IU/l
0%
Es wird jedem Labor empfohlen seine eigenen Normalwerte zu bestimmen.
Interpretation
• Die MB-Fraktion erhöht sich nach 4 bis 8 Stunden nach dem Herzinfarkt.
• BB-Fraktion ist hauptsächlich bei einigen Störungen und Verletzungen des Nervensystems erhöht.
• Die Gesamtkreatinkinase (hauptsächlich MM) ist in folgenden Fällen erhöht:
- Verletzungen durch chirurgische Eingriffe
- intensive körperliche Anstrengungen
- muskuläre Dystrophie
- Myopathie
- Polymyositis
- Hypothyroidismus
- Arzneimittel, intramuskuläre Injektionen.
• Der Makro CK (Typ 1) ist ein Komplex aus CK und Immunoglobulinen. Er ist zwischen der MM- und MB-Fraktion nachweisbar (Abb. 10).
• Die mitochondriale CK (Typ 2) ist auf der kathodischen Seite der MM-Fraktion nachweisbar (Abb. 10).
Fehlersuche
Bitte rufen Sie den Technischen Service von SEBIA an, wenn der Test nicht richtig funktioniert, obwohl die Anweisungen zur Vorbereitung, Lagerung
und zur Durchführung sorgfältig beachtet wurden.
Datensicherheitsblätter sowie Informationen zur Abfallentsorgung sind bei SEBIA GmbH, Fulda zu erfragen.
CHARAKTERISTISCHE DATEN
Für sämtliche densitometrischen Messungen wurde das HYRYS Densitometer von SEBIA eingesetzt.
Die individuellen Werte, die mittleren Standardabweichungen (SD) und Korrellationskoeffizienten (VK) sind weiter unten aufgeführt. Ingesamt zeigen die
Daten unter allen geprüften Gesichtspunkten eine sehr gute Reproduzierbarkeit: Der mittlere Korrelationskoeffizient betrug 3,2 %.
Reproduzierbarkeit innerhalb eines Gels
Drei verschiedenene Serumproben wurden mit der HYDRAGEL ISO-CK K20 Prozedur elektrophoretisch getrennt. Die Proben waren: A und B, Seren
mit erhöhtem MB ; C, normales Serum.
Jede Probe wurde auf allen sieben Laufspuren auf Gelen von der gleichen Charge aufgetragen.
Die Elektropherogramme wurden densitometrisch ausgewertet und die folgende Tabelle zeigt den Mittelwert, die Standardabweichung und den
Korrellationkoeffizienten für jede CK-Fraktion (MM und MB) und für jede Probe.
- 20 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
PARAMETER
Probe A
MITTELWERT (%)
SD
VK (%)
Probe B
MITTELWERT (%)
SD
VK (%)
Probe C
MITTELWERT (%)
SD
VK (%)
MB
MM
14,1
0,3
2,2
85,9
0,3
0,4
2,2
0,1
6,5
97,8
0,1
0,1
11,0
0,2
1,4
Reproduzierbarkeit zwischen Gelen
89,0
0,2
0,2
Sechs unterschiedliche Serumproben und die Enzymkontrolle von Sebia wurden mit der HYDRAGEL ISO-CK K20 Prozedur jeweils auf 10 Gelen
derselben Charge analysiert. Die mittleren Korrelationskoeffizienten, Standardabweichungen und Korrelationskoeffizienten (n = 10) wurden für jede
Serumprobe und für jede CK-Fraktion berechnet. Die Ergebnisse stimmten im Grunde für alle Proben überein. Die folgende Tabelle zeigt Wertebereiche
für die Standardabweichungen und die Korrelationskoeffizienten, die alle Proben repräsentieren und den mittleren Korrelationskoeffizienten von den
zusammengefassten Korrelationskoeffizienten aller Proben (n = 10).
|
|
|
|
|
|
|
|
CK-FRAKTION
MM
MB
BB
Genauigkeit - Vergleichsstudie
SD
0,3 - 1,3
0,1 - 1,1
1,0
|
|
|
|
|
|
|
|
CV (%)
0,3 - 2,4
3,0 - 10,0
3,6
MITTLERER CV (%)
1,0
6,5
3,6
|
|
|
|
Dreißig (30) verschiedene Serumproben (normale and pathologische) wurden mit dem HYDRAGEL ISO-CK K20 Kit und einem weiteren kommerziell
erhältlichen Test zur elektrophoretischen Bestimmung der Kreatinkinase-Isoenzyme analysiert. Bei der visuellen Auswertung der CK-Isoenzyme
stimmten beide Tests perfekt überein. Die Ergebnisse der linearen Regressionsanalyse von den densitometrischen Werten der MB- und der MMFraktionen (n = 30) sind weiter unten aufgeführt.
|
|
|
|
PARAMETER
MB Fraktion
MM Fraktion
y = SEBIA Werte
|
|
|
|
Korrelation
Koeffizient
0,988
0,988
|
|
|
|
y-Achsenabschnitt
- 0,102
0,749
|
|
|
|
Steigung
0,993
0,993
|
|
|
|
Bereich der %-Werte
(Test von SEBIA)
0,0 – 14,4
85,6 – 100,0
|
|
|
|
Sensitivität
Eine pathologische Serumprobe mit einer MB-Fraktion (Aktivität: 40 IU/l) wurde seriell verdünnt und die Verdünnung mit der HYDRAGEL ISO-CK K20
Prozedur elektrophoretisch getrennt. Nach der Densitometrie ; betrug die niedrigste nachweisbare Aktivität einer MB-Fraktion 2,5 IU/l.
Linearität
Es wurden serielle Verdünnungen einer Probe, die MM- und MB-Fraktionen enthielt, mit einer CK-Gesamtaktivität zwischen 750 IU/l bis 20 IU/l
analysiert. Das System war im gesamten getesteten Bereich linear.
- 21 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
Abbott LB, Van Lente F, 1985. Procedure for characterization of creatine kinase variants on agarose electrophoretograms. Clin Chem, 31, 3 : 445.
Anido VA, Conn RB, Mengoli HF, Anido G, 1974. Diagnostic efficacy of myocardial creatine phosphokinase using polyacrylamide disk gel electrophoresis. Am J Clin Pathol, 61 : 599.
Cawley LP, 1969. Electrophoresis and immunoelectrophoresis. Little, Brown and Company, Boston.
Christenson RH, Azzazy HME, 1998. Biochemical markers of the acute coronary syndromes. Clin Chem, 44 : 1855.
Doran GR, Wilkinson JH, 1975. The origin of elevated activities of creatine kinase and other enzymes in the sera of patients with myxedema. Clin
Chim Acta, 62 : 203.
Dubo H, Park DC, Pennington RJT, Kalbag RM, Walton JN, 1967. Serum-creatine-kinase in cases of stroke, head injury and meningitis. Lancet, 2 : 743.
Jockers-Wretou E, Pfleiderer G, 1975. Quantitation of creatine kinase isoenzymes in human tissues and sera by an immunological method. Clin
Chim Acta, 58 : 223.
Kachmar JF, Moss DW: Enzymes. In Fundamentals of Clinical Chemistry. NW Tietz, Editor, Saunders, Philadelphia, 1976, pp 652-660.
Keffer JH, 1996. Myocardial markers of injury. Clin Chem, 105, 3 : 305.
King JO, Zapf P, 1972. A review of the value of creatine phosphokinase estimations in clinical medicine. Med J Aust, 1 : 699.
Konttinen A, Somer H, 1973. Specificity of serum creatine kinase isoenzymes in diagnosis of acute myocardial infarction. Br Med J, 1, 386.
Konttinen A, Somer H, Auvinen S, 1974. Serum enzymes and isoenzymes. Extrapulmonary sources in acute pulmonary embolism. Arch Intern Med,
133 : 243.
LaFair JS, Myerson RM, 1968. Alcoholic myopathy. Arch Intern Med, 122 : 417.
Mair J, Morandell D, Genser N, Lechleitner P, Dienstl F, Puschendorf B, 1995. Equivalent early sensitivities of myoglobin, creatine kinase MB mass,
creatine kinase isoform ratios, and cardiac troponins I and T for acute myocardial infarction. Clin Chem, 41, 9 : 1266.
Morin LG, 1977. Creatine kinase : stability, inactivation, reactivation. Clin Chem, 23, 4 : 646.
Nealon DA, Henderson AR, 1975. Measurement of brain-specific creatine kinase isoenzyme activity in serum. Clin Chem, 21 : 1663.
Rao PS, Mueller HS, 1976. Evaluation of the chemical activation procedure (Rao’s method) for the measurement of the MB isoenzyme of creatine
kinase. Clin Chem, 22 : 932.
Rock RC, Dreskin R, Kickler T, Wimsatt T, 1975. Creatine kinase isoenzymes in serum of patients with Reye’s syndrome. Clin Chim Acta, 62 : 159.
Roe CR, Limbird LE, Wagner GS, Nerenberg ST, 1972. Combined isoenzyme analysis in the diagnosis of myocardial injury : Application of electrophoretic methods for the detection and quantitation of the creatine phosphokinase MB isoenzyme. J Lab Clin Med, 80 : 577.
Thompson WG, Mahr RG, Yohannan WS, Pincus MR, 1988. Use of creatine kinase MB isoenzyme for diagnosing Myocardial infarction when total
creatine kinase is high. Clin Chem, 34, 11 : 2208.
Vassella F, Richterich R, Rossi E, 1965. The diagnostic value of serum creatine kinase in neuromuscular and muscular disease. Pediatrics, 35 : 322.
Vincent WR, Rapaport E, 1965. Serum creatine phosphokinase in the diagnosis of acute myocardial infarction. Am J Cardiol, 15 : 17.
Weime RJ, 1965. Agar Gel Electrophoresis, Elsevier, Amsterdam.
Wolf PL, Kearns T, Neuhoff J, Lauridson J, 1974. Identification of CPK isoenzyme MB in myocardial infarction. Lab Med, 5 : 48.
Young DS, Pestaner LC, Gibberman V. Clin Chem, 21 : 1D (1975).
Zimmerman HJ, Henry JB: Clinical Enzymology. In Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 16th ed., JB Henry, Editor, Saunders, Philadelphia, 1979, pp 365-368.
Zsigmond EK, Starkweather WH, 1963. Abnormal serum and muscle creatine phosphokinase (CPK) isoenzyme pattern in a family with malignant
hyperthermia. Anaesthesis, 22 : 16.
Zsigmond EK, Starkweather WH, Duboff GS, Flynn KA, 1972. Elevated serum creatine phosphokinase activity in a family with malignant hyperpyrexia. Anesth analg, 51 : 827.
Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. ImpactInternat, Septembre 1986.
- 120 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 1
Figure 2
1 2
3 4
5 6
7
Figure 3
Figure 4
1 2
3 4
5 6
7
1 2 3
4 5 6
7
7
5 6
3 4
1 2
Figure 5
Figure 6
1 2
3 4
5 6
7
- 121 -
HYDRAGEL ISO-CK K20 - 2012/03
SCHÉMAS / FIGURES
Figure 7
Figure 8
Figure 9
Figure 10
Fraction identification
BB
MB
Macro-CK Type 1
MM
Application point
Mitochondrial (Macro-CK Type 2)
- 122 -
Document
Kategorie
Gesundheitswesen
Seitenansichten
15
Dateigröße
265 KB
Tags
1/--Seiten
melden