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Damit zusammenwächst, was zusammengehört - Plastverarbeiter

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Biotech
Damit zusammenwächst,
was zusammengehört
Ligations-Kit sorgt für Tempo
Beim Ligieren werden DNA-Stränge mit offenen
Enden kovalent verknüpft. Und das kann dauern – üblicherweise fünf Stunden, oft wird über
Nacht ligiert. Ein neues Ligations-Kit setzt dem
langen Warten ein Ende.
L
igationen gehören zur täglichen Routine von Gülnihal
Yüksekdag, Doktorandin in der
Abteilung Bakteriologie am
Max von Pettenkofer-Institut in
München. Meistens werden dabei zwei unterschiedliche DNAStränge miteinander verknüpft,
wobei Ligasen die Bildung von
Phosphodiesterbindungen zwischen einer freien 5’-Phosphatgruppe und einer 3’-Hydroxylgruppe katalysieren und so
zum Beispiel zirkuläre DNA-Moleküle erzeugen. Die niedrigen
Temperaturen, die für den Ligationsvorgang empfohlen werden, sollen gewährleisten, dass
die Beweglichkeit der DNA-Moleküle vermindert wird und
komplementäre Enden der zu
verknüpfenden Fragmente hybridisieren. Das steigert zwar
einerseits die Effizienz der Ligation, andererseits reduziert es
aber die Wirkung des Katalysators. Normale Ligationen benötigen deshalb bei Raumtemperatur trotz Katalysator noch
zirka fünf Stunden. Wird bei
2: Das ZweiKomponentenLigationskit reduziert die Arbeitszeit von bis
zu zwei Tagen
auf maximal
zwei Stunden
16 °C ligiert, dauert der Vorgang über Nacht und bei 4 °C
bis zu 48 Stunden.
Diese Geduld muss Gülnihal
Yüksekdag inzwischen nicht
mehr aufbringen: „Wir können
es uns gar nicht mehr leisten,
erst am nächsten Tag zu erfahren, ob die Ligation erfolgreich
war, um mit der Transformation
fortzufahren.“ Der Schlüssel für
ein effizienteres Arbeiten ist ein
neues Ligations-Kit. „Mit dem
Alligator-Kit können wir innerhalb von 30 Minuten bis maximal zwei Stunden ligieren,
transformieren und anschließend die Bakterien ausplattieren“, so Yüksekdag. Die Ligation selbst dauert nur eine Minute (Bild 2)
Zwei Komponenten
im System
Das Kit besteht aus zwei Komponenten, die erst kurz vor der
Ligation gemischt werden: der
T4 DNA-Ligase und einem speziellen Puffersystem. Dabei ist
das Puffersystem so optimiert,
dass es überwiegend zu VektorInsert-Ligationen kommt und
weit weniger zu Vektorreligationen. „Somit wird das
Verhältnis an positiven, Inserttragenden Klonen im Vergleich
zu anderen Methoden deutlich
erhöht“, erklärt Yüksekdag.
Nach dem Mischen der beiden
Komponenten wird dieser Mix
kurz mit den zu ligierenden
DNA-Fragmenten inkubiert und
in chemisch-kompetente E-coliZellen mittels Hitzeschock
transformiert. Die darauf folgende Inkubation der transformierten Bakterien in SOC-Medium verbessert zusätzlich den
Transformationserfolg, ist aber
nicht zwingend nötig.
Bei genauer Durchführung
der Ligation können am nächsten Tag Kolonien gepikt und einem PCR-Schnelltest unterworfen werden. Als Ergebnis werden zum Teil weniger Klone als
mit anderen Methoden gefunden, ein positiver Klon ist aber
immer dabei. „In der Summe –
1: Beim Ligieren werden
DNA-Stränge miteinander
verknüpft
Gülnihal Yüksekdag:
„Mit dem AlligatorKit können wir innerhalb von 30 Minuten
bis maximal zwei
Stunden ligieren“
weniger Klone zusammen mit
einem hohen Prozentsatz positiver Klone – ergibt sich ein
sehr gutes Zeit/Leistungs-Verhältnis“, sagt Yüksekdag:
„Zwar sind es weniger Kolonien auf der Agarplatte, aber
was interessiert die Anzahl der
Kolonien, wenn unter diesen
stets der gewünschte Klon ist.“
So waren beispielsweise in
einem Experiment im PCRScreen unter zehn Kolonien
fünf Klone positiv, wovon zwei
sequenziert wurden und beide
fehlerfrei waren. In einem anderen Fall wurde von nur zwei
Kolonien eine fehlerfrei sequenziert.
[SW]
www.mvp.uni-muenchen.de
www.genaxxon.com
www.tau-competence.com
Infos
38
@Lab 602
@Lab Oktober 2004
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Kategorie
Gesundheitswesen
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