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Citius, altius, fortius – wie schnell muss man in der HPLC werden?

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Citius, altius, fortius –
Verbundene
Unternehmen:
wie schnell muss man in der HPLC werden?
Erfahrungen eines pharmazeutischen Dienstleisters
Dr. Frank Michel
HWI Analytik GmbH – f.michel@hwi-analytik.de
Jahrestagung der DPhG 2009 - Jena - 28.09.2009
Wer ist die HWI Analytik GmbH?
• Entwicklung und Validierung von Prüfmethoden
• Stabilitätsprüfungen
• Prüfungen nach Arzneibüchern
• Freisetzungsuntersuchungen
• Extractables/Leachables
• Spezialanalytik
2
Wer ist die HWI Analytik GmbH?
• Isolierung, Synthese & Aufreinigung
• Zertifizierung von Referenzstandards für chemisch definierte
Wirkstoffe und Verunreinigungen
• Markerverbindungen für pflanzliche Arzneimittel
3
Vorteile durch Schnelle Chromatographie?
• Dienstleistungsbereich: in der Regel breites Spektrum
unterschiedlicher Proben in relativ kleiner Probenzahl
• UHPLC-Anlagen bei Auftraggebern und Lohnherstellern als
relativ neue Technik noch nicht umfassend etabliert
• Aufwändige Probenvorbereitung ist oft limitierender als
HPLC-Analytik
4
Vorteile durch Schnelle Chromatographie!
5
Methodenentwicklung
• Literaturrecherche
• Auswahl der stationären Phase je nach Molekülstruktur und
Matrix des Präparates
• Optimierung von
– Zusammensetzung der mobilen Phase (organischer Modifier,
Organik-Anteil, pH-Wert, ggf. Gradient)
– Fluss & Temperatur
• Systematische Optimierung mit Unterstützung durch
Software „DryLab“
6
Methodenentwicklung
7
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklung – „normale“ HPLC
0,24
Angelikawurzel-Auszug
Osthol - 64,933
0,22
0,20
0,18
Stat. Phase:
Reprosil-Pur ODS-3,
150 x 4,6 mm, 3 µm
Mob. Phase:
Wasser/TFA/ACN/MeOH,
Gradient
Fluss:
1,0 ml/min
Temperatur:
45 °C
Wellenlänge:
323 nm
HPLC-Anlage:
Waters Alliance 2695
0,16
AU
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Minutes
8
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklung – „normale“ HPLC
0,24
0,20
0,18
0,16
AU
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
Angelikawurzel-Auszug
Osthol - 64,933
0,22
Stat. Phase:
Reprosil-Pur ODS-3,
Markersubstanzen
150 x 4,6 mm, 3 µm
Mob. Phase:
•„constituents with known therapeutic activity”,
Wasser/TFA/ACN/MeOH,
Gradient
Bestandteile mit bekannter therapeutischer Wirkung
Fluss:
•„active markers“, tragen zur therapeutischen
1,0Wirkung
ml/min
Temperatur:
bei, aber nicht vollständig
45 °C
Wellenlänge:
•„analytical markers“ für rein analytische Zwecke
323 nm
HPLC-Anlage:
Waters Alliance 2695
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Minutes
9
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklung – „normale“ HPLC
0,24
Angelikawurzel-Auszug
Osthol - 64,933
0,22
0,20
0,18
Stat. Phase:
Reprosil-Pur ODS-3,
150 x 4,6 mm, 3 µm
Mob. Phase:
Wasser/TFA/ACN/MeOH,
Gradient
Fluss:
1,0 ml/min
Temperatur:
45 °C
Wellenlänge:
323 nm
HPLC-Anlage:
Waters Alliance 2695
0,16
AU
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Minutes
10
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklung – „normale“ HPLC
0,70
0,65
Kombinationspräparat A
0,60
Stat. Phase:
Reprosil-Pur ODS-3,
150 x 4,6 mm, 3 µm
Mob. Phase:
Wasser/TFA/ACN/MeOH,
Gradient
Fluss:
1,0 ml/min
Temperatur:
45 °C
Wellenlänge:
323 nm
HPLC-Anlage:
Waters Alliance 2695
0,55
0,50
0,45
0,35
0,30
0,25
Osthol - 65,920
AU
0,40
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Minutes
11
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklung – „normale“ HPLC
0,20
0,18
0,16
Kombinationspräparat A
Stat. Phase:
Synergi Polar-RP,
250 x 4,6 mm, 4 µm
Mob. Phase:
Wasser/TFA/ACN/MeOH,
Gradient
Fluss:
1,0 ml/min
Temperatur:
35 °C
Wellenlänge:
349 nm
HPLC-Anlage:
Waters Alliance 2695
0,14
0,10
Myricitrin - 51,324
AU
0,12
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Minutes
12
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Betrachtung Methodenentwicklung – „normale HPLC“
•
Laufzeit 1,5h
•
Ermittlung der stationären Phase:
– 2-3 Läufe auf acht stationären Phasen à 1,5h => 2-3 Tage
•
Optimierung von 5 Parametern auf vier stationären Phasen:
– Gradient, organischer Modifier, Puffer, Temp., Fluss
– 10-15 Läufe auf vier stationären Phasen à 1,5h => 2 Wochen
•
Gesamtdauer Methodenentwicklung 3 Wochen
13
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklungg – Schnelle HPLC
0,080
Mariendistel-Extrakt
0,070
0,060
0,030
0,020
silibin b - 30,784
0,040
silibin a - 29,100
AU
0,050
0,010
Stat. Phase:
Ascentis Express C18,
100 x 2.1 mm (2.7 µm)
Mob. Phase:
Wasser/TFA/ACN/MeOH,
Gradient
Fluss:
0,4 ml/min
Temperatur:
30 °C
Wellenlänge:
287 nm
HPLC-Anlage:
Waters Acquity UPLC
0,000
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
14
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklung – Schnelle HPLC
0,080
Kombinationspräparat B
0,070
0,060
0,030
0,020
silibin b - 30,812
0,040
silibin a - 29,120
AU
0,050
0,010
Stat. Phase:
Ascentis Express C18,
100 x 2.1 mm (2.7 µm)
Mob. Phase:
Wasser/TFA/ACN/MeOH,
Gradient
Fluss:
0,4 ml/min
Temperatur:
30 °C
Wellenlänge:
287 nm
HPLC-Anlage:
Waters Acquity UPLC
0,000
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
15
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Methodenentwicklung – Schnelle HPLC
0,034
0,080
0,070
0,060
Kombinationspräparat B
287 nm
0,032
0,030
0,028
0,026
Kombinationspräparat B
330 nm
0,024
0,022
0,050
0,020
0,016
lead compound yarrow - 25,089
AU
0,040
0,030
0,020
silibin b - 30,812
0,014
silibin a - 29,120
AU
0,018
0,012
0,010
0,008
0,006
0,004
0,010
0,002
0,000
0,000
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
-0,002
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
16
Pflanzliches Kombinationspräparat:
Betrachtung Methodenentwicklung – Schnelle HPLC
•
Laufzeit 35 min
•
Ermittlung der stationären Phase:
– 2 Läufe auf 3 stationären Phasen à 35 min => 0,5 Tage
•
Optimierung von 5 Parametern auf der stationären Phase:
– Gradient, organischer Modifier, Puffer, Temp., Fluss
– 10-15 Läufe auf einer stationären Phase à 35 min => 2 Tage
•
Gesamtdauer Methodenentwicklung 0,5 Wochen
17
Methodenentwicklung chem. def. Produkt – Schnelle HPLC
0,50
0,45
Stat. Phase:
Acquity BEH C18
50 x 2.0 mm (1.7 µm)
Mob. Phase:
0,02 m NaHCO3/ACN 90/10 (v/v), pH = 10,5
Fluss:
0,5 ml/min
Temperatur:
30 °C
Wellenlänge:
221 nm
HPLC-Anlage:
Waters Acquity UPLC
0,40
0,35
AU
0,30
Wirkstoff
0,25
0,20
0,15
0,10
VU
0,05
0,00
0,00
1,00
2,00
3,0
18
Arzneimittel mit chemisch definiertem Wirkstoff:
Betrachtung Methodenentwicklung – Schnelle HPLC
•
Schnelle Gehalts- und Reinheitsbestimmung
– Probenvorbereitung
•
Verkürzung der Gesamtdauer der Methodenentwicklung nicht so
groß
– Initiale Analysendauer kurz
•
Herausforderung Zersetzung des WS auf der Säule gelöst
19
Zusammenfassung
• Schnelle HPLC im Dienstleistungsbereich
– Vorteile:
• Methodenentwicklung
• Phytopharma-Analytik
• Instabile Substanzen
– Einschränkungen
• relativ kleine Probenzahl
• Probenvorbereitung als geschwindigkeitsbestimmender Schritt
• Geringe Verbreitung der UHPLC-Anlagen
20
Firmen und Dienstleistungen
Pharmazeutische Analytik, Referenzstandards,
Drug Safety & Non-Clinical Assessment
www.hwi-analytik.com
Regulatory Affairs
www.i-dras.com
Mikrobiologie, Pharmazeutische Analytik
www.laz-labor.com
Pharmazeutische F&E, Produktentwicklung
www.sercona.org
21
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Gesundheitswesen
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