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32 6 Zusammenfassung Bioaktive Peptide, wie z.B. die

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6 Zusammenfassung
Bioaktive Peptide, wie z.B. die Säugerhormone Thyreoliberin oder Gastrin, weisen N-terminal
einen Pyroglutamylrest (pGlu) auf. In vielen Fällen ist dieser essentiell für die Ausbildung der
physiologisch aktiven Struktur dieser Peptide. Wie gezeigt werden konnte, entsteht die Nterminale Modifikation dieser Hormone durch Zyklisierung eines Glutaminylrestes eines
Vorgängermoleküls. Glutaminyl-Cyclasen (QC; EC 2.3.2.5) sind im Tier- und Pflanzenreich
vorkommende Enzyme, welche diese Umsetzung katalysieren. Die bisher bekannten QCs der
Säuger und Pflanzen sind monomere Glykoproteine mit ähnlicher molekularer Masse von ca. 40
und 33 kDa. Die Enzyme werden über den sekretorischen Expressionsweg gebildet und von den
Zellen sezerniert. Diese scheinbare Homologie zwischen Säuger- und pflanzlicher QC spiegelt
sich jedoch nicht in der Primärstruktur wider. Während die pflanzlichen Glutaminyl-Cyclasen
offenbar eine eigene Enzymfamilie darstellen, zeigen die hoch homologen QCs der Säuger
strukturelle Ähnlichkeiten zu bakteriellen Aminopeptidasen.
Neben tierischen Hormonen weisen auch amyloidogene Peptide an ihrem N-Terminus
Pyroglutamylreste auf. Bis zu 50 % der Ablagerungen des Peptids βA4 im Gehirn von Patienten
mit Alzheimerscher Erkrankung oder Down Syndrom zeigen diese N-terminale Modifikation.
Der Präkursor des Pyroglutamats dieser Peptide ist jedoch nicht Glutamin, sondern Glutamat.
Eine Involvierung der QC in die Bildung dieser besonders toxischen Peptide, die verstärkt zur
Aggregation neigen, wurde daher noch nicht untersucht.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Betrachtung der katalytischen
Eigenschaften der humanen QC und der pflanzlichen QC aus Carica papaya. Es sollte
untersucht werden, ob sich die strukturellen Unterschiede in differenten enzymologischen
Charakteristika widerspiegeln.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war zu prüfen, ob humane QC und QC aus C. papaya Nterminale Glutamylreste unter Wasserfreisetzung zyklisieren. Die humane QC würde dadurch ein
potentielles Zielenzym für eine Wirkstoffentwicklung zur Behandlung neurodegenerativer
Erkrankungen darstellen.
Zur Bearbeitung der Aufgaben wurden neue, kontinuierliche Testmethoden zum Nachweis der
QC-Aktivität entwickelt und die heterologe Expression der humanen QC in der Hefe Pichia
pastoris etabliert. Die pflanzliche QC wurde aus Papaya Latex gereinigt. Die folgenden
Ergebnisse können zusammenfassend formuliert werden:
1. Humane QC und Papaya-QC zeigen eine sehr ähnliche katalytische Spezifität gegenüber
Oligopeptiden und eine ähnliche pH-Abhängigkeit des Substratumsatzes. In beiden
Fällen beeinflusst der Protonierungszustand des Substrates die Substratbindung.
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Unterschiede bestehen hauptsächlich in der Umsetzung von Dipeptid-Substraten und
nicht-physiologischen Dipeptid-Analoga sowie in der Inhibitorspezifität.
2. Imidazol-N1-Derivate wurden als potente kompetitive Inhibitoren der humanen QC
identifiziert. Die Charakterisierung ihrer Bindung zum Enzym weist auf eine essentielle
Interaktion zwischen basischem Ringstickstoff und dem aktiven Zentrum des Proteins
hin. Die Aktivität der pflanzlichen QC wurde durch die Inhibitoren nicht beeinflußt.
3. Die Inhibierung der humanen QC durch heterozyklische Chelatoren identifiziert das
Protein als metallabhängiges Enzym. Inaktiviertes Enzym konnte mittels Zink-Ionen
reaktiviert werden. Ein Metallion im aktiven Zentrum ist somit auch potentieller
Wechselwirkungspartner für die inhibitorisch wirkenden Imidazolderivate. Die
Chelatoren beeinflussten die Katalyse der Papaya-QC nicht.
4. Die Identifikation einer essentiellen Disulfidbrücke in der humanen QC und die
Metallabhängigkeit bestätigen die strukturelle Verwandtschaft der Säuger-QC zu
bakteriellen Zn-abhängigen Aminopeptidasen.
5. Humane und Papaya-QC katalysieren die Umsetzung N-terminaler Glutamylreste.
Die Ergebnisse weisen auf eine generell ähnliche Wirkungsweise der analogen QC tierischen
und pflanzlichen Ursprungs hin. Die unterschiedliche Inhibierbarkeit beider QCs ist z.Zt. nur mit
möglichen strukturellen und daraus resultierenden mechanistischen Differenzen erklärbar. Es ist
jedoch noch unklar, wie die pflanzliche QC die Reaktion beschleunigt. Die Metallabhängigkeit
der Katalyse tierischer QCs weist in Analogie zu Aminopeptidasen auf eine Interaktion des
Metallions mit der γ-Carbonylgruppe des N-terminalen Glutamins im Substrat hin, was zur
Beschleunigung der intramolekularen Reaktion führt.
Die Umsetzung der N-terminalen Glutaminyl- oder Glutamylreste der amyloidogenen βA4
Peptide durch die humane QC könnte auf eine wichtige Rolle bei der Entstehung der
Alzheimerschen Erkrankung und anderer Amyloidosen hinweisen. Obwohl die Nachweise einer
derartigen Beteiligung auf zellulärer Ebene noch ausstehen, sind die im Rahmen dieser Arbeit
gewonnenen
Erkenntnisse
richtungweisend
für
nachfolgende
Untersuchungen
zur
physiologischen und pathophysiologischen Funktion der QC und stellen einen Ausgangspunkt
für die Entwicklung potentieller Wirkstoffe dar.
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Gesundheitswesen
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