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Allgemeine Methoden

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Identifizierung von Proteinen
 Genom bekannt, Proteinsequenzen in der Datenbank abgelegt:
- Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie
Methode der Wahl, sehr empfindlich,
in der Regel einige Femtomol eines Proteins ausreichend
- N-terminale Sequenzierung und/oder Sequenzierung von Peptiden mit Edman-Abbau,
nur noch selten durchgeführt
in der Regel einige picomol eines Proteins erforderlich
 Genom nicht sequenziert:
Aufklärung der kompletten Primärstrukur erforderlich,
häufigste Strategie:
Peptidsequenzen  Oligonukleotide  PCR cDNA-Klon 
Screenen einer Genbank  Sequenzieren von cDNA-Klonen
Erstellen von Protein-/Peptidsequenzen
Edman-Abbau (erste Wahl)
Massenspektrometrische Sequenzierung (de novo Sequenzierung, häufig problematisch)
Isolierung und Identifizierung von Proteinen im Mikromaßstab:
1. Anreicherung
(Methode abhängig von dem jeweiligen Protein)
- Subzelluläre Fraktionierung (z.B. Isolierung von Mitochondrien, Zellkerne durch
Zentrifugation)
- Differenzielle Extraktion/Fällung
- Chromatographie
1. Affinitäts-Chromatographie
2. Ionenaustausch-Chromatographie
3. Adsorptions-/Verteilungschromatographie
4. Gel Filtration
2. Trennung durch Gel-Elektrophorese (universell anwendbar)
- SDS- Gel-Elektrophorese
- 2D- Gel-Elektrophorese
3. Analyse der Banden / Spots durch Massenspektrometrie
Strategien zur Identifizierung/Sequenzierung von
Proteinen und Peptiden
Protein-Gemisch
Trennung auf
SDS-Gel/ 2D-Gel
Blot auf PVDFMembran
Bande/Spot
ausschneiden
In-Gel Verdau
mit Proteasen
N-terminale Sequenz
Edman-Abbau
> 5 pmol
Extraktion der Peptide
HPLC-Trennung
Massenspektrometrie
Datenbanksuche mit
MS-/MS/MS-Daten
<< 1pmol
Peptidsequenzen
Edman-Abbau
> 50 pmol
Edman-Abbau
O
H
H2N CH C N C C N
H
H
R
R
O
+
N C S
R
NH CH
H+
(wasserfrei)
N
H
H
N
H
C
C O
S
+
R
CH
N
H
C
-
H+
neuer Zyklus
C O
S
R
NH CH
C
NH
Phenylthiohydantoin
PTH-Aminosäure
O
H
H2N C C N
H
R
+
N
Thiazolinon
R
+
NH CH
O
H
N C C N
H
H
R
S
O
O
H
CH C N C C N
H
H
R
R
N C N
H
H
O
C
C
S
Base
R
NH CH
C O
S C
N
S
C O
OH
intermediäre
Ringöffnung
-
+
Reagents in
Glass block
Glass fibre
filter disc
Reagents out
häufige N-terminale Blockierung von Proteinen:
Bildung von Pyroglutamat
O
H2N HC C
O
NH ....
HN HC C
CH2
H2N
C
C
NH3
CH2
O
NH ....
CH2
CH2
O
Acetylierung/Acylierung
O
O
H2N CH
R
C
NH ....
CH3 C NH CH
O
R
C
NH ....
Frequently used enzymes for fragmentation of proteins
Enzyms (major sources)
EC-number
Specificity (X-↓-Y)
pH optimum
Enzymes of high specificity
Endoproteinase Arg-C
(Clostridium histolyticum)
Endoproteinase Lys-C
(Achromobacter lyticus,
(Lysobacter enzymogenes)
Trypsin (Bos taurus)
Endoproteinase Glu-C
(Staphylococcus aureus)
Endoproteinase Asp-N
(Pseudomonas fragi)
3.4.22.8
Arg-↓-Y
7-8
3.4.21.50
Lys-↓-Y
8-9
3.4.21.4
Lys-↓-Y, Arg-↓-Y
7-9
3.4.21.19
Glu-↓-Y, (Asp-↓-Y) *
8 (4)
3.4.24.33
X-↓-Asp
7-8
Major cleaved bonds:

X = Tyr, Phe, Trp, (Leu)
X,Y = aromatic, large aliphatic aa
X = Ala, uncharged, non-aromatic aa,
Y = L, F and other aromatic or large
hydrophobic aa
7-9
Enzymes of lower specificity
Chymotrypsin (Bos taurus)
Pepsin (sus scrofa)
Elastase (sus scrofa)
Thermolysin (Bacillus
thermoproteolyticus)
3.4.21.1
3.4.23.1
3.4.21.36
3.4.24.27
* Glu-: ammonium bicarbonate, pH 7.8, ammonium acetate, pH 4.0,
Glu-, Asp-:phosphate buffer, pH 7.8, (cleavage at Asp often slow)
aa = amino acid
1.8 - 2.5
8-9
8
BrCN-Spaltung
O
H
-NH C
C
CH2
CH2
S
CH3
O
H
-NH C C N
H
CH2
CH2
O
N CH C NH
H R
-Br-
Br
O
CH C
R
-NH
NH
C
H2C
O
N
H
O
CH C NH
R
CH2
+ S CN
NC
H
C
CH3
+ S CN
CH3
-NH
H
O
C
H
C
H2C
O
+ H2 O
CH C NH
R
N
H
O
-NH
- H+
C NH
O
CH C NH
R
CH2
-NH
H
C
O
C
H2C
O
CH2
Homoserin
O
+
H2C
CH2
-NH
H
C
H
C
H2C
CH2
OH
O
C
OH
Homoserinlacton
O
+
H2N CH C NH
R
+
S CN
CH3
Reversed-Phase-Chromatographie
R
R
Si OH
+
Cl Si
R
(CH 2)17 CH3
Si O
- HCl
Silan
Si
(CH 2)17 CH3
R
Derivatisierung des Kieselgels mit Silanen: Oberfläche wird unpolar
mobile Phase
polar
stationäre Phase
unpolar
R
Si O Si
R
O
R
Si O Si
R
(CH 2)17 CH3
CH3 CN
(CH 2)17 CH3
Analyt
/
H2O
Die Phasen sind im Vergleich zur
“normalen” Chromatographie an Kieselgel
umgekehrt, daher der Name
Reversed-Phase-Chromatogaphie
(RP-Chromatogaphie)
Theorie/Definitionen
Detektor-Signal
t R2
t R1
t0
Injektion
t0
Retentionskoeffizient:
Selektivität:
a =
w2
t R1
t R2
Zeit
t Rn - t 0
k´2
t0
k´1
t R2 - t R1
R = w
1 - w2
-
Auflösung:
k ´n =
w1
Bödenzahl:
N = 16
Bodenhöhe:
H =
tR 2
w
L
N
L = Säulenlänge
Detektor-Signal
schlechte Auflösung
t0
t R2
Zeit
Detektor-Signal
t R1
gute Auflösung aufgrund
höherer Bödenzahl
t R1
t R2
Zeit
Detektor-Signal
t0
gute Auflösung aufgrund
höherer Selektivität
t0
t R1
t R2
Zeit
Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen
Eddy-Diffusion ( A )
B
longitudinale Diffusion ( _u )
Massentransport zwischen
( C u)
mobiler und stationärer Phase
Totvolumina im Chromatographie-System
van Deemter-Gleichung:
h = A +
_B
u + Cu
h = theoretische Bodenhöhe
u = Flussgeschwindigkeit
Eddy-Diffusion
Zeit
longitudinale Diffusion
Säule
Start
Massentransfer zwischen stationärer und mobiler Phase
Verteilung zwischen stationärer und
mobiler Phase benötigt eine gewisse Zeit
Fluss-Richtung
Verteilungsgeschwindigkeit variiert mit:
mobile Phase
- Diffusionskoeffizient des Analyten
in der stationären Phase
- Diffusionskoeffizient des Analyten
in der mobilen Phase
stationäre Phase
Bandbreite
langsame
Aquilibrierung
Bandbreite nach einiger Zeit
- Dicke der stationären Phase
- Partikelgröße
- Verteilungskoeffizient
- Flussrate
Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen
Eddy-Diffusion ( A )
B
longitudinale Diffusion ( _u )
Massentransport zwischen
( C u)
mobiler und stationärer Phase
Totvolumina im Chromatographie-System
van Deemter-Gleichung:
h = A +
_B
u + Cu
h = theoretische Bodenhöhe
u = Flussgeschwindigkeit
HPLC
(High Pressure Liquid Chromatography,
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
Hochdruckgradientensystem (pro Fließmittel eine Pumpe)
Niederdruckgradientensystem
Isokratische Elution, Gradientenelution
A
B
Fließmittel 1
Absorption
C
D
isokratisch:
A B
C
D
Absorption
Fließmittel 2
(höhere Elutionskraft)
Die Zusammensetzung des Fließmittels
bleibt während der Trennung konstant
Zeit
C
D
Gradient:
Die Zusammensetzung des Fließmittels
ändert sich während der Trennung hin
zu höherer Elutionskraft
Absorption
AB
Zeit
Funktionsweise eines Injektionsventils
Ventilstellung:
Inject
Load
von der Injektionsspritze
V
V
zum AbfallBehälter
V
V
V
V
Probenschleife
von der
Pumpe
von der
Pumpe
V
zur Säule
V
zur Säule
Trennung tryptischer Peptide von Ferritin durch
Reversed-Phase-Chromatographie
0.01
Start
Absorption [220 nm]
0.05
0
20
40
Retentionszeit [min]
60
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