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Das Membranpotential

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Was zum Geier ist
Elektrophysiology
???
Jana Liewald
AG Gottschalk
Themenübersicht
1. Ein wenig Theorie
2. Ein Blick in die Geschichte
3. Elektrophysiologie im Allgemeinen
•
Die Praxis: Wie funktioneren elektropyhsiologische Messungen?
•
Was sagen mir elektropyhsiologische Abbildungen in Publikationen?
4. Elektrophysiologie am Modellorganismus C. elegans
5. Optogenetik
1. Ein wenig Theorie
Keine Panik!
Was ist Elektrophysiologie?
= Teilbereich der Neurophysiologie
- Messung von …
1. Membranpotentialen
2. Ionenströmen über Zellmembranen
3. elektro-chemischer Signalübertragung von Nerven/Muskeln
4. Charakterisierung von Rezeptoren/Kanälen
© http://www.liminalmusic.org/
© http://mindblog.dericbownds.net
Das Membranpotential (Ruhepotential)
- an der Zellmembran liegt eine elektrische Spannung vor
← beide Seiten weisen unterschiedliche Ionen- Konzentrationen auf
¾ ∅ -60 bis -90mV (innen negativ)
¾ beeinflußt von Ionenpumpen, -kanälen etc.
-
extrazellulär: viele Na+ & Cl-
-
intrazellulär: viele K+ & große organische Anionen
(v.a. negativ geladene Proteine)
450 Kationen
568 Anionen
Riesenaxon
Tintenfisch
[mmol/l]
innen: -118
außen: -100
460 Kationen
560 Anionen
© Ulrich Helmich
Das Membranpotential bei Vertebraten
Das Membranpotential
Welche Faktoren spielen eine wichtige Rolle?
1.elektrochemisches K+-Gleichgewicht
2.Na+/K+-Pumpe
1. extrazellulär: wenig K+; intrazellulär: viel K+
© Ulrich Helmich
-spezielle Membranporen, durch die K+ aufgrund Konzentrationsgefälle nach außen diffundieren:
Kalium-Sickerkanäle
-mit jedem K+, das nach außen diffundiert, wird…
1)
K+-Konzentrationsgradient kleiner
2) 1 positive Ladung nach außen transportiert ⇒ Cytosol wird negativer
- je negativer das Cytosol, umso stärker werden die (positiven) K+ innen festgehalten
elektrochemischen (K+-) Gleichgewicht:
= Gleichgewichtszustand zwischen 2 Kräften
Kraft 1 = K+-Konzentrationsgradient (chemisches Potential)
Kraft 2 = Ladungsdifferenz an der Membran (elektrisches Potential)
→ keine K+ diffundieren mehr nach außen
Das Membranpotential
Welche Faktoren spielen eine wichtige Rolle?
1.elektrochemisches K+-Gleichgewicht
2.Na+/K+-Pumpe
2.
ATP-getriebener Carrier (>1/3 des im Ruhezustand verbrauchten ATP)
-transportiert 3 Na+ nach außen und 2 K+ nach innen gegen Konzentrationsgradient
- pro "Pumpzyklus„: 1 positive Ladung nach außen transportiert
→trägt zum Membranpotential bei
außen
Aufgabe:
-Membran ist nicht 100% „dicht“
-
einige Na+ gelangen in Zelle
-
für K+ ist die Membran ~25-50x durchlässiger
-jeweils Rücktransport gegen Konzentrationsgefälle
⇒Aufrechterhaltung des wichtigen Konzentrationsgradienten
innen
© Ulrich Helmich
2. Es war einmal…
ein Blick in die Geschichte
Kenneth Cole (USA) entwickelt die Voltage-Clamp-Technik
1930er: Entwicklung der Voltage-Clamp-Technik/Spannungsklemme durch Kenneth Cole
-
Zelle kann man als elektrischen Schaltkreis (Widerstände, Kapazitäten) darstellen
-
nutzte 2 Elektroden & Feedback-Regelkreis, um Membranpotential (voltage)
einer Zelle auf bestimmten Wert zu halten (engl. to clamp: festklemmen)
1. Elektrode: gibt Haltespannung (voltage) vor
2. Elektrode: zeichnet auftretende Ströme über Membran auf
⇒ Messung von Strömen an erregbaren Zellen (z.B. Nervenzellen)
⇒ mißt Summe aller Einzelströme durch Zellmembran (⇔ Auflösung einzelner Anteile nicht möglich)
© Dale Purves (1997) Neuroscience
Huxley & Hodgkin enwtickeln die Idee weiter…
- Huxley & Hodgkin: realisierten, daß zum Verständnis von Ionenströmen über
Zellmembranen es nötig ist, Unterschiede im Membranpotential zu eliminieren
- nutzten Voltage-Clamp-Messungen
Sir Andrew Huxley (UK)
Sir Alan Hodgkin (UK)
Tintenfische sind nicht nur zum Essen gut…
1936: Entdeckung von Riesenaxonen
Riesenaxone: Axone der Tintenfische (Kalmare)
- menschliches Axon: max. ∅ 0,001 - 0,02 mm
- Kalmar-Axon:
© http://en.academic.ru
max. ∅ 2 mm
Gemeiner Kalmar (Loligo vulgaris)
© UTMB
- nötig für schnelle Erregungsleitung, da ohne Myelinisierung
Myelinscheide
(Vertebraten)
Riesenaxon
„normales“ Axon
Huxley & Hodgkin forschen an Riesenaxonen
- Riesenaxone sind ideal für elektrophysiologische Arbeiten
← Elektroden können ins Lumen der Axone eingeführt werden (Voltage-Clamp-Technik)
→ große Fortschritte in Nervenzellforschung
- Huxley & Hodgkin studierten Aktionspotentiale an Riesenaxonen
- postulierten die Existenz von Ionenkanälen
- spannungsgeregelte Ionenkanäle ermöglichen Änderungen in der Membranleitfähigkeit
952: skizzierten die ionischen Ursachen von Aktionspotentialen
963: Nobelpreis
- ABER es gab keinen direkten Beweis für Ionenkanäle
Deutsche Wissenschaftler entwickeln Patch-Clamp-Technik
Problem: Hintergrundrauschen war weitaus größer war als Ströme über einzelne Kanäle
1970er: Neher & Sakmann (Göttingen) forschten an neuen Meßmethoden
Theorie: Messgeräte sprechen nur mit nötiger Empfindlichkeit an, wenn aus
Zellmembran ein kleines Areal isoliert wird (Membranfleck / „patch“)
→ 1-wenige Ionenkanäle isoliert
- setzen mit elektrisch leitenden Flüssigkeit gefüllte Glaspipette auf Muskelfaser auf
Problem: dichte Verbindung zwischen Glaspipette und Membran
1976: Messung von Einzelkanalströmen an neuromuskulärer Synapse
- Ströme im Picoampere-Bereich (10−12 Ampere)
© Moers
Erwin Neher
Bert Sakman
Deutsche Wissenschaftler entwickeln Patch-Clamp-Technik
Einige Jahre später: entdeckten durch Zufall, dass sich der elektrische
Widerstand deutlich (GΩ-Bereich) erhöhen ließ, wenn man in Glaspipette einen
Unterdruck erzeugt
→ Membranfleck wird angesaugt
1991: Nobelpreis für Medizin für Neher & Sakman
3a. Die Praxis…
Die Praxis: Wie funktioneren elektropyhsiologische Messungen?
1. Spitze einer feinen Glaselektrode wird in Zelle eingestochen (oder aufgesetzt)
2. Verstärker mißt Spannungsdifferenz zwischen intrazellulärer Mikroelektrode &
extrazellulärer Referenzelektrode
= Membranpotential
3. negative feedback-Mechanismus:
- Membranpotential wird mit Haltepotential verglichen
= vorgegeben durch Experimentator (z.B. -60mV)
- falls sie sich unterscheiden wird zum Ausgleich ein Strom injiziert
→ Membranpotential jeder Zelle ist “clamped” auf denselben Wert
4. falls Ionen über die Membran strömen (z.B. Kanalöffnung):
→ Strom muß injiziert werden, um Membranpotential weiter konstant zu halten
⇒ Strom ist äquivalent zum Ionenstrom über die Membran
inverted microscope
perfusion system
camera
electrode
computer
amplifier
anti-vibration table
Faraday cage
micromanipulators
recording chamber
Das Setup: Die Mikroelektrode (Patch-Pipette)
= Glaspipette mit einer sehr feinen Öffnung (∅ 0.1-1 µm)
- werden mit einem „Puller“ aus Glaskapillaren selbst hergestellt
- das wichtigste Werkzeug des Elektrophysiologen
© Wikipedia
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme
The practical side...
Test pulse
Ohmsches Gesetz für elektr. Leiter:
I=U/R
I: Strom [Ampere]
U: Spannung [Volt]
R: Widerstand [Ohm]
Pipette resistance: ~5 MOhm
Sealing
Achieving a gigaseal
~20 MOhm
Whole-cell mode
1 GOhm
Gigaseal
~1000 MOhm
= 1 GOhm
Die beliebtesten Versuchsobjekte des Elektrophysiologen
1. Transfizierte Eier des Südafrikanischen Krallenforsches (Xenopus laevis)
Two electrode voltage clamp (TEVC)
© Institute of Physiology Tübingen
Die beliebtesten Versuchsobjekte der Elektrophysiologen
2. Zellkultur: transfizierte HEK 293 Zellen
- spezielle Zellinie: human embryonic kidney
- stammt ursprünglich von humanen embryonalen Nierenzellen
- Vorteile: unproblematisches Wachstum & einfache Transfektion
- werden in Forschung vielfach benutzt
Die beliebtesten Versuchsobjekte der Elektrophysiologen
3. Isolierte Zellen (z.B. glatte Muskelzellen)
4. Gehirnschnitte
- Studien an einzelnen Neuronen oder Populationen von Neuronen
5. Caenorhabditis elegans
3b. Ephys in Publikationen…
A) intracellular recording:
sehr feine Mikroelektrode wird in Zelle gestochen
Spitze ∅ < 0.1 µm
B) patch-clamp recording:
Spitze ∅ > 1µm
Anwendung: kleine Zellen, Einzelkanalmessung
Mikroelektrode
an einer HEK Zelle
Die 4 Konfigurationen des Patch-clamp
Cell-attached patch
Ionenkanal
Whole-cell recording
Pipette
Zellmembran
Cytosol
Inside-out patch
Outside-out patch
Die 4 Konfigurationen des Patch-clamp
a) Cell-attached patch
- Mikroelektrode wird auf Zellmembran aufgesetzt
Froschmuskelzelle,
die über Pipette angesaugt wird
- leichter Unterdruck
→ enger Kontakt zwischen Pipette und Zellmembran
=> extrazelluläre Aufzeichnungen von Ionenkanälen innerhalb des Patch
b) Whole-cell mode
- Unterdruck verstärken
→ Patch in Pipettenspitze wird herausgerissen
→ Pipette ist mit der Zelle verbunden
⇒ intrazelluläre Aufzeichnungen von Ionenströmen über die gesamte Zellmembran
Die 4 Konfigurationen des Patch-clamp
c) Inside-out patch
- ausgehend von cell-attached mode wird Mikroelektrode von Zelle weggezogen
- Patch wird aus Zelle herausgerissen
- Innenseite der Zellmebran ist zur Badlösung hin gerichtet
- Eigenschaften eines Kanals kann pharmakologisch untersucht werden, indem
Testsubstanzen in Badlösung gegeben werden
⇒ Austesten intrazellulärer Modulatoren (e.g. Ca2+, ATP)
d) Outside-out patch
- ausgehend vom whole-cell mode wird Mikroelektrode von Zelle weggezogen
- Patch wird aus Zelle herausgerissen
- Außenseite der Zellmebran ist zur Badlösung hin gerichtet
⇒ Austesten extrazellulärer Agonisten
Abbildungen in Publikationen
Statistik
Means ± SEM
Originalspur
**
⇒
inward current [pA]
1200
1000
800
600
400
200
7
7
mutant
wild type
n
0
Strom-Spannungs-Beziehungen
current-voltage relationships
3
3
2
2
Strom-Spannungs-Beziehungen
Means ± SEM
1
0
0
-1
-1
0
2000
4000
time (ms)
Kontrolle
⇒
1
I (nA)
I (µA)
I (µA)
3000
2000
1000
0
-100
0
2000
4000
time (ms)
nach Zugabe der Testsubstanz
-50
0
Vc (mV)
control
drug
50
4. Elektrophysiologie am Nematoden
Caenorhabditis elegans
© Goldstein lab
© Adam Hartley and Carolyn Marks
C. elegans – ein neurobiologischer Modellorganismus
- Nematode / Fadenwurm
- natürlicher Lebensraum: Boden gemäßigter Klimazonen
- einfacher Organimus, aber mit vielfältigem Nervensystem
- leicht in großer Zahl auf kleinem Raum zu halten
- genetisch leicht manipulierbar
- Genom ist komplett sequenziert
- exakt 302 Neuronen
⇔Drosophila: 200000
⇔ Mensch: Milliarden (~1011)
- Morphologie & Position jedes einzelnen Neurons ist bekannt
- alle synaptischen Verbindungen wurden per EM aufgeklärt
⇒ Verschaltung des gesamten Nervensystems ist bekannt
Das Problem: Der Wurm ist verdammt klein
C. elegans: ~1000x80 µm
Die Präparation
Kleber
Nervenstrang
Muskelzellen
© J. Richmond
Elektrophysiologie - Stimulationstypen
cholinergic
cholinergic
motoneuron
motoneuron
b) stimulation via
GABAergic
GABAergic
photoactivation
motoneuron
a) electrical
a) drug
b) electrical
motoneuron
of ChR2
stimulation
application
stimulation
nerve
nerve
cord
cord
excitatory NMJ
excitatory NMJ
muscle cell
muscle cell
muscle arms
muscle arms
inhibitory NMJ
inhibitory NMJ
patch pipette
patch pipette
5. Optogenetik: „Let there be light!“
© K. Deisseroth
ChR2 – ein Kationen-Kanal der auf Licht reagiert
- aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii isoliertes Protein: Channelrhodopsin-2 (ChR2)
- reagiert auf Licht
- Kanal
© ChrGI
- spezifisch für Kationen
-benötigt Chromophor all-trans Retinal für Aktivität
O
H
all-trans retinal
- öffnet sich nach Bestrahlung mit Blaulicht (460nm)
→ Einstrom von Kationen
YFP
→ ermöglicht Depolarisation einer Zelle
© Flannery, Greenberg (2006) Neuron
ChR2 – ein Kationen-Kanal der auf blaues Licht reagiert
- in C. elegans kann ChR2 über spezifische Promotoren in bestimmten Zellen exprimiert werden:
z.B. Muskelzelle, cholinerge Neurone, GABAerge Neurone, etc.
- allein durch Bestrahlung des Wurms mit Blaulicht können…
- spezifisch diese Zellen stimuliert werden
- Neurotransmitter freigesetzt werden
The Motivation For Light-Activation
specific
cholinergic
motoneuron
stimulation via
photoactivation
GABAergic
motoneuron
nerve
cord
excitatory NMJ
muscle cell
muscle arms
inhibitory NMJ
patch pipette
-> recording ionic currents
Photoaktivierung von ChR2 führt zur Muskelkontraktion
Light on
Light off
with Retinal
100 pA
200ms
no Retinal
- ChR2 exprimiert in Muskelzellen von C. elegans
NpHR – eine Cl--Pumpe die auf gelbes Licht reagiert
NpHR:
• stammt aus Archaebakterium Natronomonas pharaonis
• lebt in stark alkalischen Sodaseen (pH: 11; Salzkonzentration: >300g/l)
• Cl--Pumpe
• wird aktiviert durch Gelblicht
→ führt zur Hyperpolarisation der Zelle
Kolbe et al. (2000) Science
© MPG
Photoaktivierung von NpHR führt zur Muskelrelaxation
NpHR in Muskelzellen:
NpHR in cholinergen Neuronen
neurons:
Optogenetik ermöglicht bidirektionale Kontrolle von Zellen
bidirektionale Kontrolle von Zellen durch Licht:
- Blaulicht → stimuliert ChR2 → Depolarisation → Stimulation der Zelle
- Gelblicht → stimuliert NpHr → Hyperpolarisation → Inhibition der Zelle
YFP
Video zu finden auf http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1165&sn=BID28
Danke
fürs
Zuhören !
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