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2000-26 Was Sie schon lange über das HbA1c wissen wollten

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Schweiz Med Wochenschr 2000;130:993–1005
Peer reviewed article
Ch. Stettler, B. Mueller, P. Diem
Abteilung für Endokrinologie und
Diabetologie,
Universität Bern,
Inselspital, Bern
Fortbildung
Was Sie schon lange
über das HbA1c wissen wollten
Summary
What you always wanted to know
about HbA1c
Irreversible, nonenzymatic glycation of the
haemoglobin A beta chain leads to the formation of haemoglobin A1c (HbA1c), a stable
minor haemoglobin component with enhanced
electrophoretic mobility. The rate of formation
of HbA1c is directly proportional to the ambient glucose concentration. HbA1c is commonly
used to assess long-term blood glucose control
in patients with diabetes mellitus, because the
HbA1c value has been shown to predict the
risk for the development of many of the chronic complications in diabetes. There are currently four principal glycohaemoglobin assay
techniques (ion-exchange chromatography,
electrophoresis, affinity chromatography and
immunoassays) and over 20 methods that
measure different glycated products. The
ranges indicating good and poor glycaemic
control can vary markedly between different
assays. At the moment values differ between
methodologies and even between different
laboratories using the same methodology.
Optimal use of HbA1c testing requires standardisation. There is progress towards international standardisation and improved precision of HbA1c which will lead to all assays
reporting results in a standardised way.
Clinicians ordering HbA1c testing for their patients should be aware of the type of assay
method used, the reference interval, potential
assay interferences (e.g. haemoglobinopathies,
chronic alcohol ingestion, carbamylation products in uraemia) and assay performance. And
they should know that a variety of factors have
been shown to directly influence HbA1c values,
e.g. iron deficiency anaemia, chronic renal failure and shortened red blood cell life span.
Keywords: diabetes mellitus; haemoglobin A1c;
glycosylated haemoglobin
Zusammenfassung
Die irreversible, nicht-enzymatische «Glykosylierung» – oder besser Glykierung – der
β-Kette von Hämoglobin A führt zu Hämoglobin A1c (HbA1c), welches in der Elektrophorese oder der Ionenaustauschchromatographie schneller «wandert» als Hämoglobin A.
Das Ausmass der Glykierung ist abhängig
vom Blutglukosegehalt, das HbA1c korreliert
positiv mit der mittleren Blutglukosekonzentration der vorausgegangenen 6 bis 8 Wochen.
Die Bestimmung von HbA1c ist zum Goldstan-
dard in der Diabetes-Therapiekontrolle geworden. Es stehen dabei heute vier Messtechniken (Ionenaustauschchromatographie inklusive
HPLC, Elektrophorese, Affinitätschromatographie und Immunoassay) mit über 20 verschiedenen Bestimmungsmethoden zur Verfügung. Die «Normwerte» der verschiedenen
Assays variieren und mit ihnen auch die Referenzbereiche, welche eine gute bzw. eine unzureichende Stoffwechselkontrolle anzeigen.
HbA1c-Werte, die in verschiedenen Labors be-
Korrespondenz:
PD Dr. med. Peter Diem
Abteilung für Endokrinologie und Diabetologie
Universität Bern
Inselspital
CH-3010 Bern
993
Fortbildung
Schweiz Med Wochenschr 2000;130: Nr 26
stimmt wurden, sind nicht oder nur beschränkt
vergleichbar, selbst wenn die gleiche AssayMethode verwendet wurde. Unabdingbare
Voraussetzung für eine Möglichkeit zum Vergleich wäre eine internationale Standardisierung der verfügbaren HbA1c-Assays. Bestrebungen dazu sind im Gange. Jeder in die
Diabetesbehandlung involvierte Arzt sollte
sich deshalb vergegenwärtigen, mit welchem
Assay und mit welcher Präzision die HbA1cWerte bestimmt werden, welches der Referenzbereich für den verwendeten Assay ist und
welches mögliche Assay-Störfaktoren sind (pathologische Hämoglobine bei Hämoglobinopathien, modifizierte Hämoglobine, beispielsweise infolge von Carbamylierung bei Niereninsuffizienz oder bei chronischem Alkoholkonsum). Darüber hinaus sollte zur Kenntnis
genommen werden, dass zahlreiche Faktoren
den HbA1c-Wert direkt beeinflussen (beispielsweise Eisenmangel-Anämie, verkürzte Überlebensdauer der Erythrozyten).
Keywords: Diabetes mellitus; Hämoglobin A1c;
glykosyliertes Hämoglobin
Die Bestimmung des (prozentualen) Anteils von
Hämoglobin A1c (HbA1c) am gesamten Hämoglobin ist heute unbestritten der wichtigste
Parameter zur Beurteilung der Diabeteseinstellung und sollte bei jedem Diabetiker wenigstens zweimal pro Jahr erfolgen. Jeder in die
Diabetesbehandlung involvierte Arzt sollte
sich aber die folgenden Fragen stellen: Mit
welchem Assay werden die HbA1c-Werte bestimmt? Welches sind die Normwerte für den
verwendeten Assay? Welche Faktoren können
den Assay «stören» (pathologische Hämoglobine bei Hämoglobinopathien, modifizierte Hämoglobine, beispielsweise infolge von
Carbamylierung bei Niereninsuffizienz)? Welche Faktoren stören zwar nicht den Assay,
beeinflussen aber dennoch direkt den HbA1cWert (verkürzte Überlebensdauer der Erythrozyten, Anämie)? Müssen bei einem Diabetiker
das Hämoglobin, die Retikulozyten sowie die
Hämoglobin-Elektrophorese bestimmt werden, um HbA1c-Werte konklusiv beurteilen
zu können? Wie ist die Assay-Performance
(Präzision)? Dürfen HbA1c-Werte vom gleichen
Patienten, die in verschiedenen Labors mit der
gleichen Assay-Methode bestimmt wurden,
verglichen werden? In der folgenden Übersicht
findet sich eine Antwort auf diese Fragen.
Einleitung
Zur Geschichte des Glykohämoglobins (HbA1/HbA1c)
Normale Hämoglobine sind beim gesunden
Erwachsenen (chromatographisch) heterogen.
Hauptfraktion des normalen Hämoglobins
ist das Hämoglobin A. Daneben sind weitere
(elektrophoretisch und säulenchromatographisch abtrennbare) Subfraktionen bekannt.
Ende der 60er Jahre wurden im Blut von Diabetikern erhöhte Mengen einer solchen Hämoglobin-Subfraktion nachgewiesen, welche in
der Elektrophorese oder der Ionenaustauschchromatographie schneller «wanderte» als das
Hämoglobin A [1–5]. Sie wurde schliesslich
identifiziert [6] und als HbA1c bezeichnet. In
der Folge wurde die positive Beziehung zwischen mittlerer Blutzuckerkonzentration über
die vorhergehenden 6–8 Wochen und den
HbA1c-Werten entdeckt [7–10], die HbA1c-Be-
stimmung in die klinische Praxis eingeführt
und die Bestimmungsmethoden weiterentwickelt [11–13], was die Diabetiker-Betreuung
entscheidend prägen sollte [14–17]. Heute
stellt die HbA1c-Bestimmung den «gold standard» für die Stoffwechselkontrolle bei Diabetes mellitus dar [18]. Die Bedeutung der HbA1cBestimmung hat in den 90er Jahren noch zugenommen, da nachgewiesen werden konnte,
dass sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2Diabetes die Verbesserung der Diabeteseinstellung – ablesbar am HbA1c-Verlauf – zu
einer Senkung der mikrovaskulären Komplikationsrate führt. Der Nachweis gelang durch
zwei herausragende Studien: DCCT (Diabetes
Control and Complications Trial) und UKPDS
(UK Prospective Diabetes Study) [19, 20].
Chemische Struktur des Glykohämoglobins (HbA1/HbA1c)
Wie bereits erwähnt, sind normale Hämoglobine beim gesunden Erwachsenen (chromatographisch) heterogen, und zwar bedingt durch
einen Polymorphismus der «nicht»-α-Ketten
994
und als Folge von posttranslationellen Modifikationen. Ersteres führt dazu, dass beim gesunden Erwachsenen neben Hämoglobin A
(α2β2) auch fetales Hämoglobin (α2γ2) und
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Fortbildung
Hämoglobin A2 (α2δ2) vorkommen. Bei den
übrigen Subfraktionen des Hämoglobins handelt es sich vorwiegend um «Glykosylierungs»Produkte von Normalhämoglobin mit Hexosen bzw. Hexosephosphaten (posttranslationelle Modifikation). Diese Glykosylierung –
oder besser Glykierung – hat man sich so
vorzustellen1: Die Reaktion der Glykierung
erfolgt nicht-enzymatisch und wird in ihrem
Ausmass durch die relativen Konzentrationen
des reagierenden Monosaccharids und des
Hämoglobins bestimmt. Es handelt sich um
eine Kondensationsreaktion. Und zwar wird
Glukose (konzentrationsabhängig) über die
Carbonylgruppe mit freien Aminogruppen
(N-terminal oder ε-Aminolysin) des Hämoglobins nicht-enzymatisch und reversibel zu
einer Aldiminverbindung (Schiff-Base) verknüpft [21]. Erst in einem zweiten, wesentlich
langsameren Prozess entsteht durch eine sogenannte Amadori-Umlagerung die stabile Form
des sogenannten Glykohämoglobins, ein Ketoamin2. Die zuerst entstehende Aldiminverbindung ist sehr labil. Sie kann innert weniger
Stunden wieder in ihre Komponenten zerfallen.
Die Amadori-Umlagerung in die stabile Ketoaminverbindung hingegen erfolgt etwa 50mal
langsamer. Kurzfristige Erhöhungen der Blut1 Da keine eigentlichen Glykoside entstehen, sollte der Begriff
der Glykosylierung ersetzt werden durch den Begriff Glykierung (engl. glycation).
2 Der Begriff «Glykohämoglobin» ist eigentlich nicht korrekt
(kein Glykoprotein!).
glukose (beispielsweise im Rahmen eines oralen Glukose-Toleranztests) beeinflussen deshalb die Konzentrationen dieser Ketoaminverbindungen nicht. Bei der Beurteilung der mittleren Glykämielage («Blutzuckergedächtnis»)
in der Diabeteskontrolle interessiert einzig
die stabile Form des Glykohämoglobins. Das
bedeutet, dass die labilen Aldiminverbindungen vor der Analyse entfernt (durch Ansäuern,
Dialyse, Semicarbazid-Zugabe) oder dass spezifische Methoden zur isolierten Erfassung
der Ketoaminverbindungen (Affinitätschromatographie, Immunoassay; s. Tab. 1) gewählt
werden müssen.
Die Auftrennung der HbA1-Komponenten [22]
wie auch gewisser nicht-β-aminoterminaler
Glykohämoglobine erfordert eine besondere
Analytik [23], beispielsweise die Kationenaustauschchromatographie [24]. Die schnell
wandernde Fraktion wird dabei als HbA1 bezeichnet und von der Hauptfraktion HbA0
unterschieden. Die Subfraktion HbA1 kann
dabei in grossen Säulen bei langsamer Chromatographie und veränderten Pufferlösungen in
weitere Fraktionen unterteilt werden: HbA1a1,
HbA1a2, HbA1b und HbA1c (s. Tab. 2). In
den meisten analytischen Systemen werden
die HbA1a-Komponenten aber nicht und die
HbA1b-Komponenten nur andeutungsweise aufgetrennt. Komplizierend kommt hinzu, dass
auch die Hauptfraktion HbA0 teilweise glykosyliert wird [25], was mit den üblichen
Chromatographiemethoden jedoch nicht er-
Tabelle 1
Verschiedene Methoden der HbA1c-Bestimmung, mögliche Störfaktoren.
Methode
gemessene Fraktion
Störfaktor
labile HämoglobinForm/Aldimin
Störfaktor
erhöhtes
fetales Hämoglobin*
Störfaktor
Varianten-Hämoglobin
(HbS, HbC, HbE)
Störfaktor
modifiziertes
Hämoglobin**
Affinitätschromatographie
totales glykiertes
–
Hämoglobin ➔ HbA1c- korrekte Messung
Äquivalente
des glykierten Hämoglobins
–
–
–
korrekte Messung
korrekte Messung
korrekte Messung
des glykierten Hämoglobins des glykierten Hämoglobins des glykierten Hämoglobins
HPLC
HbA1/HbA1c
+
muss eliminiert
werden
+/–
muss erkannt und
Resultat
entsprechend
korrigiert werden
+/–
muss erkannt und
Resultat
entsprechend
korrigiert werden
+
interferierende
Substanzen als
glykiertes Hämoglobin
gemessen
Ionenaustauschchromatographie
HbA1/HbA1c
+
muss eliminiert
werden
+
falsch hohes
Resultat
+
falsch tiefes
Resultat***
+
interferierende
Substanzen als
glykiertes Hämoglobin
gemessen
Immunoassay
spezifisches HbA1c
–
korrekte Messung
des HbA1c
–
korrekte Messung
des HbA1c
–
korrekte Messung
des HbA1c
–
korrekte Messung
des HbA1c
+
*
störender Einfluss; – kein Einfluss
fetales Hämoglobin erhöht: z.B. bei hereditärem persistierendem fetalem Hämoglobin, bei Betathalassämie,
in der Schwangerschaft und bei Diabetes mellitus
** Beispiele: carbamyliertes Hämoglobin bei Niereninsuffizienz/Urämie, acetyliertes Hämoglobin bei Aspirintherapie,
modifiziertes Hämoglobin bei hohem Alkoholkonsum (Acetaldehydaddukt)
*** Hämoglobin D: sowohl falsch tiefe als auch falsch hohe Resultate [131]
995
Fortbildung
Tabelle 2
glykierte Hämoglobine
Glykierte («glykosylierte»)
Hämoglobine (Übersicht).
Ausgangssubstanz ist
das HbA0 (bestehend aus
2 α- und 2 β-Ketten).
glykiertes HbA0*
HbA1
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involvierte Zucker
α2(β-ε-Lys-Glucose)2
HbA1a
HbA1a1
HbA1a2
α2(β-N-Frucose-1,6-Biphosphat)2
α2(β-N-Glucose-6-Phosphat)2
HbA1b*
α2(β-N-Hexose)2
HbA1c*
α2(β-N-Glucose)2
* bei Diabetes mellitus erhöht
fassbar ist. Tabelle 2 zeigt die Glykohämoglobine in der Übersicht und gibt an, welche Subfraktionen bei Diabetes mellitus erhöht sind.
Eine zur Glykierung analoge, nicht-enzymatische, konzentrationsabhängige Kondensationsreaktion von Hämoglobin findet im übrigen auch mit zahlreichen anderen Produkten
statt: beispielsweise mit Isocyanat, einem Dissoziationsprodukt von Harnstoff, welches besonders bei der Urämie anfällt. Dies führt zwar
nicht zu glykiertem, aber zu analog verändertem, modifiziertem Hämoglobin, welches die
HbA1/HbA1c-Bestimmung stören kann, wie
unten gezeigt wird.
Klinische Bedeutung des Glykohämoglobins (HbA1/HbA1c)
Die HbA1/HbA1c-Bestimmung ermöglicht die
Beurteilung der mittleren Blutglukosekonzentration der vorausgegangenen 6 bis 8 Wochen,
da der mittlere Blutzucker positiv mit dem
Glykohämoglobin korreliert [7–10, 26, 27,
28]. Dabei wird in der Regel von einer linearen
Beziehung ausgegangen, was im klinisch relevanten Blutglukosebereich erlaubt ist. Die
Mittellage des Blutzuckers (in mmol/l) lässt
sich anhand der beiden folgenden Formeln
abschätzen:
[1,46 ҂ HbA1] – 5,12
beziehungsweise
[2,02 ҂ HbA1c] – 5,19 (zur Vereinfachung empfehlen
wir, [HbA1c ҂ 2] – 5 zu rechnen)
(errechnet für die Biorad-Minisäulen nach Berger und
Flückiger [26]).
Für die klinische Beurteilung ist es dabei unwesentlich, ob HbA1 oder HbA1c gemessen
wird. In frischen Blutproben korreliert nämlich das HbA1c eng mit dem HbA1 (HbA1 = 1,18
HbA1c + 1,67, Korrelationskoeffizient 0,97
[29]). Bei gelagerten Blutproben jedoch ist
das HbA1c zuverlässiger als HbA1.
Ursprünglich ging man davon aus, dass die
Normwerte für HbA1(c) altersunabhängig sind
[30]. Später haben dann zahlreiche Autoren
eine altersabhängige HbA1(c)-Zunahme aufzeigen können [31–35]. Auch betreffend Geschlechtsabhängigkeit liegen unterschiedliche
Angaben vor. Einerseits wurden bei Frauen
im Vergleich zu Männern leicht erhöhte
HbA1c-Werte gefunden [36, 37]. Diese Befunde könnten eventuell auf einen höheren fetalen Hämoglobin-Gehalt zurückzuführen sein.
Flückiger et al. haben nämlich bei spezifischer
HbA1c-Bestimmung mittels Diamat-Analyzer,
welcher fetales Hämoglobin von HbA1c ab996
trennt, keine geschlechtsspezifischen Unterschiede feststellen können [38]. Aber auch
mittels HPLC-Methode haben Carrera et al.
kürzlich keine Abhängigkeit vom Geschlecht
objektivieren können [31]. Definitiv wird die
Frage nach Alters- und Geschlechtsabhängigkeit der HbA1c-Normwerte wohl erst nach Einführung einer internationalen Standardisierung in der HbA1c-Bestimmung geklärt werden
können, da erst unter dieser Voraussetzung der
Vergleich internationaler epidemiologischer
HbA1c-Daten zulässig wird.
Da diverse Studien gezeigt haben, dass bei Typ2-Diabetes eine gute Korrelation zwischen
Nüchtern-Blutglukose und Glykohämoglobin
besteht, wurde von einzelnen Autoren vorgeschlagen, bei Diabetes Typ 2 die NüchternGlukose anstelle des HbA1/HbA1c zu bestimmen [39–42]. Diese Korrelation wird neuerdings aber wieder in Frage gestellt [43].
Unbestritten aber ist die gute Korrelation
zwischen mittlerer Blutglukosekonzentration
und Glykohämoglobin. Wichtige diesbezügliche Daten basieren auf der bereits erwähnten DCCT-Studie [19]. Im Rahmen dieser
Untersuchung wurden bei insgesamt 278 Typ1-Diabetikern ein Jahr lang vierteljährlich
das HbA1c sowie ein 7 Messungen umfassendes 24-Stunden-Blutglukoseprofil bestimmt
[44] und die Resultate miteinander korreliert.
Das Ergebnis war hochsignifikant (Korrelationskoeffizient 0,80, p <0,0001). Basierend
auf diesen Daten wissen wir, dass eine Zunahme des HbA1c um 1% einer Zunahme des
mittleren Blutglukosewerts von 1,99 mmol/l
entspricht.
Betreffend Stoffwechselkontrolle bei Diabetes
mellitus wird heute empfohlen, dass das HbA1c
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<7% betragen sollte («gute» Diabeteseinstellung), sofern der verwendete Assay auf den
Normbereich 4 bis 6% kalibriert ist (das bedeutet, dass eine Normwerterhebung mit dem
betreffenden Assay bei nichtdiabetischen Individuen mehrheitlich Werte zwischen 4 und
6% ergab). Liegen die HbA1c-Werte bei einem
Patienten mehrfach über 8%, so wird ein
Überdenken der Diabetestherapie und eine
neue Therapieeinstellung angeraten [45]. Diese
Empfehlungen gehen allerdings davon aus,
dass eine zertifizierte HbA1c-Bestimmungsmethode zur Anwendung gelangt. Das bedeutet,
es liegt ein Methodenvergleich mit dem in der
DCCT verwendeten Assay als Referenz vor.
Bei Typ-1-Diabetikern sollte dabei die Bestimmung des HbA1c im Abstand von 3 und bei
nicht-insulinabhängigen, relativ stabilen Diabetikern von mindestens 6 Monaten erfolgen.
Das HbA1c ist kein Diabetes-mellitus-Diagnosekriterium. Zwar erhoffte man sich für die
Diagnostik eine Ablösung des aufwendigen
oralen Glukose-Toleranztests (oGTT) durch
die HbA1c-Bestimmung, jedoch ergaben entsprechene Studien ganz entscheidende Diskrepanzen [46–48]. Die HbA1c-Bestimmung hat
ihren hervorragenden Platz somit ausschliesslich in der Diabeteskontrolle.
HbA1/HbA1c-Bestimmung: Allgemeines
Meist wird für die Bestimmung von Glykohämoglobin venöses Blut verwendet, die Bestimmung im Kapillarblut ist aber ebenfalls
möglich [49, 50]. Die Bestimmung erfolgt
meist aus EDTA- oder Heparinblut. HeparinIodoacetat ist nicht geeignet [51]. Bei Ver-
wendung von Oxalat ist die Lagerbarkeit der
Proben herabgesetzt [52]. Bei Raumtemperatur verändert sich HbA1c kaum, während
HbA1a+b innerhalb weniger Tage ansteigen
kann [53]. Der Postversand von Blutproben
zur HbA1c-Bestimmung ist möglich [54].
HbA1/HbA1c-Bestimmung: Methoden
Der quantitative Nachweis der nicht-enzymatischen Glykierung von Proteinen ist sehr anspruchsvoll und insgesamt störanfällig. Zahlreiche Faktoren können HbA1/HbA1c-Assays
beeinflussen, und zwar je nach Assay in ganz
unterschiedlichem Ausmass. Es stellt sich deshalb die Frage nach dem besten, am wenigsten
störungsanfälligen Assay, insbesondere da es
heute bereits über 20 verschiedene HbA1cMessmethoden gibt [55], die zum Teil unterschiedliche Glykierungsprodukte erfassen. Bis
heute gibt es aber keinen allgemeinen Goldstandard. Je nach klinischer Situation weist die
eine oder andere Methode Vorteile auf. So ist
beispielsweise der Immunoassay der HPLCMethode bei Vorliegen von carbamyliertem
Hämoglobin überlegen [56, 57]. Die HPLCMethode dagegen gilt als «gold standard» zum
Erfassen von Varianten-Hämoglobinen (äussern sich als zusätzlicher «peak» im HPLCChromatogramm) [58], welche elektrophoretisch dann weiter analysiert werden können.
Eine gute Übersicht über die verschiedenen
HbA1c-Assaymethoden findet sich bei Flückiger [59]. In der Praxis sind die Methoden dabei weitgehend automatisiert [60]. Die wichtigsten Methoden sind:
1. Ionenaustauschchromatographie (IAC, in
Makro- oder Minisäulen; Auftrennung der
Hämoglobin-Subfraktionen nach Ladung),
2. HPLC (automatisierte Version der IAC auf
einem HPLC-Gerät),
3. Elektrophorese (in Agargel; HbA1c wandert
bei pH 6,3 in Richtung Kathode),
4. Affinitäschromatographie (beispielsweise
Boronataffinitätschromatographie, BAC),
5. Immunoassay-Verfahren.
Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Immunoassay-Methode
sollen im folgenden kurz besprochen werden.
Ionenaustauschchromatographie
(IAC, inklusive HPLC)
Für die Bestimmung von HbA1c im klinischchemischen Labor ist die KationenaustauschChromatographie weit verbreitet, sei es als
automatisierte Version auf einem HPLC-Gerät
oder manuell betrieben mit Minisäulen. Die
Methode wurde 1971 von Trivelli et al. eingeführt [5]. In der Folge konnte die Analysezeit durch Entwicklung selbstgepackter oder
kommerzieller Mikrosäulen [59] verkürzt
werden. Grundlage der Methode ist die Veränderung der Ladung des Hämoglobin-Moleküls
durch N-terminale Modifikation mit Glukose
(HbA1c und andere N-terminal veränderte
Hämoglobine). Diese Hämoglobin-Modifikationen binden weniger gut an negativ geladenes
997
Fortbildung
Harz als HbA0. 1979 wurden in vivo schnell
fluktuierende HbA1c-Werte beschrieben [61,
62]. Es zeigte sich, dass bei der Chromatographie labile Zwischenprodukte (Schiff-Basen) offensichtlich mitgemessen wurden [63]. In
der Folge wurden Methoden entwickelt, mittels welcher dieses Prä-HbA1c abgetrennt werden kann, beispielsweise durch Dialyse
der Hämolysate (aufwendig) [64] oder durch
Inkubation der Erythrozyten mit physiologischer Kochsalzlösung [65]. Durch letzteres
kann etwa die Hälfte des labilen HbA1c entfernt
werden [66]. Als weitere «Eliminatoren» wurden Semicarbazid und Borat eingeführt [67].
Dennoch kann die HPLC-Methode durch eine
Vielzahl von Faktoren gestört werden, wobei
Varianten-Hämoglobine und modifizierte Hämoglobine (beispielsweise Hämoglobin-Carbamylierung bei Urämie) im Vordergrund stehen [68, 69].
Affinitätschromatographie (BAC)
Boronatgruppen bilden im Alkalischen mit der
cis-Diolstruktur, wie sie in nicht-enzymatisch
glykosylierten Proteinen vorliegt, Komplexe
aus. Die Boronataffinitätschromatographie
(BAC) erlaubt daher die spezifische Messung
des gesamten glykierten Hämoglobins. Die Resultate können aber für HbA1c standardisiert
werden (HbA1c-Äquivalente). Weil bei der
Affinitätschromatographie sowohl Hämoglobine zurückgehalten werden, die am N-terminalen Ende glykiert wurden, als auch solche,
die an den ε-Aminogruppen von Lysin glykiert
wurden, sind die Werte für glykierte Hämoglobine, die mit Boronataffinitätschromatographie bestimmt wurden, jeweils typischerweise höher als diejenigen, die mit Ionenaus-
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tauschchromatographie gemessen wurden.
Neuere Methoden sind automatisiert und
drücken das Resultat neben dem total glykierten Hämoglobin als standardisiertes HbA1Äquivalent aus.
Immunoassays
Der erste Immunoassay für HbA1c basierte auf
einem polyklonalen Schaf-Antikörper [70].
Antiseren und monoklonale Antikörper gegen
Hämoglobin, das N-terminal oder an ε-Aminogruppen von Lysin durch Glukose modifiziert wurde, haben die Weiterentwicklung von
Immunoassays ermöglicht [71–77]. Es wurden
monoklonale Antikörper gegen das glykierte
Valin und das N-terminale Ende der β-Kette
des Hämoglobins erzeugt, die aufgrund ihrer
hohen Spezifität die übrigen glykierten Hämoglobine (HbA1 und HbA1b, labiles HbA1c, glykiertes HbA0) und glykierte Hämoglobin-Varianten nicht miterfassen (spezifische Methode). Auch carmamylierte Hämoglobine werden
nicht mitgemessen [78]. Das Verfahren basiert
beispielsweise auf Inhibition von Latex-Immunagglutination und kann als Einzelprobenverfahren durchgeführt werden. Daneben existieren auch «enzyme-linked immunosorbent
assays» (ELISA) und immunoturbidometrische
Verfahren (für längere Serien, Multisampletesting) mit halb- oder vollautomatisierten
Analysegeräten. Für Einzelmessungen in einem
Praxislabor gibt es präkalibrierte Geräte mit
Fertigreagenzien, welche die Hemmung einer
Latex-Immunagglutination messen (Beispiel:
DCA 2000™ System) [79]. Die vollautomatisierte Messung dauert dabei noch etwa
6 Minuten.
HbA1c-Bestimmung: allgemeine Einschränkungen
Transfusionen, Anämien und verkürzte Erythrozyten-Überlebensdauer (beispielsweise bei
Sphärozytose) stören die HbA1c-Bestimmung
unabhängig vom verwendeten Assay.
Ein einmaliger akuter Blutverlust von 450 ml
bei einer Blutspende verursacht beispielsweise
eine HbA1- und HbA1c-Erniedrigung von
0,5% mit einem Nadir durchschnittlich 6 bis 8
Wochen nach erfolgter Blutentnahme (Latenz
bedingt durch protrahierte Retikulozytose)
[80]. Wiederholte Aderlässe (beispielsweise im
Rahmen einer Hämochromatose-Therapie)
haben eine stärkere Abnahme zur Folge (gezeigt
für HbA1 [81]). Auch bei hämolytischen An998
ämien beeinflusst die Verkürzung der Erythrozyten-Lebensdauer das Glykohämoglobin [82,
83] bzw. das HbA1c [84]. Aufgrund dieser gut
dokumentierten Beziehung zwischen der Lebensspanne der Erythrozyten und dem Glykohämoglobin wurde interessanterweise angeregt, den Schweregrad hämolytischer Anämien
anhand des Glykohämoglobin-Verlaufs zu monitorisieren [85, 86]. Bei nichthämolytischen
Anämien (beispielsweise Eisenmangelanämie)
ist das HbA1 in Abhängigkeit vom Gehalt an
fetalem Hämoglobin bzw. von der Bestimmungsmethode unverändert oder leicht erhöht
[87]. Komplizierend kommt hinzu, dass sich oft
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bei Diabetikern eine verkürzte ErythrozytenLebensdauer findet, speziell bei Vorliegen einer
Niereninsuffizienz oder einer Mikroangiopathie [88]. Im Einzelfall ist es unumgänglich,
nebst dem HbA1c auch ein rotes Blutbild sowie
die Retikulozytenzahl zu bestimmen, um die
genannten, nicht Assay-spezifischen Störfaktoren aufzudecken [89]. Neuerdings wurde sogar
angeregt, bei entsprechendem klinischem Verdacht die Erythrozyten-Lebensdauer durch Bestimmung des erythrozytären Kreatins abzuschätzen und im Einzelfall das gemessene
HbA1c mittels Korrekturformel anzupassen
[90].
Neben diesen Faktoren führen vor allem
pathologische Hämoglobine bei Hämoglobinopathien (Varianten-Hämoglobine), modifizierte Hämoglobine (beispielsweise infolge
von Carbamylierung bei Niereninsuffizienz)
bzw. ein zu hoher Gehalt an fetalem Hämoglobin zu Assay-Störungen und somit zu
HbA1c-Messwertverfälschungen.
Einige Routinebestimmungsmethoden trennen
zwischen HbA1c und fetalem Hämoglobin
nicht auf, wie der Tabelle 1 zu entnehmen ist.
Dies führt bei erhöhtem fetalem Hämoglobin
zur Fehlbeurteilung, da fetales Hämoglobin
mitgemessen wird. Nun ist das fetale Hämoglobin bei Diabetikern durchschnittlich erhöht,
und zwar beim Typ 1 stärker als beim
Typ 2 [91, 92]. Fetales Hämoglobin kann
auch genetisch bedingt persistieren oder durch
Schwangerschaft bedingt ansteigen. In einem
solchen Fall ist es unumgänglich, eine Methode
zu wählen, welche zwischen Glykohämoglobin
und fetalem Hämoglobin differenziert, beispielsweise Affinitätschromatographie oder
Immunoassay-Verfahren. Auch mittels HPLC
kann fetales Hämoglobin identifiziert werden.
Deutlich seltener ist das Vorhandensein von
Hämoglobin-Varianten wie Hämoglobin H,
Hämoglobin Hijiyama, Hämoglobin Hafnia,
Hämoglobin K oder Hämoglobin J (Hämoglobinopathien). In Österreich beispielsweise
wurde für Hämoglobin-Varianten eine Prävalenz von 0,059% ermittelt. Teils sind pathologische Hämoglobine negativer als HämoglobinA-geladene, weswegen teils falsch hohe HbA1Werte resultieren können. Hämoglobinopathien sollten vermutet und durch HämoglobinElektrophorese gesucht werden, wenn eine
deutliche Diskrepanz zwischen der aufgrund
der Blutzuckerbestimmung erwarteten Diabeteseinstellung und dem gemessenen HbA1cWert besteht.
Weiter können Hämoglobin-Modifikationen
zu einer Störung der HbA1c-Bestimmung führen.
Die klinisch wohl relevanteste solche Störung
entsteht durch Carbamylierungsreaktion (von
Hämoglobin) bei Niereninsuffizienz/Urämie.
Dadurch kann es zur ganz beträchtlichen Verfälschung der HbA1c-Werte kommen, mit
HbA1-Anstieg bis zu 3% [57, 93]. Die Carbamylierungsreaktion führt unter anderem
dazu, dass auch bei nichtdiabetischen Patienten falsch hohe Werte für glykiertes Hämoglobin gefunden werden können. Das carbamylierte Hämoglobin entsteht durch Interaktion
von terminalen Hämoglobin-Aminogruppen
mit Isocyanidsäure. Das Isocyanat selbst entsteht durch spontane Dissoziation von Harnstoff. Carbamyliertes Hämoglobin coeluiert
mit HbA1a+b [94] und mit HbA1c [95]. Gestört
werden einzig die ladungsabhängigen Trennverfahren (HPLC und Elektrophorese), nicht
jedoch die Affinitätschromatographie bzw. die
Immunoassays [56]. HbA1 und HbA1c sind bei
Urämie deshalb nur dann zuverlässige Parameter zur Beurteilung der durchschnittlichen
Blutzuckereinstellung, falls geeignete Messverfahren eingesetzt werden. Es gilt auch zu
berücksichtigen, dass es bei Urämie zu einer
Verkürzung der Erythrozyten-Lebensdauer
und zur hyporegeneratorischen Anämie (Erythropoietin-Mangel) kommen kann [96, 97].
Kompliziert wird die Situation bei therapeutischem Einsatz von Eryhropoietin (Zunahme
der Retikulozyten). Nakao et al. haben für
solche Patienten eine HbA1c-Korrekturformel
vorgeschlagen (unter Einbezug von Hämatokrit und Retikulozyten) [98].
Auch Salizylate beeinflussen Glykohämoglobin. Bei Aspirin-Langzeittherapie (mehr als
500 mg/Tag über mehrere Wochen) wird Hämoglobin bis zu 5% acetyliert. Die Acetylierung hat eine verstärkte negative Ladung zur
Folge, was zu Veränderungen in der Elektrophorese und Ionenaustauschchromatographie/HPLC führt. Acetyliertes Hämoglobin
wandert dabei analog zum HbA1c schneller und
kann somit zu einem falsch hohen HbA1c-Resultat führen [99, 100]. Die Langzeittherapie
mit kleineren Mengen von Acetylsalicylaten
(200–300 mg/ Tag) oder eine nur kurz dauernde
Verabreichung von deutlich höheren Dosierungen (2000 mg/ Tag während einer Woche)
scheinen keinen klinisch relevanten «falschen»
Anstieg des Glykohämoglobins durch acetyliertes Hämoglobin zur Folge zu haben [101].
Bei starkem Alkoholkonsum sind die HbA1cWerte in Abwesenheit einer Glukoseintoleranz
erhöht, bedingt durch ein Hämoglobin mit
HbA1c-Mobilität [102–104]. Ein solches Hämoglobin tritt bei einem Alkoholkonsum von
150 bis 200 g/Tag auf und normalisiert sich
999
Fortbildung
Schweiz Med Wochenschr 2000;130: Nr 26
Tabelle 3
falsch tief
falsch hoch
Klinische Situationen mit
Veränderung des
HbA1/HbA1c.
Hämoglobin S, Hämoglobin C
fetales Hämoglobin > normal oder 0,5%
Hämoglobin D*
Urämie (mit oder ohne Hämodialyse)
hämolytische Anämie
chronische Eisenmangelanämie
kongenitale Sphärozytose
Hypertriglyzeridämie
akuter Blutverlust
Alkohol
Zustand nach ErythrozytenTransfusion
Aspirin
β-Lactam-Antibiotika
Bleivergiftung
Hydroxyurea
* falls mit HPLC-Methode gemessen: sowohl falsch hohe als auch falsch tiefe Resultate [131]
nach Absetzen des Alkoholkonsums mit einer
Halbwertszeit von 11 Tagen. Die Struktur
dieser «alkoholischen» HbA1c-Komponente ist
nicht identifiziert [105]. Allerdings sind die
Einflüsse von Aspirin und Alkohol klinisch
oft vernachlässigbar [106].
Die Inkubation von Hämoglobin mit β-Lactam-Penicillin ergibt penicilloyiertes Hämoglobin mit Hb1c-Mobilität, die Glykierung an
und für sich bleibt unverändert. Das HbA1c erscheint deshalb bei Patienten unter solcher
Therapie falsch erhöht [107].
Seltenere Ursachen für Verfälschung der HbA1c-
Werte (falsch hohe Werte) sind: eine Therapie
mit Phenobarbital [108] oder Hydroxyurea
[109], eine chronische Bleivergiftung bei Kindern [110] und eine Galaktosämie. Da Galaktose reaktiver ist als Glukose, kommt es hierbei zu einer gesteigerten, durch Galaktosebedingten Glykierung von Hämoglobin [111].
Tabelle 3 gibt eine Übersicht über klinische
Situationen, welche HbA1/HbA1c-Werte verändern können.
HbA1c-Bestimmung: methodenspezifische Einschränkungen
Tabelle 1 zeigt in der Übersicht, welche Methode durch welche Faktoren spezifisch gestört
werden kann.
Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie ist relativ unempfindlich gegenüber Schwankungen von pH
und Temperatur. Sie misst allerdings das gesamte glykierte Hämoglobin. Vielleicht aber
widerspiegelt diese Subfraktion den durchschnittlichen Blutzuckerstatus auch realitätsgetreuer als das HbA1c allein. HämoglobinVarianten oder labile Aldiminformen interferieren nicht mit der HbA1c-Messung.
Ionenaustauschchromatographie und HPLC
Temperatur und pH, Schiff-Base-Intermediate
(labiles HbA1c, sog. Prä-HbA1c, muss vor Messung entfernt werden), zu hoher fetaler Hämoglobin-Gehalt, Hämoglobin-Varianten, hohe
Triglyzerid- oder Bilirubin-Werte können mit
der HbA1c-Bestimmung interferieren.
Wie einige andere Routinebestimmungsmetho1000
den trennen auch diese Verfahren nicht automatisch zwischen HbA1c und fetalem
Hämoglobin (s. Tab. 1), was bei den oben erwähnten Umständen mit erhöhtem fetalem
Hämoglobin zur Fehlbeurteilung führen kann.
Allerdings kann fetales Hämoglobin – sowie
auch Hämoglobin-Varianten – mittels HPLC
separat identifiziert werden. In Anwesenheit
von fetalem Hämoglobin empfiehlt es sich
allenfalls, die Glykierung von Hämoglobin mit
spezifischer Methodik zu bestimmen [112,
113].
Je nach Ladung des Varianten-Hämoglobins
können bei HbA1c-Bestimmungen mit der
Kationenaustauschchromatographie
falsch
hohe (fetales Hämoglobin, Hämoglobin H)
oder falsch tiefe Werte (Hämoglobin S, C und
D) resultieren. Im ersten Fall haben die Hämoglobin-Varianten zusätzliche negative Ladungen und können zusammen mit der HbA1Fraktion eluieren und dadurch eine Überschätzung des Glykohämoglobins verursachen. Ein
abnormes Hämoglobin sollte deshalb aktiv gesucht werden, falls die mittels Ionenaustauschchromatographie ermittelten HbA1(c)-Werte
unerwartet hoch (Varianten-Hämoglobin
eluiert mit HbA1-Fraktion) oder unerwartet
Schweiz Med Wochenschr 2000;130: Nr 26
Fortbildung
tief (Varianten-Hämoglobin eluiert mit HbA0Fraktion) ausfallen. Bei den bekannteren –
aber insgesamt seltenen – Hämoglobin-Varianten Hämoglobin S, C und D ist aufgrund der
gegenüber Hämoglobin A positiveren Ladung
die Elution verzögert, und die glykierten Formen des Varianten-Hämoglobins werden bei
der Sammlung von HbA1 nicht erfasst. Da aber
das Ausmass der Glykierung von Hämoglobin
S, C und D mit demjenigen von Hämoglobin A
vergleichbar ist und die Lebensdauer der
Erythrozyten von heterozygoten Trägern dieser Varianten-Hämoglobine unverändert ist,
lässt sich die Blutzuckermittellage dennoch
mittels Messen der Hämoglobin-Glykierung
erfassen, wobei aufgrund des konstanten Varianten-Hämoglobin-Gehalts eine Korrektur
des falsch tiefen HbA1c-Wertes vorgenommen
werden kann [114].
Eine massive Hypertriglyzeridämie ergibt bei
der HbA1(c)-Bestimmung wegen der Lakteszenz
falsch hohe Werte, sofern das Blut nicht gewaschen wird. Dasselbe gilt für die Hyperbilirubinämie [115]. Die Interferenz tritt allerdings erst ab hohen Triglyzeridwerten auf. Sie
kann durch geeignete Aufbereitung der Zellen
(Waschen) eliminiert werden. Da die Hypertriglyzeridämie bei Diabetes mellitus bekanntermassen ein relativ häufiges Problem darstellt, sollte diese technische Einschränkung
der Ionenaustauschchromatographie unbedingt berücksichtigt werden. Auch eine Bilirubin-Interferenz kann durch Waschen eliminiert werden.
Immunoassays
Immunoassays mit monoklonalen Antikörpern haben den Vorteil, dass sie spezifisch
HbA1c messen, labiles HbA1c (Schiff-Base-Intermediate) nicht mit erfasst wird und die Methode durch fetales Hämoglobin, VariantenHämoglobin und auch durch carbamyliertes
Hämoglobin (bei der Urämie) kaum gestört
wird.
Testperformance
Es sollten für jeden verwendeten Assay die
folgenden Testcharakteristika bekannt sein:
Spezifität (HbA1, HbA1c, fetales Hämoglobin?), Normbereich und Präzision (Variationskoeffizient, CV). Die Präzision betreffend, sind
die folgenden Variationskoeffizientwerte von
Interesse: Intra-Labor- bzw. Intra-Assay-Variationskoeffizient und Inter-Methoden-Varia-
tionskoeffizient (wobei mindestens ein Methodenvergleich mit einer Referenzmethode
vorliegen sollte, beispielsweise mit nicht kommerzieller säulenchromatographischer Methode). Weiter sollten sämtliche Labors, welche
HbA1c-Bestimmungen anbieten, an Ringversuchen beteiligt sein (Inter-Labor-Variationskoeffizient). Zudem sollten Messvergleiche mit
stabilen Standards vorliegen. Trotz grossen
Bemühungen sind HbA1c-Assays international
aber immer noch nicht standardisiert, im Gegensatz etwa zu den Quick-Bestimmungsmethoden (INR), weil logistische, methodologische und technische Probleme noch ungelöst
sind [116–122]. HbA1c-Werte vom gleichen
Patienten, die in verschiedenen Labors mit der
gleichen Assay-Methode oder in nur einem
Labor mit verschiedenen Assays bestimmt
wurden, sind somit nur beschränkt vergleichbar.
«Gute» Blutzuckerwerte – «schlechtes»
HbA1c oder umgekehrt
Wie erwähnt korreliert das HbA1c gut mit der
mittleren Blutglukosekonzentration. Findet
sich aber eine Diskrepanz zwischen gemessenem und erwartetem HbA1c-Wert («gute»
Blutzuckerwerte – «schlechtes» HbA1c oder
umgekehrt), so sollten zuerst Compliance-Probleme ausgeschlossen werden (Patient gibt beispielsweise falsch tiefe Blutzuckerwerte an). In
einem nächsten Schritt sollte nach für den verwendeten Assay spezifischen und unspezifischen Störfaktoren (beim Patienten) gefahndet
werden. In solchen Fällen kann es sinnvoll sein,
Hämoglobin und Retikulozytenzahl zu bestimmen, eine Hämoglobin-Elektrophorese
oder aber eine HbA1c-Doppelbestimmung zu
veranlassen. Ergibt die Doppelbestimmung mit
einem anderen Assay (in der Regel in einem
Zweitlabor) einen deutlich anderen Wert, so
müssen Assay-spezifische Störfaktoren in Betracht gezogen werden.
Diskrepante Befunde zwischen HbA1c-Wert
und mittlerer Blutglukosekonzentration können aber nicht immer erklärt werden – und
finden sich im übrigen auch bei Nicht-Diabetikern [123, 124]. Es wurde versucht, dieses
Phänomen durch eine «Stoffwechselveranlagung» zu erklären (high and low «glycators»).
Demnach würde das Ausmass der nicht-enzymatischen Glykierung von Hämoglobin bei
einzelnen Individuen nicht einzig durch die
relativen Konzentrationen von Glukose und
Hämoglobin bestimmt, sondern noch durch
andere, nicht identifizierte Faktoren. Diese
1001
Fortbildung
Schweiz Med Wochenschr 2000;130: Nr 26
Tabelle 4
Mit welchem Assay wird das HbA1c bestimmt?
HbA1c-Bestimmung: relevante Fragen zur Methodik.
Liegt ein Methodenvergleich mit der DCCT-Referenzmethode vor?
Welches ist der Referenzbereich für diesen Assay (HbA1c-Werte für Nicht-Diabetiker)?
Welcher HbA1c-Zielbereich lässt sich daraus für die Diabetestherapie ableiten?
Wie ist die Testgenauigkeit?
Ist das involvierte Labor an Ringversuchen beteiligt?
Welches sind Assay-spezifische Störfaktoren? Liegen solche beim Patienten vor?
Liegen beim Patienten Assay-unspezifische, die HbA1c-Bestimmung generell störende
Faktoren vor?
Überlegungen sind jedoch spekulativer Natur
[125]. Nichtsdestotrotz ist das HbA1c in Einzelfällen nicht aussagekräftig, das heisst, es
korreliert schlecht mit den tatsächlich vorhandenen Blutglukosewerten. In solchen Fällen
empfehlen wir zusätzlich die Bestimmung von
Fruktosamin.
Fruktosaminbestimmung
Das Fruktosamin ist eine Sammelbezeichnung
für glykierte unspezifische Serumproteine,
hauptsächlich glykiertes Albumin, welches
eine Halbwertszeit von 14 bis 20 Tagen hat.
Der Vorgang der Glykierung geschieht analog
zum Prozess bei der HbA1c-Entstehung. Die
Fruktosaminbestimmung ist als Routinelabormethode verfügbar, im Gegensatz zur spezifischen Bestimmung von glykiertem Albumin
[126]. Der Fruktosaminwert korreliert mit
der mittleren Blutglukosekonzentration der
vorangegangenen 2 Wochen und eignet sich
deshalb zur «kurzfristigen» Beurteilung der
Stoffwechsellage, beispielweise im Rahmen
einer Schwangerschaft [127]. Der Normalbereich der kalorimetrischen Bestimmung mit
Nitrotetrazoliumblau wird mit <285 µmol/l
angegeben. Da Fruktosaminergebnisse einen
kürzeren Zeitraum repräsentieren, dürfen sie
bei Diabetikern nicht unkritisch mit den
HbA1c-Werten verglichen werden. Wichtig
ist die Bestimmung von Fruktosamin bei
Diabetikern, bei denen HbA1c-Werte nicht
aussagekräftig sind (hochgradige Anämie, Urämie, Vorhandensein von Hämoglobin-Varianten).
1002
Schlussfolgerungen
Die regelmässige HbA1c-Bestimmung ist heute
fester Bestandteil der modernen Diabeteskontrolle und -therapie [128–130]. Sie sollte
bei Diabetes mellitus Typ 1 alle 3 und bei stabil eingestelltem Typ-2-Diabetes mindestens
alle 6 Monate durchgeführt werden. Dabei
wird häufig übersehen, dass die HbA1c-Bestimmung relativ störanfällig ist. Die American
Diabetes Association (ADA) empfiehlt aus
diesem Grund, bei allen Diabetikern initial –
quasi im Sinne einer Störfaktor-Profilbestimmung – ein Hämoglobin, die Retikulozyten
sowie die Hämoglobin-Elektrophorese zu bestimmen, letzteres vor allem zum Erfassen
von fetalem Hämoglobin und pathologischen
Hämoglobinen. Wir selbst empfehlen die
Durchführung der genannten Analysen nur
bei Vorliegen einer erheblichen Diskrepanz
zwischen gemessenem und erwartetem HbA1cWert («gute» Blutzuckerwerte – «schlechtes»
HbA1c). Allerdings sollten in einem solchen Fall
auch Compliance-Probleme ausgeschlossen
werden. Zudem empfehlen wir bei Auftreten
solcher Diskrepanzen, sich betreffend des
verwendeten Assay sachkundig zu machen
(s. Tab. 4) und eventuell eine Doppelbestimmung mit einem anderen Assay (in der Regel
in einem Zweitlabor) in Auftrag zu geben,
wobei mit Vorteil ein Assay gewählt wird, der
sich vom ersten methodisch unterscheidet
(s. Tab. 1). Sinnvoll ist beispielsweise die Kombination von HPLC und Immunoassay, gelingt
es doch hierdurch, Varianten-Hämoglobine zu
entdecken.
Schweiz Med Wochenschr 2000;130: Nr 26
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