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Dokumentvorlage für Diplomarbeiten - FreiDok - Albert-Ludwigs

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Aus der Klinik für Neurochirurgie
Sektion Klinische Neuropharmakologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.
Weiterentwicklung eines fokalen
neokortikalen Epilepsiemodells Lokale Epilepsietherapie bei Patienten
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.
vorgelegt 2014
von Silvanie Volz
geboren in Stuttgart
Dekanin:
Prof. Dr. Kerstin Krieglstein
1. Gutachter:
Prof. Dr. Thomas J. Feuerstein
2. Gutachter:
Prof. Dr. Wolf A. Lagrèze
Jahr der Promotion:
2014
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
IV
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ............................................................................ IV
Abkürzungsverzeichnis ................................................................VIII
1. Einleitung ........................................................................................ 1
1.1 Epilepsie ..................................................................................................... 1
1.2 Epilepsietherapie ........................................................................................ 2
1.2.1 Antikonvulsiva – Pharmakotherapie der Epilepsien ........................... 3
1.2.1.1 Valproat ............................................................................................................ 4
1.2.1.2 Diazepam .......................................................................................................... 5
1.2.1 Lokale Epilepsietherapie ..................................................................... 5
1.3 Tiermodell der fokalen neokortikalen Epilepsie........................................ 6
1.3.1 Histologische Veränderung im Tiermodell ......................................... 8
1.4 Elektroenzephalographie ........................................................................... 9
1.4.1 Automatische Elektroenzephalogramm-Auswertungsprogramme ..... 9
1.5 Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zum Thema des neokortikalen
Epilepsiemodells und der lokalen Epilepsietherapie ..................................... 10
1.6 Ziele der Arbeit ........................................................................................ 12
2. Material und Methoden .............................................................. 14
2.1 Tierversuche ............................................................................................. 14
2.1.1 Versuchsaufbau ................................................................................. 14
2.1.2 Versuchstiere ..................................................................................... 15
2.1.3 Weiterentwicklung des Modells im Vergleich zu den Vorversuchen15
2.1.4 Operation ........................................................................................... 16
2.1.4.1 Operationsvorbereitungen .............................................................................. 17
2.1.4.2 Narkoseeinleitung und Lagerung ................................................................... 19
2.1.4.3 Operationsvorgänge ....................................................................................... 20
Elektrodenplatzierung ................................................................................................ 21
Präparation des neokortikalen Fokus ......................................................................... 21
Inhaltsverzeichnis
V
Tetanus Toxin-Injektion ............................................................................................. 22
Nachinjektion von Tetanus Toxin .............................................................................. 24
Kobaltdraht ................................................................................................................. 25
Scheinoperation .......................................................................................................... 26
Fixationsschrauben ..................................................................................................... 26
Elektrodenfixierung und -konnektion ........................................................................ 26
2.1.4.4 Analgesie und Narkoseausleitung .................................................................. 26
2.1.5 Therapieversuch – Fallbericht Ratte Nr. 11 ...................................... 27
2.1.6 Video-Elektrokortikographie-Aufnahmen ........................................ 27
2.1.6.1 Datenanalyse .................................................................................................. 28
2.1.7 Histologie .......................................................................................... 30
2.1.7.1 Pefusionsfixation ............................................................................................ 30
2.1.7.2 Vibratomschnitte ............................................................................................ 32
2.1.7.3 Nissl-Färbung ................................................................................................. 32
2.1.7.4 Mikroskopische Beurteilung und Quantifizierung der Gehirnläsion ............. 33
2.2 Vergleich der visuellen mit der automatischen ElektrokortikogrammAuswertung .................................................................................................... 34
2.2.1. Bewertung der automatischen Elektrokortikogramm-Auswertung . 34
2.3 Lokale subdurale Valproatapplikation am Menschen bei pharmakoresistenten fokalen neokortikalen Epilepsien: intraoperative Pilotstudie ...... 36
2.3.1 Patientenkollektiv und Durchführung ............................................... 36
2.3.2 Datenauswertung ............................................................................... 38
3 Ergebnisse ...................................................................................... 40
3.1 Studienpopulation .................................................................................... 40
3.1.1 Gruppe I: Ratte Nr. 4-7 mit 3 x 62.6 ng TeT und 7.5 mg CoCl2 ...... 42
3.1.1.1 Ratte Nr. 4 ...................................................................................................... 42
3.1.1.2 Ratte Nr. 5 ...................................................................................................... 44
3.1.1.3 Ratte Nr. 6 ...................................................................................................... 45
3.1.1.4 Ratte Nr. 7 ...................................................................................................... 48
Zusammenfassung Gruppe I....................................................................... 50
3.1.2 Gruppe II: Ratte Nr. 8-12 TeT unterschiedlicher Dosierung ............ 51
Inhaltsverzeichnis
VI
3.1.2.1 Ratte Nr. 8 ...................................................................................................... 51
3.1.2.2 Ratte Nr. 9 ...................................................................................................... 53
3.1.2.3 Ratte Nr. 10 .................................................................................................... 55
3.1.2.4 Ratte Nr. 11 .................................................................................................... 58
3.1.2.5 Ratte Nr. 12 .................................................................................................... 63
Zusammenfassung Gruppe II ..................................................................... 65
3.1.3 Gruppe III: Ratte Nr. 13 Kobaltdraht ................................................ 67
3.1.2.6 Ratte Nr. 13 .................................................................................................... 67
3.1.3 Gruppe IV: Kontrollgruppe ............................................................... 68
3.2 Histologische Ergebnisse ......................................................................... 71
3.2.1 Statistische Auswertung der Ausmessungen der Läsion................... 75
3.3 Ergebnisse der automatischen Anfallsdetektion - Vergleich der visuellen
mit der automatischen Elektrokortikogramm-Auswertung ........................... 77
3.3.1 Sensitivität der automatischen Anfallsdetektion ............................... 79
3.4 Ergebnisse der lokalen subduralen intraoperativen Valproat-Applikation80
3.4.1 Ergebnisse Patient Nr. 1 .................................................................... 80
3.4.2 Ergebnisse Patient Nr. 2 .................................................................... 82
4. Diskussion ..................................................................................... 84
4.1 Tiermodell ................................................................................................ 84
4.1.1 Tetanus Toxin-Effekt ........................................................................ 89
4.1.2 Mortalität im Tiermodell ................................................................... 90
4.1.3 Kobaltdraht-Modell ........................................................................... 90
4.1.4 Kontrolltiere ...................................................................................... 91
4.1.5 Video-Elektroenzephalographie-Ableitebedingungen ...................... 92
4.1.6 Therapieversuch ................................................................................ 94
4.1.6.1 Systemische Valproat-Therapie in Tiermodellen ........................................... 95
4.1.6.2 Systemische Diazepam-Therapie in Tiermodellen ........................................ 96
4.1.6.3 Lokale medikamentöse Epilepsietherapie in Tiermodellen ........................... 96
4.2 Lokale subdurale Valproatapplikation bei pharmakoresistenten fokalen
neokortikalen Epilepsien: intraoperative Pilotstudie ..................................... 99
Inhaltsverzeichnis
VII
4.3 Histologie ............................................................................................... 100
4.4 Vergleich der automatischen Auswertung mit der visuellen ................. 102
5. Zusammenfassung ..................................................................... 104
Abbildungsverzeichnis .................................................................. 105
Tabellenverzeichnis ....................................................................... 107
Literaturverzeichnis ...................................................................... 108
Veröffentlichungen und Kongressbeiträge ................................. 118
Danksagung .................................................................................... 119
Lebenslauf....................................................................................... 120
Anhang ............................................................................................ 121
Abkürzungsverzeichnis
VIII
Abkürzungsverzeichnis
AED
Antiepileptikum (von engl. antiepileptic drug)
BSA
Rinderalbumin (von engl. bovine serum albumin)
CoCl2
Cobalt(II)-chlorid
CT
Computertomographie
DGN
Deutsche Gesellschaft für Neurologie
DZP
Diazepam
ECoG
Elektrokortikographie
EEG
Elektroenzephalographie
EMG
Elektromyographie
EPC
Epilepsia partialis continua
ETP
Epilepsietypisches Potential
GABA
γ-Aminobuttersäure (von engl. γ-aminobutyric acid)
ILAE
Internationale Liga gegen Epilepsie (von engl. International League
against Epilepsy)
i.p.
intraperitoneal
i.v.
intravenös
KG
Körpergewicht
MRT
Magnetresonanztomographie
NaCl
Natriumchlorid
OP
Operation
PB
Phosphatgepufferte Lösung (engl. phosphat buffer)
PBS
Phosphatgepufferte Salzlösung (von engl. phosphat buffered saline)
PCaL
Polycaprolacton
PFA
Paraformaldehyd
s.c.
subkutan
SUP
Suppressionsphase
TeT
Tetanus Toxin
VPA
Valproat
Ø
Durchmesser
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Epilepsie
Mit einer Prävalenz zwischen 0.5-1 % ist die Epilepsie eine der häufigsten neurologischen
Erkrankungen [42, 46, 115, 117]. Ihre Inzidenz liegt bei 46/100 000 Personen pro Jahr und
zeigt zwei Altersgipfel. Bei etwas mehr als 30 % tritt die Erkrankung bereits im Kindesalter
auf, während ein ca. gleich großer Anteil erst mit über 60 Jahren erkrankt [42]. Weltweit sind
50 Millionen Menschen betroffen [79, 140].
Unter einer Epilepsie versteht man eine chronische neurologische Erkrankung, die durch
wiederkehrende epileptische Anfälle gekennzeichnet ist [50]. Die Diagnose kann schon nach
dem ersten epileptischen Anfall gestellt werden, wenn „zusätzlich Befunde vorliegen, die auf
die Prädisposition für weitere epileptische Anfälle hinweisen“ [42].
Epileptische Anfälle werden von der Deutschen Gesellschaft für Neurologie (DGN)
definiert als „vorübergehende, plötzliche Dysfunktionen des zentralen Nervensystems, deren
Phänomenologie auf abnormen neuronalen Entladungen der Hirnrinde basiert. Es kommt zu
hochsynchronen und hochfrequenten pathologischen, zeitlich begrenzten Entladungsfolgen
topologisch variabler und unterschiedlich großer Gruppen von Nervenzellen“ [42]. Diese
abnormen neurologischen Entladungen äußern sich je nach Epilepsietyp in sehr
unterschiedlichen Symptomen und können von einer Einschränkung der Lebensqualität bis
hin zu einem erhöhten Risiko von anfallsassoziierten Unfällen, eines plötzlichen,
unerwarteten Todes und einer erhöhten Gesamtmortalität bei generalisierten Anfällen führen
[23, 104, 108, 111]. Aufgrund ihrer Heterogenität können Epilepsien auf verschiedene
Weisen in Gruppen und Untergruppen klassifiziert werden. Üblicherweise werden sie nach
ätiologischen Gesichtspunkten eingeteilt [9, 42]. Hierfür hat die Internationale Liga gegen
Epilepsie (ILAE = International league against epilepsy) aufgrund neuer Erkenntnisse 2010
eine aktuelle Klassifikation vorgeschlagen [9], die 2012 in die Leitlinien der DGN
aufgenommen wurde [42]:
Tabelle 1-1: Klassifikation der Epilepsien
Neue Klassifikation
Alte Klassifikation
Genetisch
Idiopathisch
Strukturell/metabolisch
Symptomatisch
Unbekannt
Kryptogen
Einleitung
2
Epileptische Anfälle werden weiterhin in zwei große Gruppen eingeteilt: generalisierte und
lokalisationsbezogene/fokale Anfälle, wobei die Begriffe neu definiert wurden. Unter
generalisierten Anfällen versteht man Anfälle, „die in einem bilateral verteilten Netzwerk
auftreten und sich dort rasch ausbreiten“ [9], wobei fokale Anfälle „in einem auf eine
Großhemisphäre beschränkten Netzwerk auftreten und dabei eng umschrieben oder weiter
ausgebreitet sein können“ [9]. Die Mehrheit der Patienten leidet unter letzteren (60-70 %) und
nur ca. ein Drittel unter generalisierten Anfällen [62, 117].
Die Klassifikationen der Epilepsien und der epileptischen Anfälle entwickeln sich mit den
neuen Erkenntnissen in Klinik und Forschung kontinuierlich weiter. Ein geschichtlicher
Überblick mit den bisherigen Entwicklungen der Definitionen wird in dem Review von Korff
und Scheffer (2013) [73] wiedergegeben.
1.2 Epilepsietherapie
Das oberste Ziel einer suffizienten antiepileptischen Therapie ist es, Anfallsfreiheit zu
erreichen ohne dabei stärkere Nebenwirkungen zu verursachen. Die Mindestanforderung einer
Therapie ist es die Anfallsfrequenz, sowie den -schweregrad zu reduzieren.
Trotz der Entwicklung verschiedener neuer Antiepilektika (AED) lassen sich nur zwei
Drittel der an Epilepsie leidenden Patienten medikamentös zufriedenstellend therapieren [77,
88], wobei die Pharmakotherapie sehr häufig lebenslang erfolgen muss [42]. Bei etwa 2040 % der Patienten, bei denen keine komplette Anfallskontrolle erreicht werden kann, stellt
die Pharmakoresistenz ein zentrales Problem dar [22, 77, 79, 117, 122]: Die Lebensqualität
wird durch die Erkrankung reduziert, das Risiko eines vorzeitigen Todes und von Unfällen ist
erhöht, psychosoziale Dysfunktionen treten auf und insgesamt ist somit das Therapieergebnis
unbefriedigend [33, 79, 80, 96, 99]. Besonders hoch ist der Anteil pharmakoresistenter
Epilepsien bei Anfällen mit fokalem Ursprung [5, 51].
Daraus resultiert die Motivation, neue Therapiemethoden zu entwickeln. Um den
Patienten diese auch schneller anbieten zu können, hat die ILAE Pharmakoresistenz neu
definiert: „Wenn nach adäquaten Behandlungsversuchen mit zwei vertragenen, geeigneten
und angemessen angewendeten Antiepileptika keine Anfallsfreiheit erreicht wird, soll von
Pharmakoresistenz gesprochen werden.“ [42, 78]. Auch diese Definition wurde 2012 in die
Leitlinien der DGN übernommen. Davon müssen alle Patienten mit falscher Diagnose,
falscher Wahl des AED, falscher Dosis und Incompliance bezüglich der Einnahme abgegrenzt
werden. Wenn die Definition für einen Patienten zutrifft, können ihm derzeit, je nach
Epilepsietyp, verschiedene alternative Therapiemethoden angeboten werden. Für einige
Einleitung
3
Patienten mit beispielsweise einer pharmakoresistenten fokalen Epilepsie, stellt die
Epilepsiechirurgie eine bewährte Therapieoption dar, wenn ein eindeutiger Fokus identifiziert
werden kann [126, 133]. Hierdurch kann unter anderem die Lebensqualität der Personen
gesteigert werden [129]. Wenn der Fokus jedoch in einem wichtigen, funktionell
unverzichtbaren Areal, wie beispielsweise dem Motorkortex, dem Sprachzentrum oder der
Sehrinde liegt und durch eine operative Entfernung des jeweiligen Hirnareals ein zu großes,
dauerhaftes
neurologisches
Defizit,
wie
z.B.
Halbseitenlähmung,
Sprach-
oder
Gesichtsfeldausfall entstehen würde, dann ist diese alternative Therapiemöglichkeiten
aufgrund der schwerwiegenden Folgen ausgeschlossen. Weitere alternative Optionen sind
beispielsweise die tiefe Hirnstimulation, die Vagus-Nerv-Stimulation [42] sowie die GammaKnife-Therapie [37, 123]. Letzteres kann bei chirurgisch schwer erreichbaren Fokussen
eingesetzt werden, ist jedoch durch die Limitation unentbehrlicher Areale auch nur bedingt
anwendbar [37, 123].
Insgesamt konnte der Anteil therapierefraktärer Patienten trotz neuer Therapieoptionen
nicht ausreichend gesenkt werden. Deshalb ist die Entwicklung weiterer Möglichkeiten, wie
z.B. die lokale medikamentöse Therapie für fokale Epilepsien, notwendig.
1.2.1 Antikonvulsiva – Pharmakotherapie der Epilepsien
Antikonvulsiva, oder im allgemeinen Sprachgebrauch auch als AED bezeichnet, sind die erste
Wahl für die Behandlung von Patienten mit Epilepsie.
Der Begriff AED ist eigentlich inkorrekt, da durch die derzeitigen Medikamente die
Epilepsie nicht geheilt werden kann, sondern bislang nur die Anzahl und die Stärke der
Anfälle reduziert werden. Der korrekte Ausdruck ist also derzeit noch Antikonvulsivum. Da
die Bezeichnung AED im klinischen Alltag üblicherweise synonym Verwendung findet, wird
er auch hier weiterhin angewendet.
Der erste bekannte medikamentöse Therapieversuch wurde bereits 1857 mit
Kaliumbromid in der Zeitschrift Lancet beschrieben. Die nächste bedeutende Entdeckung der
Pharmakotherapie für Epilepsien war 1912 der Wirkstoff Phenobarbital [16]. Dieses
Medikament wird zusammen mit Carbamazepin, Phenytoin und Valproat (VPA) noch heute
zu den Standard-AED der WHO gezählt und kann laut dieser, wenn seine Nebenwirkungen
akzeptabel scheinen, als erste Option angeboten werden.
Im Laufe der Zeit wurden eine Reihe weiterer AEDs entwickelt und schließlich 1990 die
zweite Generation der AED für den klinischen Gebrauch eingeführt. Hierzu zählen Felbamat,
Vigabatrin, Tiagabin, Lamotrigin, Gabapentin, Topiramat, Oxacarbamazepin, Levetiracetam,
Pregabalin und Zonisamid [130].
Einleitung
4
Die antikonvulsiven Medikamente der ersten und zweiten Generation wirken über
verschiedene molekulare Mechanismen. Dazu zählen die Förderung der Inaktivierung
spannungsabhängiger Na+-Kanäle, genauso wie die spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle, die
rezeptorgekoppelte Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit von Cl--Kanälen, der
verlangsamte Abbau des hemmenden Neurotransmitters γ-Aminobuttersäure (GABA), sowie
die Wiederaufnahmehemmung von GABA [46]. Über die verschiedenen Wirkmechanismen
soll selektiv die Erregbarkeit von Nervenzellen blockiert werden, sodass durch einen Anfall
hervorgerufene Entladungen blockiert werden können ohne dabei nicht-epileptische neuronale
Aktivitäten zu stören [130].
1.2.1.1 Valproat
Abb. 1-1: Strukturformel Valproat
VPA ist ein weit verbreitetes AED der 1. Generation. Es wurde zufällig 1963 von Pierre
Eymard in Lyon entdeckt, als er verschiedene Khellinin- und Cumarin-Derivate in
Valproinsäure löste, um diese auf ihre antiepileptische Wirkung zu untersuchen. Dabei fand er
heraus, dass das Lösungsmittel Valproinsäure antikonvulsiv wirksam ist, nicht jedoch die
gelösten Substanzen [16].
Heute besitzt VPA ein breites Indikationsspektrum bei primär generalisierten,
unklassifizierten, fokalen und sekundär generalisierten Anfällen. Es wirkt über verschiedene
Mechanismen: Förderung der Inaktivierung spannungsabhängiger Na+- und Ca2+-Kanäle und
Verstärkung der GABAergen Transmission [46].
Außer in der Epilepsietherapie wird VPA auch zur Therapie weiterer Erkrankungen
eingesetzt: In der Psychiatrie bei manischen oder bipolaren Erkrankungen, zur
Migräneprophylaxe und -therapie, in Kombination mit Imatinib in der Therapie der Chronisch
Myeloischen Leukämie und weiteren [102, 103].
Neben zahlreichen positiven Effekten kann VPA auch zu einigen gefährlichen
Nebenwirkungen führen, die den Abbruch der Therapie erfordern: Thrombozytopenie,
Fibrinverminderung, Hepatotoxizität, Pankreatitis und Teratogenität. Auch harmlosere
Nebenwirkungen wie Übelkeit, Tremor, Alopezie und Gewichtszunahme führen häufig dazu,
dass Patienten das Medikament absetzen [46].
In der Therapie der fokalen Epilepsien hat es dennoch seinen wichtigen Stellenwert.
Einleitung
5
1.2.1.2 Diazepam
Abb. 1-2: Strukturformel Diazepam
Diazepam (DZP) gehört zu den speziell beim Status epilepticus indizierten Benzodiazepinen.
Diese wirken über GABAA-Rezeptoren und erhöhen die Öffnungswahrscheinlichkeit von Cl-Kanälen. Dies wiederum führt in den meisten Fällen zur Hyperpolarisation der Neurone und
vermindert dadurch die Erregbarkeit der Zelle. Akute Nebenwirkungen stellen Sedation,
Atemdepression, Ataxie und Hypotonie dar [46].
Da DZP langfristig, wie auch die anderen Benzodiazepine, zu Toleranzentwicklung und
Abhängigkeit führt, ist es als Langzeitantikonvulsivum ungeeignet. Für die Therapie des
Status epilepticus sind die Benzodiazepine jedoch unentbehrlich.
1.2.1 Lokale Epilepsietherapie
Bisher werden AED meist oral oder intravenös (i.v.) verabreicht. Um eine akzeptable
Anfallskontrolle zu erreichen, sind häufig hohe Plasmakonzentrationen der AED im Blut
notwendig, woraus jedoch untragbare Nebenwirkungen resultieren können. Außerdem kann
aufgrund der Bluthirnschranke häufig keine ausreichende Wirkkonzentration am Zielort
aufgebaut werden. Diese erlaubt nur den Transport ausreichend lipophiler Stoffe [110] mit
kleiner molekularer Masse [113]. Darüber hinaus befördern Multidrug-Transporter die
Pharmaka aktiv aus den Nervenzellen heraus [81, 85] und über die Bluthirnschranke zurück
ins Gefäßsystem, wodurch das Erreichen einer adäquaten Wirkkonzentration der AED im
zentralen Nervensystem schwierig und ihr systemischer Einsatz in hoher Dosierung aufgrund
von Nebenwirkungen begrenzt ist.
Eine Möglichkeit, die Bluthirnschranke und Multidrug-Transporter zu umgehen, ist die
lokale Verabreichung von AED. Darunter versteht man die direkte Applikation eines
Medikamentes auf das Hirnareal, sodass im zentralen Nervensystem eine hohe lokale
Wirkstoffmenge bei kleiner Gesamtdosis und geringer systemischer Toxizität erreicht wird [8,
41]. Somit kommt es nicht zu den die Therapie begrenzenden üblichen Nebenwirkungen.
Außerdem eröffnet sich die Möglichkeit, auch potente Medikamente mit schlechter
Bioverfügbarkeit lokal anzuwenden, die bisher keine Wirkungen zeigten. Beispielsweise
weist Adenosin antikonvulsive Wirkungen auf [13, 39, 82, 134], findet jedoch infolge von
Einleitung
systemischen
6
Nebenwirkungen
bisher
keine
klinische
Verwendung
[38].
Durch
intraventrikuläre und intrahippocampale Verabreichung von Adenosin bei Ratten konnte eine
vorübergehende Anfallsreduktion gezeigt werden [13, 134]. Hieraus ergibt sich die Frage, ob
sich bei lokaler Verabreichung von Adenosin direkt über einem neokortikalen Fokus dieselbe
antikonvulsive Wirkung darstellt.
Das therapeutische Wirkungsprinzip einer lokalen neokortikalen Epilepsietherapie wurde
bereits durch Tamargo et al. (2002) [132] mit Phenytoin-beladenen Polymeren in einem
Kobalt-induzierten fokalen Epilepsiemodell der Ratte gezeigt.
Dieser neue Therapieansatz der lokalen Applikation auf den individuell identifizierten
epileptischen Fokus soll eine zukünftige Alternative für Patienten mit pharmakoresistenten
fokalen Epilepsien werden. Diese kann durch AED-beladene Polymere über dem
epileptischen Fokus [4, 132], oder Pumpen-gesteuerte AED-Injektionen [131, 134]
durchgeführt werden. Das Ziel sind sich selbst steuernde Pumpen mit Messsensoren, die je
nach Anforderung präiktal, iktal oder interiktal verschiedene Konzentrationen der AED
applizieren und somit präzise auf den Erregungszustand der Neuronenverbände des ZNS
reagieren. Ein ähnliches Prinzip ist von der Diabetes mellitus-Therapie mit InsulinApplikation bekannt. Durch Polymer-vermittelte Medikamentenfreisetzung können diese
Regelungs-Anforderungen allerdings nicht erfüllt werden. Dies stellt vorab jedoch eine gute
Methode dar, um die Wirksamkeit der lokalen Therapie über einem neokortikalen
epileptischen Fokus zu überprüfen. Die bisherige Testung unserer Arbeitsgruppe zu lokalen
Therapieprinzipien wurde somit vorerst mit Polymerplättchen begonnen [4, 121]. Um die
Wirkung von lokal verabreichten VPA auf die epileptische Aktivität bei Patienten mit
pharmakoresistenten fokalen neokortikalen Epilepsien zu überprüfen, wurde zusätzlich eine
intraoperative Pilotstudie mit lokaler subduraler VPA-Applikation begonnen.
1.3 Tiermodell der fokalen neokortikalen Epilepsie
Um neue Therapieoptionen, wie z.B. Polymer-vermittelte oder Pumpen-gesteuerte lokale
AED-Freisetzung etablieren zu können, wird ein adäquates Tiermodell benötigt mit dem
präklinisch ihre Wirkung bewiesen werden kann [86].
Es existieren eine große Anzahl verschiedener Tiermodelle der Epilepsien sowohl in
gentechnisch veränderten als auch unveränderten Tieren, bei denen durch elektrische oder
chemische Stimulation in unterschiedlichen Gehirnregionen verschiedene Epilepsietypen
ausgelöst werden. Eine spezielle Methode, um eine Epilepsie zu erzeugen, ist das Kindling.
Hierbei werden durch repetitive unterschwellige Reize Anfälle erzeugt. Erstmals beschrieben
Einleitung
7
wurde das Kindlingmodell 1969 von Goddard et al., die Epilepsien durch wiederholte
elektrische Reize auslösten [54]. Andere Arbeitsgruppen berichten von chemischen
Kindlingmodellen [31].
Weiter unterscheidet man zwischen generalisierten und fokalen Epilepsiemodellen;
innerhalb dieser wird weiter differenziert zwischen akuten und chronischen, hippocampalen
und extrahippocampalen Modellen, spontanen und induzierten Anfällen etc. [86].
Das Interesse unserer Arbeitsgruppe gilt der Entwicklung eines chronischen fokalen
neokortikalen Epilepsiemodells, um Fortschritte in neuen, z.B. den oben beschriebenen,
Therapieoptionen hervorzubringen. Idealerweise sollten die Tiere einen chronischen
neokortikalen Fokus aufzeigen, der spontane wiederkehrende Anfälle mit nicht zu niedriger
Frequenz bei möglichst geringer Beeinträchtigung des Allgemeinzustandes produziert.
Außerdem muss das Modell zuverlässig, einfach zu reproduzieren, sowie zeit- und
kosteneffizient sein. (Eine detaillierte Beschreibung mit genauen Anforderungen an das
Modell befindet sich in 1.6 Ziele der Arbeit)
Chang et al. (2004) [19], Craig und Colasanti (1992) [27] und Colasanti et al. (1974) [25]
beschrieben ein subakutes fokales Epilepsiemodell mit spontanen, epileptischen Anfällen über
einen Zeitraum von 2-3 Wochen, das durch einen Kobaltdraht verursacht wurde. Ein weiteres
Modell, bei dem durch Kobaltpulver und Megimide (ein Barbiturat-Antagonist) epileptische
Aktivität ausgelöst wurde, ist von Dow et al. (1962) [35] bekannt. Auch bei diesem KobaltModell ist die Zeitspanne epileptischer Aktivität begrenzt.
Im Gegensatz dazu berichtete Nilsen et al. (2005) [106] über lang anhaltende und häufig
wiederkehrende nicht provozierte Anfälle in einem Rattenmodell nach neokortikaler Injektion
von 25-50 ng Tetanus Toxin (TeT).
Die Induktion eines neokortikalen Fokus mittels TeT wurde schon 1962 von Carrea und
Lanari in Hunden [17] und 1990 von Louis in Katzen dargestellt [89]. Die beiden Autoren
beschrieben im Gegensatz zu Nilsen et al. (2005) [106] nur ein zeitlich begrenztes
Epilepsiemodell, welches bei Louis sieben bis maximal 37 Tage und bei Carrea zwei Monate
anhielt. In den Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe konnte das von Nilsen et al. (2005) [106]
beschriebene Modell mit zuverlässigen, spontanen Anfällen nach TeT-Injektion selbst nach
starker Erhöhung der Dosis nicht reproduziert werden (siehe 1.7).
Insgesamt erweist sich die die Entwicklung eines zuverlässigen und validierten
Tiermodells für fokale neokortikale Epilepsien mit chronischen rekurrenten spontanen
Anfällen nicht nur in unseren Händen als sehr anspruchsvoll.
Einleitung
8
1.3.1 Histologische Veränderung im Tiermodell
Auch wenn die genaue Ursache und Pathogenese der verschiedenen Epilepsietypen noch
nicht vollständig erforscht ist, weiß man, dass primär fokale epileptische Aktivität häufig
durch strukturelle Läsionen verursacht wird oder mit solchen einhergehen. In bis zu 84 %
können mittels Magnetresonanztomographie (MRT) strukturelle Veränderungen gefunden
werden [76, 100].
Diese fokalen Veränderungen können unterschiedlicher Genese sein, wie beispielsweise
Narben nach einem Trauma oder einem Schlaganfall, intrazerebrale Blutungen, Tumoren,
kortikale Dysplasien, Hippokampussklerose, vaskuläre Malformationen oder weitere [9, 12].
Häufig sind diese fokalen Epilepsien therapierefraktär [5, 51, 95]. Die Läsionen sind
charakterisiert durch anatomische Anomalien. Beispielsweise kommt es durch Aussprossen
neuer exzitatorischer Axone und somit Ausbildung neuer Synapsen zur veränderten
neuronalen Konnektivität. Ein Verlust von GABAergen Interneuronen sowie eine Zunahme
der Aktivität glutamatergen Neurone führen zur Übererregbarkeit. Letztendlich kommt es
durch Kumulation verschiedener Faktoren zur Erzeugung spontaner Anfälle [107].
Es ist wichtig zu erwähnen, dass im Tiermodell ebenfalls Läsionen durch die verwendeten
proepileptogenen Substanzen erzeugt werden. Diese stellen sich meist in Form von nicht
epileptogenen Nekrosen dar, wo möglicherweise jedoch am Rande, d.h. am architekturgestörten Übergang, epileptische Anfälle ausgelöst werden.
Bei den verschiedenen Tiermodellen werden in der Literatur sehr unterschiedliche
histologischen Veränderungen beschrieben. Während durch Kobalt große ipsilaterale
Nekrosen beschrieben wurden, ungeachtet ob als Draht, Pulver oder Gelatine verabreicht, [19,
34, 35, 48], sind durch TeT hingegen keine oder nur minimale Läsionen berichtet worden [89,
97]. Nilsen et al. (2005, 2006) [105, 106] schrieben nichts über die Histologie. TeT führt eher
nicht durch eine Läsion, sondern wohl durch initiale Hemmung der Transmitterfreisetzung,
besonders der inhibitorischen, zu epileptischer Aktivität und Epileptogenese [10, 71, 142].
Die hemmende Wirkung auf die inhibitorische Transmitterfreisetzung ist besonders nach
Toxininjektion hoch und normalisiert sich mit der Zeit wieder. Es wird angenommen, dass
durch den initialen Effekt eine langfristige Veränderung neuronaler Verbindungen stattfindet,
was zu permanenter epileptischer Aktivität führt [43].
Auch bei Kobalt ist nicht eindeutig geklärt, welche Rolle eine Läsion spielt, oder in wie
weit andere Mechanismen mit einbezogen sind, siehe z.B. He et al. (2009) [64], Esclapez und
Trottier (1989) [45], Gerber und Gähwiler (1991) [52].
Einleitung
9
1.4 Elektroenzephalographie
Schon 1924 wurden die ersten elektroenzepahlographischen Aufzeichnungen am Menschen
von dem Neuropsychiater Hans Berger (1873-1941) registriert, die er jedoch erst fünf Jahre
später veröffentlichte [75, 146]. Nach der Bestätigung Berger’s Ergebnisse 1934 durch
Andrian & Matthews [1] begann eine rasante Entwicklung der Elektroenzephalographie
(EEG). Das EEG wurde in den klinischen Alltag eingeführt und zwischen 1950 und 1970 am
häufigsten genutzt, da es außer in der Epilepsiediagnostik früher zusätzlich als Ersatz für die
bildgebende Untersuchung des Gehirns diente. Mit Einführung der Computertomographie
(CT) in den 1970er Jahren, sowie der MRT in den 1980ern, wurde das Indikationsfeld wieder
kleiner, dafür aber immer spezifischer. In der Epilepsiediagnostik hat es weiter an Bedeutung
gewonnen, um Anfälle besser zu klassifizieren und gezielte Therapien durchzuführen [146].
Auch heute ist das EEG (in der Zusammenschau mit der Anamnese) die wichtigste
Zusatzuntersuchung, um die Diagnose Epilepsie stellen zu können, sie einzuteilen und
gezielte Behandlungen durchzuführen. Um bei fokalen Anfallstypen eine morphologische
Läsion darzustellen, werden häufig bildgebende Verfahren hinzugezogen. Diese führen
jedoch nur in Kombination mit Anamnese, EEG und Klinik zur Diagnose. Bei
therapierefraktären Verläufen werden Langzeit-Video-EEG-Ableitungen und intrakortikale
EEGs, so genannte Elektrokortikographien (ECoGs) durchgeführt.
1.4.1 Automatische Elektroenzephalogramm-Auswertungsprogramme
Langzeit-Video-EEG-Monitoring gehört zu den diagnostischen Methoden bei Patienten mit
unklaren rezidivierenden, nicht provozierten Anfällen, bei therapierefraktären Epilepsien
speziell
zur
prächirurgischen
Abklärung,
genauso
wie
zur
Differenzierung
von
nichtepileptischen klinischen Symptomen [18]. Hierbei fallen große Mengen an Video-EEGDaten an, weshalb automatische Programme zur Erleichterung und Beschleunigung der EEGAuswertung entwickelt wurden und noch weiterentwickelt werden.
Auch um die Epileptogenese eines Tiermodells vollständig und detailliert beurteilen zu
können, müssen 24h-EEG-Ableitungen erfolgen. Da bei der Entwicklung eines chronischen
Epilepsiemodells durch wochen- bis monatelangen Ableitungen demzufolge ebenfalls große
Datenmengen anfallen, ist die Evaluierung eines automatischen Auswerteprogrammes für
Tiermodelle von Interesse, um sich die Arbeit zu vereinfachen und schneller einen Überblick
zu gewinnen.
Schon 1982 wurden erste Anfallsdetektionsalgorithmen zur automatischen Auswertung
veröffentlicht [55] und bis heute weiter entwickelt und verbessert [61, 67]. Da es große
Einleitung
10
interindividuelle elektrophysiologische Unterschiede zwischen einzelnen Patienten (und auch
Ratten) gibt und einige dazu noch unterschiedliche Anfallstypen aufweisen, konnte bisher
keines der Programme eine 100%ige Anfallserkennung aufweisen. Gerade bei Patienten mit
niedriger Anfallsfrequenz ist es jedoch wichtig, jeden Anfall zu erfassen. Auch im Tiermodell
spielt dies eine bedeutende Rolle, um die vollständige Epileptogenese beurteilen zu können.
Das von Dr. Hopfengärtner entwickelte Programm, welches am Menschen bereits evaluiert
wurde [67] und in der Universitätsklinik Erlangen eingesetzt wird, wurde in dieser Arbeit
auch im Tiermodell geprüft.
1.5 Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zum Thema des neokortikalen
Epilepsiemodells und der lokalen Epilepsietherapie
Auf der Grundlage der Veröffentlichungen von Nilsen et al. (2005, 2006) [105, 106] über ein
TeT Modell der refraktären fokalen neokortikalen Epilepsie der Ratte nach neokortikaler
Injektion von 25-50 ng TeT wurden von unserer Arbeitsgruppe folgende Versuche zur
Reproduktion des Modells durchgeführt. Es wurden dieselbe Rattenspezies, dieselben ECoG
und EMG Elektroden-Positionen, das TeT derselben Lieferfirma und dieselbe Auswertesoftware (Spike 2) ect. verwendet.
Die ersten Versuche an 28 Tieren mit Ableitungen zwischen eineinhalb und sechs Stunden
zeigten die in der folgenden Tabelle 1-2 aufgeführten Ergebnisse (persönliche Mitteilung von
MP Rassner 2012):
Tabelle 1-2: Ergebnisse der ersten Versuche des neokortikalen TeT-Epilepsiemodells
Anzahl der
Ratten
Toxin Dosis
5
1
1 x 50 ng TeT
2 x 50 ng TeT
Ein einziger Anfall an Tag 46 nach
Operation (OP) (1 x 50 ng TeT),
keine weitere epileptische Aktivität
8
3 x 50 ng TeT
1. Einzelne rezidivierende Anfälle
an Tag 2 post OP und Epilepsietypische Potentiale (ETPs)
2. Viele ETPs, teilweise mit
Myokloni
3. Wenige ETPs, eins gefolgt von
einem Myoklonus
4. Ein subklinischer Anfall an Tag
43; sehr wenige ETPs
5. Keine epileptische Aktivität
3
6
3 x 50 ng TeT+ 20 mg CoCl2
ETPs
3
8
3 x 50 ng TeT+ 10 mg CoCl2
ETPs
Ergebnisse
Vorzeitiger
Tod
Einleitung
11
Zusammenfassend kann man sagen, dass die ersten Vorversuche keine stabile epileptische
Anfallsfrequenz ergaben. Die Tiere, die nur 50 ng TeT unterschiedlich oft bis hin zu einer
Trippelinjektion mit je 50 ng erhielten, zeigten nur vereinzelt epileptische Anfälle und
epilepsietypische Potentiale (ETPs). Unter ETPs versteht man einzelne oder multiple Spikes
gefolgt von einer langsamen Welle, die sich eindeutig von der Hintergrundaktivität abheben
und sich dazu in Amplitude und Frequenz unterscheiden. Die Kombination zweier
epileptogener Substanzen, und zwar einer Trippelinjektion TeT und zusätzlich CoCl2,
erzeugte hingegen ein stabiles, regelmäßiges Auftreten von ETPs. Es ist bekannt, dass
interiktale Spikes, einschließlich ETPs, vor dem ersten epileptischen Anfall in Tiermodellen
auftreten und somit eine Vorstufe der Anfälle darstellen. Durch Induktion langfristiger
Veränderungen synaptischer Verbindungen zwischen Neuronen können durch die Entstehung
neuronaler Schaltkreise spontane Anfälle ausgelöst werden [119, 128]. Somit wurde der
Ansatz der Kombination von TeT und CoCl2 weiterverfolgt.
Anlässlich der o.a. Ergebnisse folgte die in Altenmüller et al. (2013) [4] präsentierte
Therapiestudie an dem kombinierten TeT/CoCl2-Modell. Hierbei wurden insgesamt zehn
Versuchstiere untersucht, welche eine Trippelinjektion von 75 ng TeT + 15 mg CoCl2 zur
epileptogenen Induktion in den Neokortex erhielten, sowie zwei zusätzliche Elektroden zur
Anfallsdetektion implantiert bekamen. Fünf Tiere erhielten eine lokale Therapie durch VPA
gefüllte Polycaprolacton (PCaL)-Implantate, während die anderen fünf Kontrolltiere
Natriumchlorid (NaCl) gefüllte-Implantate bekamen. Sechs von acht Tieren zeigten
rezidivierende Anfälle. Von zwei Tieren der NaCl-Gruppe gab es keine Video-ECoGAufzeichnungen, da sie am ersten postoperativen Tag verstarben. Die drei weiteren Tiere der
NaCl-Gruppe überlebten die erste postoperative Woche nicht. Diese randomisierte
Therapiestudie zeigte, dass lokal direkt auf einen epileptischen Fokus verabreichtes VPA das
Überleben von Ratten nach neokortikaler Behandlung mit TeT/CoCl2 signifikant steigerte.
Das Versterben aller Kontrolltiere innerhalb der ersten Woche ist jedoch ein schlechtes
Abbild einer neokortikalen fokalen Epilepsien beim Menschen, da diese zwar je nach Sitz des
Fokus zu aphasischen, motorischen, sensiblen, sensomotorischen oder sensorischen
Symptomen führen [58], jedoch nur äußerst selten bei sekundärer Generalisation eines Anfalls
einen plötzlichen oder unfallbedingten Tode nach sich ziehen [14]. Hieraus ergab sich die
Aufgabenstellung meiner nachfolgend beschriebenen Dissertation.
Einleitung
12
1.6 Ziele der Arbeit
Ziel
dieser
Dissertation
war
die
Weiterentwicklung
des
fokalen
neokortikalen
Epilepsiemodells an Ratten mit epileptogener Induktion durch die Kombination TeT/CoCl2
sowie im Vergleich zu alleiniger TeT-Applikation mit Nachinjektionen im Sinne eines
chemischen Kindlings. Das Bestreben war ein Tiermodell mit spontan rezidivierenden
fokalen neokortikalen Anfällen zu erzeugen, die unbehandelt nicht zum Tode führen und so
lange wie möglich mit nicht zu niedriger Frequenz bei geringer Beeinträchtigung des
Allgemeinzustandes andauern. Das Modell sollte in jeder Modalität möglichst der Erkrankung
von fokalen, neokortikalen Epilepsien beim Menschen gleichen. Die Aufgabe war die
geeignete Toxindosis zu finden, durch die eine ausreichend hohe und lang anhaltende
Anfallsfrequenz ausgelöst wird ohne die Tiere durch die Toxine oder überschießende
epileptische Aktivität zu töten. Die Intention war ein spontanes Vorkommen von fokalen
Anfällen über mindestens einen Monat zu erreichen. Der Einfluss des Operationstraumas auf
die Epileptogenese sollte anhand von Kontrolltieren evaluiert werden. Darüber hinaus galt es,
die Epileptogenese und Formveränderung der Anfälle des Modells elektrophysiologisch
sowie auch klinisch zu beurteilen. Aufgrund dessen war die Optimierung der
Ableitebedingungen und Qualität der ECoG-Daten ein weiterer Zielpunkt.
Das Tiermodell wird für die Testung neuer Therapieoptionen, wie z.B. der lokalen
medikamentösen Therapie, benötigt. Es war geplant, dass bei konstanten Ergebnissen des
Modells weitere Untersuchung zur fokalen Therapie mit VPA und anderen AED im Vergleich
zur systemischen Gabe durchgeführt werden.
Ein weiterer Punkt war die Untersuchung der histologischen Veränderungen des primären
Fokus und sekundär einbezogener Hirnareale in Abhängigkeit von pro-epileptischen Faktoren
an.
Zusätzlich galt es das automatische Anfallsdetektionsprogramm von Dr. Hopfengärtner
des Epilepsiezentrums der Universitätsklinik Erlangen bei intrakortikalen ECoG-Ableitungen
im Tiermodell bei Ratten zu evaluieren und die Sensitivität bezüglich der Anfallsdetektion zu
beurteilen, um die Datenauswertung zu erleichtern und zu beschleunigen. In der
Universitätsklinik Erlangen wird das Programm bereits zur Auswertung von Patientendaten
benutzt.
Ein wichtiger klinischer Bezug wurde durch Organisation der Ausführung und
Auswertung der EEG-Daten der intraoperativen Pilotstudie der „Lokalen subduralen VPAApplikation bei pharmakoresistenten fokalen neokortikalen Epilepsien“ hergestellt. Ziel
dieser Studie war die Implementierung der lokalen Epilepsietherapie am Menschen, sodass
Einleitung
13
diese für den klinischen Nutzen bei therapierefraktären fokalen neokortikalen Epilepsien in
naher Zukunft angewendet werden kann. Die Pilotstudie basiert auf den tierexperimentellen
Erkenntnissen und soll als Grundlage für die zukünftige Therapie bei Patienten dienen.
Material und Methoden
14
2. Material und Methoden
2.1 Tierversuche
2.1.1 Versuchsaufbau
Um das Tiermodell der lokalen, neokortikalen Epilepsie weiter zu entwickeln, wurden vier
Versuchsgruppen mit unterschiedlicher, epileptogener Induktion gebildet.
Gruppe I
U
Hierzu zählten vier Tiere, Ratte Nr. 4-7, welche als epileptogene Mittel TeT und CoCl2
erhielten. Insgesamt wurde pro Tier eine Gesamtmenge von 187.8 ng TeT mittels drei
Einzelinjektionen von je 62.6 ng verabreicht, sowie ein 7.5 mg rundes CoCl2-Plättchen auf
dem Fokus implantiert.
Gruppe II
U
In dieser Versuchstiergruppe bekamen fünf Tiere, Ratte Nr. 8-12, als einziges epileptogenes
Agens TeT in unterschiedlicher Dosierung injiziert; im Verlauf wurde TeT bei Rückgang der
epileptischen Aktivität durch einen kleinen Schlauch nachgespritzt.
Injektionsschema siehe Tabelle 2-8
Außerdem wurden die Tiere A und B (siehe Gruppe IV) nach einem Monat in diese Gruppe
aufgenommen, nachdem sie ebenfalls TeT injiziert bekommen hatten.
Gruppe III
U
Zu dieser Gruppe gehört nur ein einzelnes Tier, dem als epileptogenes Agens ein Kobaltdraht
implantiert wurde.
Gruppe IV
U
Gruppe IV war eine Kontrollgruppe, zu der Ratte A und B einen Monat lang zählten. An
diesen Tieren wurde eine Schein-Operation (OP) durchgeführt. Der gesamte Ablauf der OP
war identisch zu den OPs der anderen Versuchstiere, bis darauf, dass kein epileptogenes
Agens verabreicht wurde.
Material und Methoden
15
2.1.2 Versuchstiere
Insgesamt wurden zur Weiterentwicklung des Epilepsiemodells zwölf männliche Sprague
Dawley Ratten (BioMed Zentrum (ZKF), Freiburg i.Br.) mit einem mittleren Gewicht von
475 g (344-592 g) am Tag der OP eingeschlossen. Die Tiere wurden in Standardtiereinrichtungen gehalten: eine Ratte pro Käfig, bei gleichmäßiger Temperatur von 21°C, mit
einem 12h-Tag-Nacht-Rhythmus mit künstlichem Licht von 6.00 bis 18.00 Uhr und freiem
Zugang zu Wasser und Futter.
Die Verwendung der Ratten beruht auf der Tierversuchsgenehmigung G-10/85
(Regierungspräsidium Freiburg).
2.1.3 Weiterentwicklung des Modells im Vergleich zu den Vorversuchen
1. Dosistitrierung der epileptogenen Substanzen
 Bei TeT wurde die mittlere Dosis zwischen 75 und 50 ng gewählt: 62.6 ng
 Die CoCl2 Dosis wurde weiter reduziert auf: 7.5 ng
2. Steigerung der Anzahl der intrakortikalen Elektroden
Zusätzlich zu den Elektroden der Vorversuche wurden zwei weitere hinzugefügt: Eine medial
der MCR1-Elektrode am Rande des Fokus im rechten Motorkortex, genannt MCR2 zur
Beurteilung der Ausbreitung der Anfälle, und eine weitere im linken Parietalkortex, die PCLElektrode, auf gleicher Höhe wie die PCR-Elektrode liegend.
Abb. 2-1: Elektrodenanordnung
MCR = rechter Motorkortex, MCL = linker Motorkortex, PCR = rechter
Parietalkortex, PCL = linker Parietalkortex, REF = Referenz
Material und Methoden
16
3. Wechsel des Video-EEG-System und der Auswertesoftware sowie Erweiterung der
Ableitungsdauer auf 24 h.
4. Bei Versuchsgruppe II zusätzliche Implantation eines Schlauches mit Mandrin direkt über
dem Fokus zur Nachinjektion von TeT im Sinne eines chemischen Kindlings.
2.1.4 Operation
Alle Materialien, die während der gesamten OP regelmäßig benötigt wurden, sind hier
aufgeführt, während speziell für einzelne Schritte benötigte Materialien bei den
entsprechenden Unterpunkten zu finden sind.
Tabelle 2-1: Allgemeine Materialien für die Operation
Materialien
Hersteller
Bohr- und Schleifmaschine Proxxon FBS 240/E
Proxxon Werkzeug GmbH, Niersbach, D
Buchsenleiste BLR1 25
Bürklin OHG, Oberhaching, D
Desinfektionsspray „Softasept N“
B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D
Durahaken FD376R
Aesculap AG, Tuttlingen, D
Einwegskalpell (Feather® Nr.11 und 15)
Feather Safety Razor Co.LTD, Oskar, J
Gewichte (Sc-Kanüle, Insulinspritze, Schraube)
Werkstatt des Neurozentrums,
Universitätsklinikum Freiburg, D
Hartmetallbohrer, Ø 0.5 mm
Bungard Elektronik GmbH, Windeck, D
Hydrogel-Polymere (Ø = 3 mm, Dicke = 1 mm)
Prof. Dr. rer. nat. Thorsten Steinberg, Abteilung
für Orale Biotechnologie, Universitätsklinikum
Freiburg, D
Injektionssystem „Micro4“
World Precision Instruments, Sarasota, USA
Kochsalzlösung (NaCl 0.9 %)
Fresenius Kabi Deutschland GmbH, Bad
Homburg, D
Monopolar-Kauter
Change-A-Tip, Aaron medical, USA
Polycaprolacton Implantate (Ø = 5 mm,
Dicke = 1 mm)
Freiburg Materials Research Center FMF,
Universitätsklinikum Freiburg, D
Pinzette, anatomisch, BD027R, 145 mm 5 3/4
Aesculap AG, Tuttlingen, D
Pinzette, Mikropinzette FM035R mit
Ringtip 1.2 mm
Aesculap AG, Tuttlingen, D
Pinzette, Mikropinzette FM033R mit Tip
0.3 mm
Aesculap AG, Tuttlingen, D
Schere „BC424R“
Aesculap, Tuttlingen, D
Schrauben DIN 912 M 1.4 x 3
Der Schraubenladen, Villingen-Schwenningen,
D
Schraubendreher „PicoFinish 263p“
Wiha Werkzeuge GmbH, Schonach, D
Material und Methoden
17
Schleifstift fein EK ZYP0306, Ø 3 mm
Hoffmann Group, München, D
Sekundenkleber, Loctite 401
Loctite GmbH, München, D
Sprague-Dawley-Ratten (männlich)
BioMed Zentrum (ZKF), Universität Freiburg
im Breisgau, D
Spritze 10 mL „Injekt“
B Braun, Melsungen, D
Spritze 1 mL „Injekt-H“
B Braun, Melsungen, D
Stiftleiste SLR1 25
Bürklin OHG, Oberhaching, D
Steriles Wasser
Diaco Biomedicali S.p.A., Triest, I
Wasserstoffperoxid 30 %
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D
Wattestäbchen
Bel Premium, Paul Hartmann AG, Heidenheim,
D
Zahnzement, Paladur
Heraeus Holding GmbH, Hanau, D
2.1.4.1 Operationsvorbereitungen
Vor OP-Beginn wurden folgende Vorbereitungen getroffen:
Herstellung des CoCl2-Plättchens
U
Tabelle 2-2: Materialien für CoCl2-Plättchens
Materialien
Hersteller
Cobalt(II)-chlorid (CoCl2) Hexahydrat
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, D
Präzisionswaage R 160 P-D1
Sartorius GmbH, Göttingen, D
Eppendorfgefäß 3810X
Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH,
Wesseling-Berzdorf, D
Eine Woche vor OP wurde 7.5 mg CoCl2 mit der Präzisionswage portioniert und mit 250 µL
destilliertem Wasser in einem Eppendorfgefäß gelöst. Durch Verdunstung des Wassers in der
folgenden Woche entstanden runde Plättchen des CoCl2 (Abb.2-2), welche später der
Gehirnoberfläche aufgelegt wurden.
7.5 mg
Abb. 2-2: CoCl2-Plättchen Herstellung
Material und Methoden
18
Elektroden-Anfertigung
Tabelle 2-3: Materialien für Elektroden
Materialien
Hersteller
Abisolierer 0.25 mm/30 AWG
Weidinger, Eichenau, D
Silberdraht, Teflon-isoliert (Ø 0.38 mm)
World Precision Instruments, Sarasota, USA
Schrauben DIN 912 M 1.4 x 3
Der Schraubenladen, Villingen-Schwenningen,
D
Skalpell (Feather® Nr. 15)
Feather Safety Razor Co. LTD, Oskar, J
Stiftleiste SLR1 25
Bürklin OHG, Oberhaching, D
Die Elektroden, wie in Abb. 2-3 dargestellt, wurden aus Teflon-isoliertem Silberdraht
(Ø 0.38 mm) hergestellt: Sechs Drahtstücke mit einer Länge von 15 mm wurden für die
Tiefenelektroden und die Referenz abgemessen, sowie ein weiteres mit einer Länge von
25 mm für die Muskelelektrode und mit einem Skalpell zurechtgeschnitten. An einem der
Drahtenden wurde ein Pin (von einer Stiftleiste) aufgesteckt, während am anderen Ende die
Spitze abisoliert wurde.
Für die Groundelektrode wurde eine 15 mm lange Elektrode an eine kleine Schraube
(M 1.4 x 3) aus rostfreiem Stahl gelötet.
a
)
b
)
c
)
Abb. 2-3: Elektroden
a) Tiefenelektrode und Referenz
b) Muskelelektrode
c) Ground-Elektrode
Herstellung der 12-Pin-Steckerleiste
Tabelle 2-4: Materialien für 12-Pin-Steckerleiste
Materialien
Hersteller
Ohmmeter Fluke 179
Fluke Deutschland GmbH, Glottertal, D
Plastikschrauben DIN 84 PA 6.6 Natur M 3 x 30
Schrauben-Jäger, Karlsruhe, D
Stiftleiste SLR1 25
Bürklin OHG, Oberhaching, D
Für eine 12-Pin-Steckerleiste (Abb. 2-4) wurden zwei Stiftleisten auf die entsprechende Länge
von 12-Pin zugeschnitten, mit ihren Kontakten aneinander gelötet und anschließend jeder
Kontakt mit einem Ohmmeter überprüft, um mögliche Querverbindungen auszuschließen. Die
Material und Methoden
19
Leiste welche später zum Tier zeigte wurde mit zwei Plastikschrauben (M 3 x 30) versehen,
um eine Befestigung des Ableitegeräts zu gewährleisten.
Die Steckerleiste wurde mit einer Länge von zwölf Steckplätzen hergestellt, obwohl nur
acht davon benötigt wurden, um eine bessere Stabilität bei der Konnektion mit dem
Ableitegerät zu gewährleisten.
Abb. 2-4: Steckerleiste
TeT-Zubereitung
Tabelle 2-5: Materialien für Tetanus Toxin
Materialien
Hersteller
Rinderalbumin (bovine serum albumin),
gefriergetrocknet, Pulver ≥96 %
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Tetanus Toxin
Quadratech Diagnostics Ltd, Epsom, UK
Wasseraufbereitungsanlage, Milli-Q Integral 3
Millipore, Schwalbach, D
Üblicherweise am Tag der OP, bis max. sieben Tage vor der OP, wurde das TeT in 2 %
Rinderalbumin (BSA)-Lösung in hochreinem Wasser der Millipore-Anlage gelöst. 25 µg TeT
wurden in 250 µL 2 % BSA-Lösung gelöst, so dass eine Arbeitskonzentration von 100 ng/µL
resultierte.
2.1.4.2 Narkoseeinleitung und Lagerung
Tabelle 2-6: Materialien für Operationseinleitung und Narkose
Materialien
Hersteller
Bepanthen Augen- und Nasensalbe
Bayer, Leverkusen, D
Isofluran, Forene®
Abbott GmbH & Co. KG, Wiesbaden, D
Langhaarschneider „Surgical Clipper 4413“
Cardinal Health, Dublin, USA
Leukosilk, Breite 2.5 cm
BSN medical GmbH, Hamburg, D
Stereotaktisches Instrument für Kleintiere
Modell
David Kopf Instruments, Tujunga, USA
Waage Ultraship-35, bis 16 kg
My Weigh, Erkelenz, D
Material und Methoden
20
Alle OP-Vorgänge wurden unter aseptischen Bedingungen in einem OP-Saal für Kleintiere
durchgeführt.
Unmittelbar vor der OP wurde das Gewicht jeder Ratte auf der Ultraship-35-Waage
bestimmt. Anschließend wurde die Narkose mit 1 mL Isofluran in einem geschlossenen
Behälter eingeleitet. Etwa 1-3 min später war die Ratte narkotisiert, konnte aus dem Behälter
entnommen, auf fünf Schichten Papierhandtüchern gebettet und in dem stereotaktischen
Rahmen für Kleintiere eingespannt werden. Hierzu wurden die Fixationsstifte jeweils in den
äußeren Gehörgang eingeführt und der Kopf so gelagert, dass die Schnauze mit den oberen
Schneidezähnen mittig auf dem Beißring zu liegen kam. Während des Einspannens wurden
die Tiere mit max. 5 Vol % Isofluran über eine Beatmungsmakse narkotisiert und während
der gesamten OP mit 1.5-2.5 % Isofluran und 3 L/min Sauerstoff in Narkose gehalten. Die
Narkosetiefe wurde anhand der Atmung, der Muskelspannung der Gliedmaßen sowie deren
Farbe evaluiert.
Vor Befestigung der Beatmungsmaske und eines Absaugschlauches mit Leukosilk am
stereotaktischen Rahmen, wurde die Zunge mit einer anatomischen Pinzette aus dem Mund
herausgezogen, um die Respiration zu gewährleisten und die Aspiration zu verhindern. Das
Tier wurde während der gesamten OP mit einer Wärmelampe vor Unterkühlung und speziell
die Augen durch Bepanthen-Salbe vor Austrocknung geschützt. Vor OP-Beginn wurde die
Kalotte vom Nacken bis zu den Augen mit einem Langhaarschneider rasiert.
2.1.4.3 Operationsvorgänge
Nach Rasur der Kalotte erfolgten als erstes ein ca. 1.5 cm langer Hautschnitt, eine lokale
Desinfektion und die Präparation des Schädels mit Darstellung der Sutura lambdoidea,
sagittalis und coronalis. Das Wegziehen und die Fixierung der Hautlappen erfolgten mittels
Gewichten. Unter Nutzung seines antiseptischen und blutstillenden Effektes wurde
Wasserstoffperoxid zur Präparation des OP-Feldes aufgetragen. Zusätzlich erfolgte die
Blutstillung mittels eines batteriebetriebenen Monopolar-Kauter.
Vor Beginn der stereotaktischen Ausmessung der Platzierung der Elektrodenlöcher und
der TeT-Injektionen wurden die Koordinaten des Bregmas bestimmt, notiert und anhand
dieser dann alle weiteren errechnet. Alle im Folgenden angegeben Koordinaten beziehen sich
somit auf das Bregma und wurden mit Hilfe eines stereotaktischen Atlas des Rattenhirn
bestimmt [114].
Während der OP wurde jeder Ratte zum Ausgleich des Blut- und Flüssigkeitsverlustes 2 x
2.5 mL 0.9 % NaCl subkutan (s.c.) injiziert.
Material und Methoden
21
Elektrodenplatzierung
Für die Ableitungen mittels ECoG und Elektromyographie (EMG) wurden jeweils acht
Elektroden implantiert (Abb. 2-1): Fünf kortikale Tiefenelektroden: MCR1 (1.1 mm anterior,
-2.5 mm lateral) welche sich direkt im Fokus im rechten Motorkortex befand; MCR2 (1.1 mm
anterior, -1.5 mm lateral) medial am Rande des Fokus, um die Fortleitung der Anfälle
beurteilen zu können; eine weitere Elektrode außerhalb des Fokus in der kontralateralen
Hemisphäre, die MCL (1.1 mm anterior, 2.5 mm lateral) im linken Motorkortex; sowie zwei
Elektroden im Parietalkortex: rechts die PCR (-3.0 mm posterior, -2.5 mm lateral), sowie
links PCL (-3.0 mm posterior, 2.5 mm lateral). Eine Muskelelektrode, die TML, mit einer
Länge von 25 mm, wurde nach Inzision des linken Temporalmuskels mit einem 11er Skalpell
in diesen gesteckt. Die Muskelelektrode half einerseits, die motorische Aktivität bei Anfällen
aufzuzeigen und andererseits, Muskelartefakte zu erkennen und diese somit von epileptischen
Anfällen abzugrenzen. Die Referenzelektrode wurde im Kleinhirn rechtshemisphärisch
implantiert (-11.5 mm posterior, -2.5 mm lateral). Die speziell konstruierte Massenelektrode
wurde in ein kleines, oberflächliches Bohrloch (Ø 0.8 mm) links der Sutura sagittalis und
dorsal der Sutura lamboidea in die Kalotte gedreht und befand sich damit im Schädelknochen
epidural.
Alle Löcher für die Elektroden wurden zu Beginn gebohrt, diese selbst jedoch erst nach
Induktion des epileptischen Fokus eingesetzt und konnektiert.
Präparation des neokortikalen Fokus
Zur Herstellung des epileptischen Fokus wurde über dem rechten primären Motorkortex
anterior zum Bregma vorsichtig ein Loch mit einem Durchmesser von 3 mm mit 1 mm
Randsaum zur Mittellinie, angrenzend an die Koronarnaht, gefräst (siehe Abb. 2-5). Während
des Fräsvorgangs wurde durchgehend mit isotoner Kochsalzlösung gekühlt. Es wurde darauf
geachtet, dass die Kortexoberfläche nicht verletzt wurde. Die Meningen wurden anschließend
mit einem Durahaken entfernt und das Kortexgewebe durch Befeuchten mit 0.9%iger
Kochsalzlösung vor dem Austrocknen geschützt.
Material und Methoden
22
Abb. 2-5: OP-Feld mit neokortikalem Fokus
Zu sehen sind im OP-Feld markiert das Bregma, von dem aus die
Elektrodenpositionen bemessen wurden, die gebohrten Elektrodenlöcher,
sowie der präparierte Fokus, der hier bereits mit einem Hydrogelpolymer bedeckt ist.
Tetanus Toxin-Injektion
Tabelle 2-7: Materialien für Tetanus Toxin-Injektion
Materialien
Hersteller
Hamiltonspritze 2 µL
Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D
Micro4-System
World Precision Instruments, Berlin, D
Schlauch (Innen Ø 0.4 mm, Länge 8.0 mm)
Reichelt Chemietechnik GmbH & Co.,
Heidelberg, D
Steriles Wasser
Diaco Biomedicali S.p.A., Triest, I
Für die Injektion des TeT wurde die 2 µL Hamiltonspritze mit Öl gefüllt und im Micro4System eingespannt. Die Spritze wurde über einen Schlauch mit einer Injektionskanüle
verbunden. Der Schlauch samt Injektionskanüle wurden zuvor mit sterilem Wasser (Aqua
dest.) gespült und bei austretendem Wasser auf die Hamiltonspritze gesteckt. Die
Hamiltonspritze wurde nun bis auf 0.2 µL, durch das Micro4-System gesteuert, entleert.
Anschließend wurde 0.5 µL Luft aufgezogen, die im Folgenden als Diffusionsbarriere
zwischen TeT und Aqua dest. dienten. Schließlich wurden mehr als 62.6 ng TeT, d.h. 626 nL
der TeT-Lösung, aufgezogen, die Nadel in den stereotaktischen Rahmen eingespannt und
über dem präparierten Fokus an der Injektionsstelle positioniert. Hier wurde überprüft, ob bei
Stempelvorschub in der Hamiltonspritze ein Tropfen kommt, dieser mit einem Wattestäbchen
Material und Methoden
23
abgetragen und dann das Injektionssystem wieder genullt. Anschließend wurde die Kanüle
senkrecht 1 mm in den rechten Motorkortex abgesenkt, 62.6 ng TeT über 10 min injiziert und
die Kanüle weitere 5 min belassen (Abb. 2-6), damit sich das TeT im Gewebe verteilen
konnte und der Rückfluss in die Kanüle minimiert wurde. Der gesamte Vorgang wurde bis zu
dreimal je nach Versuchstier wiederholt.
Abb. 2-6: TeT-Injektion
Intraoperatives Fotografie während der TeT-Injektion mit platzierter
Injektionskanüle (schwarzer Pfeil).
Die Ratten der Gruppe I bekamen eine Gesamtmenge von 187.8 ng TeT mittels drei
Einzelinjektionen von je 62.6 ng in den Fokus stereotaktisch 1 mm unter die Kortexoberfläche
injiziert. Danach wurde ein 7.5 mg wiegendes rundes CoCl2-Plättchen mit der konvexen Seite
auf den Fokus gelegt. Dieses CoCl2-Plättchen wurde durch das anschließend aufgebrachte
PCaL-Implantat, welches für die hier beschriebene Versuchsserie mit NaCl gefüllten war,
leicht auf den Motorkortex gedrückt, sodass das CoCl2 lokal auf den Fokus einwirkte. Das
PCaL-Polymer füllte schließlich das gefräste Loch über den Fokus wieder auf und wurde mit
Sekundenkleber fixiert.
Die Ratten der Gruppe II bekamen als einziges epileptogenes Agens TeT in
unterschiedlicher Menge, siehe Tabelle 2-8, injiziert ohne zusätzliche Aufbringung eines
CoCl2-Plättchens. Außerdem bekamen sie einen kleinen Schlauch (Innen-Ø 0.4 mm, Länge
8.0 mm) mit einem Metall-Mandrin über dem Fokus implantiert, der durch das PCaLPlättchen oder alternativ das Hydrogel-Polymer hindurch ragte, um bei Ausbleiben oder
Rückgang der Anfälle TeT nach zu injizieren. Abb. 2-7 zeigt einen solchen implantierten
Schlauch mit Mandrin intraoperativ. Somit bestand die Möglichkeit der Nachinjektion des
Material und Methoden
24
TeT, allerdings nur an einer Stelle des Fokus und nicht an mehreren. Der Mandrin verhinderte
das Eindringen von Flüssigkeiten, wie Blut, Liquor oder flüssigem Zahnzement und die damit
verbundene Gefahr der Verstopfung des Schlauches, um diesen für die Injektionskanüle
freizuhalten. Der Schlauch samt Mandrin wurde ebenfalls mit Paladur-Zahnzement
verschlossen um das Eindringen von Krankheitserregern zu verhindern.
Tabelle 2-8: TeT-Injektionsschema
Nummer der
Ratte
1. TeT Menge
2. TeT Menge bei
Nachinjektion
Tag post-OP der
Nachinjektion
8
3 x 62.6 ng
2 x 62.6 ng
6
9
3 x 62.6 ng
2 x 3 x 62.6 ng
3 und 6
10
3 x 62.6 ng
-
-
11
2 x 62.6 ng
-
-
12
1 x 62.6 ng
1 x 62.6 ng
5
A
-
2 x 62.6 ng
28
B
-
2 x 62.6 ng
28
Abb. 2-7: Implantierter Schlauch mit Mandrin
Das intraoperatives Foto zeigt einen implantierten Schlauch (schwarzer
Pfeil) mit Mandrin, welcher durch ein Hydrogelpolymer hindurch ragt
und platzierte Elektroden, sowie Halteschrauben.
Nachinjektion von Tetanus Toxin
Bei Rückgang der epileptischen Aktivität wurde durch den implantierten Schlauch erneut TeT
in unterschiedlicher Menge, wie in Tabelle 2-8 aufgeführt, in den Fokus injiziert. Hierzu
Material und Methoden
25
wurde die Ratte in Narkose gelegt, der Metall-Mandrin von Zahnzement frei gefräst (Abb. 2-8
links), mit einer Pinzette entfernt und schließlich TeT mit Hilfe der Hamiltonspritze injiziert.
Die Spritze war, wie oben beschrieben, über einen Schlauch mit einer Injektionskanüle
verbunden, welche 1 mm durch den Schlauch hindurch in den Neokortex ragte. Die Kanüle
besaß einen Anschlag, damit die Injektionen immer gleich tief saßen und somit die
Reproduzierbarkeit gegeben war (Abb. 2-8 rechts). Anschließend wurde die Kanüle entfernt,
ein neuer Mandrin eingeführt und alles wieder mit Zahnzement verschlossen.
Abb. 2-8: TeT-Nachinjektion
Links ein von Zahnzement frei gefräster Metall-Mandrin (schwarzer
Pfeil) der für die Nachinjektion herausgezogen wurde.
Rechts oben und unten Fotos mit der platzierten Injektionskanüle
während der TeT-Nachinjektion bei implantierten, einzementierten
Elektroden.
Kobaltdraht
Tabelle 2-9: Materialien für Kobaltdraht-Behandlung
Materialien
Hersteller
Kobaltdraht (Ø = 1 mm)
Alfa Aesar GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D
Schlauch (Innen-Ø 1 mm, Außen-Ø 3 mm)
Reichelt Chemietechnik GmbH & Co.,
Heidelberg, D
Der Ratte von Gruppe III wurde in das gefräste 3 mm große Loch überhaupt kein TeT
injiziert, sondern durch einen etwas größeren Schlauch (Innen-Ø 1 mm, Außen-Ø 3 mm) ein
Kobaltdraht (Ø 1 mm, Länge 12 mm) vorgeschoben, so dass dieser ca. 1 mm in den
Neokortex ragte. Die OP wurde auf dem Boden der Veröffentlichung von Chang et al. (2004)
[19] durchgeführt, allerdings wurde nicht ein Stück des Kobaltdrahtes frei implantiert,
Material und Methoden
26
sondern ein längeres Stück um 1 mm vorgeschoben. Der Schlauch diente dazu, den Draht
jederzeit entfernen oder wechseln zu können.
Scheinoperation
Zwei weitere Ratten, Nr. A und B, dienten als Kontrolltiere zur Evaluation, welchen Einfluss
das OP-Trauma auf die Epileptogenese hat. Sie bekamen weder TeT injiziert, noch ein CoCl2Plättchen oder einen Kobaltdraht implantiert. Alle anderen Prozeduren wurden exakt gleich
durchgeführt. Bei ihnen wurden ebenfalls acht Elektroden implantiert, der 3 mm große Fokus
wurde gefräst, mit einem Hydrogel-Polymer verschlossen und ein Schlauch mit Mandrin
platziert.
Nach einer vierwöchigen Kontrollphase wurde diesen beiden Tieren ebenfalls eine
Doppelinjektion TeT nachinjiziert, um sie der Entwicklung des TeT-Modells zuzufügen; sie
wanderten somit in Gruppe II.
Fixationsschrauben
Es folgte die Bohrung zweier Löcher (Ø des Bohrers 0.8 mm) für die Fixationsschrauben
(M 1.4 x 3), welche dazu dienten, dem Zahnzement später Halt zu verschaffen. Die erste
Bohrung erfolgte links anterior der MCL-Elektrode, die zweite rechts posterior der PCRElektrode (siehe Schema Elektrodenanordnung Abb.2-1). Die Schrauben wurden so
oberflächlich wie möglich, jedoch so fest wie nötig, eingedreht.
Elektrodenfixierung und -konnektion
Schließlich wurden alle Elektroden eingesetzt. Die Tiefenelektroden wurden nach
Pinzettennormierung ¾, d.h. die deisolierten Spitzen wurde mit einer Länge, die ¾ der Breite
der anatomischen Pinzette besaß, abgeknickt, mit der Spitze in das jeweilige Loch eingebracht
und mit Sekundenkleber fixiert. Alle Elektroden wurden anschließend mit der 12-PinSteckerleiste verbunden. Von vorne nach hinten wurde jedes Mal dieselbe Reihenfolge
eingehalten:
MCR1 – MCR2 – MCL – PCR – PCL – TML – Referenzelektorde - Massenelektrode
Damit die dauerhafte Fixierung der Elektroden samt Steckerleiste gewährleistet war, wurden
diese so nah wie möglich an der Kalotte mit Zahnzement bedeckt und somit befestigt.
2.1.4.4 Analgesie und Narkoseausleitung
Tabelle 2-10: Analgetikum
Substanz
Hersteller
Buprenorphin - Temgesic®
Essex Pharma, München, D
Material und Methoden
27
Direkt nach der OP bekamen die Ratten 0.05 mg/kg Körpergewicht (KG) Buprenorphin s.c.
zur Analgesie verabreicht.
Die Narkose wurde ausgeleitet, die Ratte aus dem stereotaktischen Rahmen
herausgenommen und bis zur Ableitung in einen Käfig gelegt. Alle Instrumente wurden für
die nächste OP zunächst mit heißem Wasser gespült und anschließend desinfiziert, sowie
einige davon autoklaviert.
2.1.5 Therapieversuch – Fallbericht Ratte Nr. 11
Tabelle 2-11: Substanzen für den Therapieversuch
Substanz
Hersteller
Diazepam 10 mg/2 mL Injektionslösung
Ratiopharm GmbH, Ulm, D
Valproat - Orfiril® 100 mg/mL Injektionslösung
Desitin GmbH, Hamburg, D
Bei Tier 11 wurde aufgrund des schlechten Allgemeinzustandes durch die überschießende
epileptische Aktivität zehn Tage nach Induktion des Fokus ein Therapieversuch durchgeführt.
Es bekam bei einem Gewicht von ca. 400 g als erstes VPA intraperitoneal (i.p.) in einer Dosis
von 200 mg/kg KG auf der Grundlage von Löscher et al. (1993) [87] verabreicht. Drei
Stunden später folgte eine Injektion von 30 mg/kg KG DZP i.p. auf der Grundlage von
Walker et al. (1998) [137]. 1.5 Tage später bekam die Ratte erneut DZP injiziert, diesmal nur
eine Dosis von 15 mg/kg KG, um das Tier nicht wie nach Verabreichung der ersten DZPInjektion als Nebeneffekt zu narkotisieren. Der letzte Therapieversuch wurde am selben Tag
mit lokaler Verabreichung von VPA unternommen. Mit Hilfe des direkt über dem Fokus
implantierten Schlauches wurden lokal im OP nach Freifräsen des Schlauches, Entfernung des
Mandrins und Platzierung der Kanüle 0.3 mL VPA (entspricht 30 mg) injiziert.
2.1.6 Video-Elektrokortikographie-Aufnahmen
Tabelle 2-12: Materialien für Video-ECoG-Aufnahmen
Materialien
Hersteller
Festplatte, “My Book Essential” 2 Terabyte
Western Digital Technologies, Kalifornien, USA
Video-EEG-System
IT-med GmbH, Usingen, D
Schleifringsystem T13EEG
Air Precision, Le Plessis-Robinson, F
Verstärker ISO-1064CE
Braintronics, Almere, NL
Videokamera HDR-HC5E
Sony Coporation, Tokyo, JP
Material und Methoden
28
Für die postoperativen ECoG- und EMG-Ableitungen, sowie die simultane Verhaltensbeobachtungen der Ratten, wurden die Tiere noch am OP-Tag einzeln in spezielle, runde,
durchsichtige Käfige gesetzt; ein Video wurde synchron zum ECoG aufgenommen.
Die Montage der fünf Tiefenelektroden, der Muskelelektrode, der Referenz- und der
Massenelektrode wurde an ein Schleifringsystem T13EEG und einen Verstärker ISO-1032CE
mit eingebauten 16 bit Analog-Digitalwandler angeschlossen. Die minimale Amplitudendifferenz, die mit dem Analog-Digitalwandler aufgelöst wird, beträgt 0.179 µV/bit bei einem
Messbereich des Verstärkers von insgesamt 11.73 mV. Das heißt, der Eingangsbereich für
positive und negative Spannungen beträgt ± 5.865 mV. Die Signale wurden mit einem
Hochpass- und einem Tiefpassfilter mit einer Bandbreite von 0.16 Hz bis 97 Hz gefiltert und
mit einer Abtastrate von 256 Hz unkomprimiert digitalisiert.
Das Verhalten der Ratten wurde simultan mit einer hochauflösenden Videokamera HDRHC5E aufgenommen, die zu den ECoG- und EMG- Ableitungen synchronisiert war.
Die Daten wurden in Stundenblöcken auf jeweils zwei Festplatten gespeichert und
anschließend visuell ausgewertet. Vom Tag der OP an wurden 24h-Ableitungen für einen
Zeitraum von einem Monat bei den Tieren 4-11 geplant und danach stichprobenartig an
einzelnen Tagen. Video-ECoG-Abschnitte nach Dekonnektion durch heftige Bewegungen der
Tiere und damit einhergehendem Verlust eindeutiger ECoG-Signalen und hoher Anfälligkeit
für Artefakten, wurden von der Auswertung ausgeschlossen.
Die Ratten wurden noch am OP-Tag an das Ableitegerät konnektiert und das simultane
Langzeit-Video-ECoG-Monitoring gestartet. Die Ratten 4-11 wurden kontinuierlich für
jeweils 24 h abgeleitet und aufgenommen, während Ratte 12 die ersten acht Tage ebenfalls
24 h lang abgeleitet wurde und sich danach mit Ratte 13 abwechselte. Ratte A, B und 13
wechselten sich ebenfalls gegenseitig ab. Bei kontinuierlicher 24h-Ableitung dekonnektierten
sich die Ratten teilweise durch Bewegungen selbst, weshalb Lücken in den ausgewerteten
Daten entstanden.
2.1.6.1 Datenanalyse
Tabelle 2-13: Software für ECoG-Datenanalyse
Software
Hersteller
Deltamed Coherence Software 5.1.0.0
IT-med GmbH, Usingen, D
(Heute: Natus GmbH, Planegg, D)
Die Video-ECoG-Dateien wurden durch Verwendung der Coherence Software analysiert. Es
erfolgte ein Screening der ECoG- und EMG-Daten auf epileptische Aktivität in der ReferenzMontage und mit Hilfe der Bipolaren-, der Common Average- sowie der Common Average
Material und Methoden
29
MCR(1/2)-Montage wurden Details, wie z.B. epileptische Anfälle oder Artefakte,
ausgewertet.
Das Verhalten der Ratten wurde parallel mit den ECoG- und EMG-Ableitungen durch
synchron aufgenommene Videodateien beurteilt. Die Analyse konzentrierte sich auf die
ECoG-Dateien und das Video wurde nur an Stellen epileptischer Aktivität sowie
stichprobenartig zum Vergleich gesichtet. Auffällige Bewegungen im Video ohne Korrelat im
ECoG wurden nicht als epileptische Aktivität gewertet um Artefakte auszuschließen.
Die Datenanalyse konzentrierte sich auf die qualitative und quantitative Beurteilung der
Anfallsaktivität und -semiologie, sowie der Epileptogenese.
Die Video-ECoG-Aufnahmen wurden von mir nach Einarbeitung und unter regelmäßiger
Supervision durch Dr. Altenmüller, einem erfahrenen Epileptologen der neurochirurgischen
Universitätsklinik Freiburg, ausgewertet.
Anfallsmuster bestanden definitionsgemäß aus repetitiven Spikes oder rhythmischer
Aktivität mit einer dynamischen Entwicklung in Frequenz und Topographie. Wenn diese im
Video synchron kein eindeutiges klinisches Korrelat aufwiesen, wurden sie als subklinische
Anfälle gewertet. Interiktale epileptische Aktivität war definiert als eindeutige ETPs,
charakterisiert durch einzelne oder multiple Spikes gefolgt von einer langsamen Welle,
welche sich eindeutig von der Hintergrundaktivität abhoben und sich dazu in Amplitude und
Frequenz unterschieden.
Nur eindeutige Anfälle wurden gewertet und große Anstrengungen unternommen,
Artefakte nicht als epileptische Aktivität misszudeuten, um diese so gut wie möglich
auszuschließen.
Alle klinischen und subklinischen Anfälle, sowie ETPs in Versuchsgruppe II wurden
gezählt. Zusätzlich wurde die Anfallsdauer ermittelt und die Semiologie zur Topographie des
iktalen ECoGs in Beziehung gesetzt. Bei allen Tieren ohne längere Dekonnektionszeiten
werden im Folgenden die Anfälle/Tag in einer Grafik dargestellt, während bei den restlichen
Ratten aufgrund fehlender oder artefaktreicher Daten die Anfälle/h angegeben werden.
Material und Methoden
30
2.1.7 Histologie
2.1.7.1 Pefusionsfixation
Vor Beginn der eigentlichen Perfusionsfixation wurden folgende Lösungen hierfür
hergestellt:
Phosphatgepufferte Salzlösung 0.4 M
Tabelle 2-14: Substanzen für Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
Substanz
Summenformel
Hersteller
NatriumdihydrogenphosphatMonohydrat
NaH2PO4 x H2O
Merck KGaA, Darmstadt, D
Di-Natriumhydrogenphosphat
Na2HPO4 x 2 H2O
Carl Roth GmbH & Co.KG,
Karlsruhe, D
Natriumchlorid
NaCl
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Tabelle 2-15: Zusammensetzung der Lösungen für die Herstellung von PB 0.4 M
Substanz
Menge
Menge H2O
Lösung 1
Na2HPO4 x 2 H2O
71.2 g
1000 mL
Lösung 2
NaH2PO4 x H2O
16.6 g
300 mL
Die Herstellung einer phosphatgepufferten Lösung (PB) 0.4 M erfolgte, indem Lösung 2 zu
Lösung 1 hinzugegeben wurde, bis sich ein pH von 7.2 eingestellt hatte. Zu 1000 mL 0.4 M
PB wurden anschließend 35 g NaCl hinzugefügt, um phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)
0.4 M zu erhalten.
4 % Paraformaldehyd-Lösung
Tabelle 2-16: Substanzen zur Herstellung von 4 % Paraformaldehyd
Substanz
Summenformel
Hersteller
Paraformaldehyd
(CH2O)n
Carl Roth GmbH & Co.KG,
Karlsruhe, D
Natriumhydroxid
NaOH
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
40 g Paraformaldehyd (PFA) wurden in 500 mL H2O gelöst, 3-4 Tropfen 5 M
Natriumhydroxid zugegeben und auf 60-70°C erhitzt, bis die Lösung klar wurde. Nach dem
Abkühlen wurde diese in einen Messzylinder filtriert, 250 mL 0.4 M PBS hinzugegeben und
auf 1000 mL mit destilliertem H2O aufgefüllt.
Material und Methoden
31
Perfusionsvorgang
Tabelle 2-17: Materialien für den Perfusionsvorgang
Materialien
Hersteller
Arterienklemme BH106R + BH111R
Aesculap, Tuttlingen, D
Dreiwegehahn, Discofix
B Braun, Melsungen, D
Faltenfilter
Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, D
Heidelberger Verlängerungen
B Braun, Melsungen, D
Hohlmeisselzange FO409R
Aesculap, Tuttlingen, D
Injektionskanüle
B Braun, Melsungen, D
Ketamin 10 % (als Hydrochlorid)
CP Pharma, Burgdorf, D
Plastikgefäße, Szintillationsvials, Super PE
Vials 20 mL
Perkin Elmer, Waltham, USA
Pinzette, anatomisch BD047R
Aesculap, Tuttlingen, D
Saugkanüle GF764R
Aesculap, Tuttlingen, D
Schere, chirurgisch, BC326R, gerade
Aesculap, Tuttlingen, D
Schere, chirurgisch, BC417R, gebogen
Aesculap, Tuttlingen, D
Schere, fein, gerade, spitz BC004R
Aesculap, Tuttlingen, D
Schlauchpumpe (Baujahr 2003)
neoLab, Heidelberg, D
Xylazin, Rompun® 2
Bayer Vital GmbH, Leverkusen, D
Die Versuchstiere wurden vor Perfusionsbeginn mit folgenden Substanzen tief betäubt:
1 mL/kg KG Ketamin und 0.1 mL/kg KG Xylazin
Zunächst wurde die Ratte rücklings auf einem Styroporblock an den oberen Extremitäten
befestigt. Es folgte die Eröffnung des Abdomens entlang der Rippen mit einer Schere mit
anschließender Abtrennung des Diaphragmas anterior am Rippenbogen. Danach erfolgte die
Eröffnung des Thorax entlang der Axillarlinien beidseits, gefolgt von der Eröffnung des
Perikards. Schließlich wurde der Apex cordis mit einer feinen Schere abgeschnitten und die
Perfusionskanüle unter laufendem PBS über den linken Ventrikel bis in die Aorta ascendens
eingeführt. Die Kanüle wurde mit einer Klemme fixiert. Der Fluss in die abdominelle Aorta
descendens wurde mit einer weiteren Klemme unterbunden, sodass möglichst große Mengen
Flüssigkeit im ZNS ankamen. Damit das Blut und die Perfusionslösungen abfließen konnten,
wurde das rechte Atrium mit einer feinen Schere eröffnet. Nachdem 500 mL PBS mit Hilfe
einer Pumpe infundiert und das Blut aus dem Gefäßsystem entfernt war, wurde das Gehirn
durch Gabe von 500 mL PFA fixiert. Anschließend erfolgte nach Dekapitation die Entnahme
des Gehirns.
Material und Methoden
32
Die Perfusion konnte bei Ratte Nr. 6, 7, 9, 10 und 11 durchgeführt werden. Bei den Tieren,
welche eines plötzlichen, teilweise anfallsbedingten Todes starben (Ratte Nr. 4, 5, 8, 13, A,
B) und somit nicht perfundiert werden konnten, wurde das Gehirn vorsichtig heraus präpariert
und in 4 % PFA-Lösung für mindestens eine Woche zur Fixierung aufbewahrt.
2.1.7.2 Vibratomschnitte
Tabelle: 2-18: Materialien zur Herstellung von Vibratomschnitten
Materialien
Hersteller
Agar, reinst, gepulvert
Merck KGaA, Darmstadt, D
Objektträger, 26 x 76 x 1 mm,
Gelatine-beschichtet (AG Haas)
Langenbrinck, Emmendingen, D
Objektträger, Super Frost, 25 x 75 x 1mm
Langenbrinck, Emmendingen, D
Vibratom Leica VT 1000S
Leica Biosystems GmbH, Nussloch, D
Um das nach ca. 1 Woche aus der PFA-Lösung entnommene Gehirn einzubetten, wurden
2.5 g Agar in 50 mL H2O gelöst, erhitzt und das Einbettmedium über das Gehirn gegossen. Es
erkaltete innerhalb von 15 min; der Block wurde zurechtgeschnitten und mit Sekundenkleber
auf der Grundplatte des Vibratoms befestigt. Im wassergefüllten Schneidebecken wurden
70 µm dicke koronare Schnitte hergestellt, welche mit einem feinen Pinsel auf einen
Objektträger aufgezogen, getrocknet und anschließend gefärbt wurden.
Zu Beginn wurden Gelatine-beschichtete Objektträger verwendet. Da die Schnitte
teilweise schlecht auf der Beschichtung hielten und somit beim Färben verloren gingen (alle
Schnitte der Ratte 10 und teilweise von Ratte 11), wurde auf Super-Frost-Objektträger
gewechselt. Mit diesen gab es keine Verluste histologischer Schnitte.
2.1.7.3 Nissl-Färbung
Tabelle 2-19: Materialien für Nissl-Färbung
Materialien
Hersteller
Cresyl-Violett 0.1 %
Sigma-Aldrich, Steinheim, D
Deckgläser 24 x 60 mm
Carl Roth GmbH & Co.KG, Karlsruhe, D
Essigsäure (Eisessis) 100 % wasserfrei
Merck KGaA, Darmstadt, D
Ethanol
SAV LP GmbH, Flintsbach, D
EZ-Mount
Thermo Scintific GmbH, Bremen, D
Xylol
Merck KGaA, Darmstadt, D
Material und Methoden
33
Die histologischen Schnitte wurden nach Nissl mit Kresylviolett gefärbt. Damit lassen sich
Perikaryen gut darstellen, da der basische Farbstoff an negativ geladenen Strukturen bindet
und somit alle DNA- und RNA-haltige Komponenten repräsentiert [92].
Im Einzelnen wurden die mit Schnitten bestückten Objektträger nach Spülung in
Essigwasser (1-2 Tropfen Eisessig auf 100 mL Aqua dest.) für 20 min in das Färbebecken
getaucht. Anschließend wurden sie erneut in Essigwasser geschwenkt. Um die Schnitte zu
entwässern, durchliefen sie danach eine aufsteigende Alkoholreihe mit einer Einwirkzeit von
je einer Minute: 70 % - 90 % - 100 % Ethanol. Folgend wurden sie für 2 x 5 min in Xylol
eingetaucht, bevor die Objektträger schließlich mit Hypermont eingedeckelt wurden.
2.1.7.4 Mikroskopische Beurteilung und Quantifizierung der Gehirnläsion
Tabelle 2-20: Geräte und Software für die lichtbildmikroskopischen Untersuchungen und
statistische Auswertung
Materialien
Hersteller
Gehirnatlas der Ratte – The rat brain in
stereotaxic coordinates, 6th ed.
Paxinos G, Watson C (2007), Elsevier 2007,
Amsterdam/Boston [114]
Mikroskop - Axioplan2
Software - AxioVision Rel 4.8
Carl Zeiss, Oberkochen, D
JMP Statistiksoftware
SAS Institute, Cary, USA
GraphPad Prism 4.02
GraphPad Software, Inc., CA, USA
Die histologischen Präparate wurden am Mikroskop beurteilt. Die Schnitte wurden bewertet
und die Läsionen mit der Software ausgemessen. Bei jedem Tier wurde ein Schnitt ca.
2.52 mm vor dem Bregma, sowie der Schnitt mit der größten messbaren Läsion
herausgesucht. Die Messung der Läsion erfolgte anhand einer Nekrosezone oder fehlendem
Gewebe, im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre. Es wurde nur tatsächlich fehlendes
Gewebe beurteilt und nicht durch schlechte Fixierung bedingt fehlendes Gewebe. Die
Messergebnisse von Gruppe I wurden statistisch mit Hilfe der JMP Software mit Gruppe II
bezüglich der Fragestellung verglichen, ob CoCl2 eine signifikant größere Läsion verursacht.
Hierzu wurde der Student’s t-Test nach Durchführung einer einfaktoriellen Varianzanalyse
angewandt, um signifikante Unterschiede zwischen den beiden Mittelwerten heraus zu finden.
Die Ergebnisse sind als Mittelwerte mit 95 % Konfidenzintervallen (CI95) mit GraphPad
Prism dargestellt.
Material und Methoden
34
2.2 Vergleich der visuellen mit der automatischen ElektrokortikogrammAuswertung
Zur Beschleunigung und Erleichterung zukünftiger ECoG-Auswertungen wurden einige der
bereits visuell ausgewerteten Dateien mit einem automatischen Anfallsdetektionsprogramm
[67] untersucht. Dieses im Epilepsiezentrum Erlangen von Dr. Hopfengärtner entwickelte
Programm arbeitet in erster Linie mit der Analyse der spektralen Leistungsdichte. Zusätzlich
ist das Programm darauf ausgelegt, eine Vielzahl von Artefakten zu erkennen und diese von
der Analyse auszuschließen. Die integrierte Power wurde für je fünf charakteristische
Frequenzbänder einer bipolaren Mehrkanal-Anfallsdetektionsmontage berechnet. Für den
Vergleich der Ratten-ECoG-Daten konnte ein Großteil der Anfälle mit den folgenden
Frequenzbändern erfasst werden: Band 1: 2-48 Hz, Band 2: 2-12Hz, Band 3: 12-15 Hz, Band
4: 25-48 Hz. Für alle Tiere verwendeten wir dieselben Parameter.
Es erfolgte keine komplett automatische Auswertung mit Berechnung der Anfallsfrequenz
durch ein Detektionsalgorithmus, wie z.B. in der Veröffentlichung von Hopfengärtner et al.
(2007) [67]. Die Auswertung der spektralen Frequenzbänder erfolgte visuell im 15 min-
Fenster, wobei bei Verdacht eines epileptischen Anfalls mit dem Button „Go2EEG“ das
passende ECoG aufgerufen wurde, um diesen zu bestätigen, bzw. zu widerlegen. Durch den
Wechsel in das ursprüngliche ECoG konnten Artefakte und normale physiologische Aktivität
erkannt und von der Zählung ausgeschlossen werden. Das Programm wurde somit insgesamt
nur halbautomatisiert verwendet, da die spektralen Frequenzbänder wieder visuell und nicht
von dem Programm ausgewertet wurden. Dadurch konnten alle falsch positiven Ergebnisse
ausgeschlossen werden.
Wie bei der visuellen Auswertung wurden auch hier quantitativ die Anfälle gezählt, ihre
Dauer gemessen und die Ergebnisse mit denen der visuellen verglichen.
2.2.1. Bewertung der automatischen Elektrokortikogramm-Auswertung
Die mit Hilfe des halbautomatischen Anfallsdetektionsprogrammes ausgewerteten Daten
wurden hinsichtlich der Sensitivität bewertet. Diese ist definiert als der Quotient aus der
Anzahl detektierter Anfälle in den spektralen Frequenzbändern und der Anzahl visuell
erhobener Anfälle im ECoG und wird in Prozent angegeben. Eine hohe Sensitivität ist
erforderlich, damit möglichst wenige Anfälle übersehen werden und somit die Epileptogenese
im Tiermodell genau beurteilt werden kann.
Material und Methoden
35
Es wird zwischen der Detektion länger andauernder Anfälle mit Spike-Wave-Muster und
Anfällen mit Burst-Suppression-Muster (BSM) unterschieden und eine Bewertung zur
Detektion von ETPs gegeben.
Material und Methoden
36
2.3 Lokale subdurale Valproatapplikation am Menschen bei pharmakoresistenten fokalen neokortikalen Epilepsien: intraoperative Pilotstudie
Die Durchführung der Studie wurde mit der Antragsnummer 29/10 unter der Projektleitung
von Prof. Dr. J. Zentner, ärztlicher Direktor der Klinik für Neurochirurgie, von der Ethikkomission Freiburg genehmigt.
Die folgende Methodik basiert auf dem Studienprotokoll.
2.3.1 Patientenkollektiv und Durchführung
Tabelle 2-21: Materialien für intraoperative Pilotstudie
Materialien
Hersteller
Webloy Neuro Tupfer-Auflagen, Dicke 1.5 mm,
100 % Baumwolle
Tyco, Neustadt, D
Valproat - Orfiril® 100 mg/mL Injektionslösung
Desitin, Hamburg, D
Kochsalzlösung, steril, isotonisch
B. Braun, Melsungen, D
In die Studie wurden bisher zwei Patienten, 47 und 50 Jahre alt, mit pharmakoresistenter
fokaler neokortikaler Epilepsie eingeschlossen. Bei beiden Patienten war unabhängig von der
Studie die epilepsiechirurgische Resektion eines umschriebenen neokortikalen epileptogenen
Fokus nach abgeschlossener Durchführung eines invasiven Video-EEG-Monitoring mit
intrakraniellen subduralen Elektroden geplant. Beide Patienten wurden über Risiken und
Nutzen der Studie sowie des chirurgischen Eingriffs aufgeklärt und unterschrieben die
Einverständniserklärung. Mindestens vier Tage vor dem epilepsiechirurgischen Eingriff
durfte keine VPA eingenommen oder verabreicht werden. Bei der Prämedikation wurde auf
Benzodiazepine und bei der Narkose auf Propofol verzichtet. Es lag keine sub- oder epidurale
Blutung im Bereich des zu resezierenden neokortikalen epileptogenen Fokus vor, genauso
wenig wie eine Unverträglichkeit oder allergische Reaktion auf VPA. Bei beiden
Gesichtspunkten handelte es sich um Ausschlusskriterien der Studie.
Bei jedem Probanden wurde anhand der mindestens 24 h dauernden invasiven EEGAufzeichnungen durch visuelle Analyse von Dr. Altenmüller (ein Epileptologe, mit der
bereits erwähnten großen Erfahrung in der Interpretation von intrakraniellen EEGs) diejenige
Elektrode ermittelt, die die stärkste neokortikale epileptische Aktivität aufwies. Der
Neokortex direkt unterhalb dieses Elektrodenkontaktes wurde als zentraler epileptogener
Fokus definiert, während vier weitere im Abstand von 1 cm als erweiterter Fokus und vier im
Material und Methoden
37
Abstand von 1.41 cm als neokortikaler Fokus außerhalb benannt wurden, wie in der
folgenden Abb. 2-9 dargestellt ist:
Abb. 2-9: Darstellung der Definition des Fokus
und der VPA-Applikationsfläche
Während der OP wurde zunächst über die subdural implantierten Elektroden nach deren
Freilegung eine elektrokortikographische Aufzeichnung über 20 min durchgeführt, die
Baseline-Ableitung. Anhand von Gridelektroden wurden die vorhergesehenen Resektionsgrenzen präzise markiert und die Elektroden anschließend entfernt. Es erfolgte die Platzierung
eines 2 € großen Neuro-Tupfers direkt auf dem zentralen Fokus. Die runden, 2 € großen
Tupfer mit einem Ø von 25 mm waren zuvor unter sterilen Bedingungen aus quadratischen
Neuro-Tupfern ausgestanzt worden. Zunächst wurde der erste Tupfer als Kontrolle mit
0.5 mL 0.9 % NaCl getränkt und für 20 min belassen. Nach erneuter Auflegung der
subduralen Gridelektroden folgte eine 20-minütige ECoG-Ableitung. Anschließend wurde ein
weiterer gleich großer Neuro-Tupfer ebenfalls direkt auf dem zentralen Fokus platziert und
diesmal mit 0.5 mL VPA-Injektionslösung (Orfiril® 100 mg/mL) getränkt und für 20 min
belassen. Bei Patient 1 wurde das VPA im Verhältnis 1:10 mit NaCl verdünnt, während
Patient 2 mit unverdünntem VPA, also im Verhältnis 1:1, behandelt wurde.
In Vorarbeiten war die Freisetzungskinetik von VPA aus den getränkten Neuro-Tupfern in
vitro evaluiert worden, wobei sich zeigte, dass nach 20 min >95 % des VPA freigesetzt war
[70]. Aufgrund dieser schnellen Freisetzungskinetik waren sie ideal für die intraoperative
Studie.
Nach Entfernung des Tupfers fand eine weitere 20-minütige ECoG-Ableitung über dem
zentralen, dem erweiterten und dem Fokus-außerhalb statt.
Hinterher wurde das epileptische Areal wie vorhergesehen reseziert.
Material und Methoden
38
Abb. 2-10: Intraoperative Bilder
Links OP-Feld mit NaCl/VPA getränkter Neuro-Tupfer von Patient 2, rechts OP-Feld
während der ECoG-Ableitung mit platzierten Gridelektroden von Patient 1.
2.3.2 Datenauswertung
Materialien
Hersteller
GraphPad Prism 6
GraphPad Software, Inc., CA, USA
Profusion EEG 4 Software
Compumedics Limited, Abbotsford, AUS
Ein Epileptologe (Dr. Altenmüller) analysierte für jeden Patienten qualitativ die epileptische
Aktivität (interiktale ETPs, niedrigamplitudige hochfrequente Aktivität, Suppressionsphasen
(SUPs) und/oder subklinische Anfallsmuster) und legte für die weitere quantitative
Auswertung den jeweiligen Kanal, eine geeignete Montage und die Filtereinstellungen
(Tiefpass-Filter 120 Hz, Hochpass-Filter 1 Hz/1.6 Hz, Wechselstrom (50 Hz)-Filter eingeschaltet, Zeitbasis 10 s/Seite) fest. Zwei weitere, in der Auswertung intrakranieller EEGs
ausgebildete Assistenten (J. Hebel und ich) führten verblindet eine quantitative Auswertung
an dem über dem zentralen neokortikalen Fokus liegenden Elektrodenkontakt durch (primäres
Zielkriterium). Die beiden benachbarten Elektrodenkontakte durften zur Beurteilung der
epileptischen Aktivität im zentralen Fokus herangezogen werden. Für die Verblindung waren
die insgesamt 60 min ECoG (drei mal 20 min, Baseline, nach NaCl und nach VPA) in
einzelne Minutenblöcke geschnitten, sodass keine Zuordnung bei der Auswertung zum
Zeitpunkt vor oder nach VPA-Gabe erfolgen konnte. Für die Auswertung wurde das
Profusion EEG4 Programm verwendet.
Bei dem ersten Patient stellte sich die intraoperative epileptische Aktivität als BSM dar,
siehe Abb. 2-10. Somit wurden die Anzahl der Suppressionphasen ausgezählt und deren
Länge genau ausgemessen. Hierbei wurde die Zeit vom positiven Umkehrpunkt eines Bursts
bis zum Wiederbeginn der physiologischen Hirnaktivität oder dem nächsten Burst gezählt.
Material und Methoden
39
Abb. 2-11: ECoG-Beispiel Patient Nr. 1 mit BSM
Bei Patient Nr. 2 wurde hingegen für jede Minute die Anzahl der ETPs ausgezählt.
Abb. 2-12: ECoG-Beispiel Patient Nr. 2 mit ETPs
Artefaktreiche Abschnitte wurden nicht in die Auswertung einbezogen und die Anzahl der
ETPs/SUPs der betreffenden Minutenblöcke nachfolgend auf 60 s umgerechnet.
Nach Entblindung der Daten wurden jeweils die Mittelwerte der Anzahl der ETPs/SUPs
der 20-minütigen Ableitung vor und nach Auflage des NaCl-getränkten Neurotupfer sowie
nach Auflage des VPA-getränkten Neurotupfer bestimmt. Bei Patient Nr. 1 wurden zusätzlich
die durchschnittliche Dauer SUPs verglichen.
Bei beiden Patienten wurden die Mittelwerte je 20 min-Block statistisch mit Hilfe von
GraphPad Prism mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse und Bonferroni-Korrektur
verglichen, um die Hypothese zu beweisen oder zu widerlegen, dass lokal verabreichtes VPA
die epileptische Aktivität im menschlichen Neokortex senkt. Die Ergebnisse wurden ebenfalls
mit GraphPad Prism mit 95 % Konfidenzintervallen (CI95) dargestellt.
Bei Patient2 wurden zusätzlich die ETPs/min in einer Graphik dargestellt, um den
zeitlichen Verlauf der ETPs/min genau beurteilen zu können, sowie die Variabilität zwischen
den beiden Auswertungen (J. Hebel und ich) zu präsentieren.
Ergebnisse
40
3 Ergebnisse
3.1 Studienpopulation
Insgesamt wurden über einem Zeitraum von acht Monaten zwölf Ratten mit unterschiedlichen
epileptogenen Schemata operiert. Diese Tiere wurden in vier Versuchsgruppen, wie oben
beschrieben, eingeteilt.
Von allen Ratten wurden insgesamt 1576 h Video-ECoG visuell bezüglich der Quantität
und Qualität der Anfälle, der Epileptogenese und der klinischen Relevanz ausgewertet und
anschließend zum Teil mit den Ergebnissen des halbautomatischen Auswertungsprogrammes
von Herrn Dr. Hopfengärtner aus Erlangen verglichen.
Tabelle 3-1: Rattenübersicht
Ratte
Nr.
Epileptogenes
Agenz
OPDatum
Todes
Tag
Überlebenszeit (Tage
post-OP)
Nachinjektion
Anfälle
Ja/Nein
4
3 x 62.6 ng TeT +
7.44 mg CoCl2
11.05.11
23.05.11
12
-
Ja
5
3 x 62.6 ng TeT +
7.55 mg CoCl2
08.07.11
09.07.11
1
-
Ja
6
3 x 62.6 ng TeT +
7.39 mg CoCl2
13.07.11
07.10.11
-
Ja
7
3 x 62.6 ng TeT +
7.78 mg CoCl2
17.08.11
26.10.11
-
Ja
8
3 x 62.6 ng TeT
07.10.11
16.10.11
9
2x
62.6 ng
Ja
9
3 x 62.6 ng TeT
18.10.11
27.10.11
9
2x3x
62.6 ng
Ja
10
3 x 62.6 ng TeT
31.10.11
11.11.11
11
-
Ja
11
2 x 62.6 ng TeT
12.11.11
25.11.11
13
-
Ja
12
1 x 62.6 ng TeT
30.11.11
14.02.12
76 (für anderen
Versuch getötet)
1x
62.6 ng
Ja
13
Kobaltdraht,
Ø 1 mm
07.12.11
29.12.11
22
-
Ja
86 (für
Perfusion
getötet)
70 (für
Perfusion
getötet)
A
-
16.12.11
18.01.12
43/5
2x
62.6 ng
B
-
16.12.11
16.01.12
41/3
2x
62.6 ng
Ja (nach
Schein-OP)/
Nein (nach
TeT)
Nein (nach
Schein-OP)/
Ja (nach
TeT)
Ergebnisse
41
Im Folgenden werden die Ergebnisse der visuellen Auswertung der Video-ECoG-Dateien mit
der Entwicklung der elektrophysiologischen Aktivität sowie dem klinischen Korrelat jeder
einzelnen Ratte deskriptiv und detailliert dargestellt. Die quantitative Anfallsentwicklung
wird mit einer Graphik gezeigt, sowie typische ECoG-Beispiele für jedes Tier präsentiert.
Keines der Tiere erlitt eine sichtbare Infektion, die zum Abbruch der elektrographischen
Ableitungen geführt hätte, selbst nach ungewollter Ablösung der Ableite-Einheit auf dem
Kopf. Dies tolerierten die beiden betroffenen Tiere (Ratte Nr. 6 und 12) erstaunlich gut und
über der offenen Stelle bildete sich neues Fell.
Ergebnisse
42
3.1.1 Gruppe I: Ratte Nr. 4-7 mit 3 x 62.6 ng TeT und 7.5 mg CoCl2
3.1.1.1 Ratte Nr. 4
Das Versuchstier lebte zwölf Tage nach OP und zeigte repetitive Anfälle mit Spike-WaveMustern am Tag der OP, sowie am darauf folgenden. Vor Beginn der Anfälle wurden bereits
im induzierten Fokus immer wieder Slow-Spike-Wave-Komplexe erkannt, wie in Abb. 3-2 zu
sehen ist. Die Anfälle gingen vom induzierten Fokus aus, waren durchschnittlich 37 s lang
und zeichneten sich klinisch durch Myokloni des Kopfes aus. Es wurden keine subklinischen
Anfälle gefunden. Ab Tag 2 post OP konnten im ECoG keine eindeutigen Anfälle mehr
gefunden werden. Die Ableitequalität war mäßig aufgrund eines Steckfehlers im Deckel des
Ableitesystems und mehrfacher Dekonnektion durch die Ratte. Die Elektroden waren infolge
des Steckfehlers um eine Position versetzt, sodass auf der MCR1 nur Artefakte zu sehen
waren, auf der MCR2 Signale der MCR1, auf der MCL die der MCR2 ect.
Tabelle 3-2: Steckfehler
MCR1
MCR
MCL
PCR
PCL
TML
MCR1
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
Die Ursache, weshalb ab dem 2. post-OP Tag keine Anfälle mehr gefunden werden konnten,
kann möglicherweise an den schlechten Ableitebedingungen liegen, da klinisch im Video
einige anfallstypischen Stellen gesichtet wurden, oder aber durch das Ausbleiben einer
suffizienten Epileptogenese. Die Anzahl der klinischen Anfälle (Abb. 3-1 rote Kurve) sind
aufgrund der Dekonnektionszeiten pro Stunde angegeben.
0,30
0,25
Anfälle/h
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
1
2
3
4
5
6
Tag post OP
Abb. 3-1: Anfallsentwicklung Ratte 4
7
8
9
10
11
12
Ergebnisse
43
ECoG Ratte 4
Anfall
MCR 1
MCR 2
MCL
30 s
Slow-Spike-Wave-Komplexe
1s
a
Steckfehler
500 µV
MCR 1
MCR 2
MCL
PCR defekt
PCL
1s
1s
b
Abb. 3-2: ECoG Ratte 4
Rote Pfeile = Fokus; Orange Pfeile = Propagation; Vertikale Maßstabsbalken = 500 µV
a) Slow-Spike-Wave-Komplexe im rechten Motorkortex vor dem 1. Anfall, Tag 1
b) Anfall am Tag 1 post OP beginnend im rechten Motorkortex, Fokus MCR 1/2,
Propagation in die linke Hemisphäre, zu sehen in der MCL und PCL im 30 s-Fenster;
vergrößerter Ausschnitt zur Darstellung der Spike-Wave-Komplexen im 10 s-Fenster
Ergebnisse
44
3.1.1.2 Ratte Nr. 5
Ratte Nr. 5 zeigte am Tag 1 post OP wiederholt spontane Anfälle, wie beispielhaft in Abb. 2
dargestellt. Insgesamt konnten 38 Anfälle gezählt werden, die sich klinisch vor allem mit
Myokloni des Kopfes manifestierten. Diese waren anfangs ca. 20 s lang, wurden gegen Ende
immer kürzen, bis sie zum Teil nur noch 3 s dauerten. Das Tier verstarb am selben Tag, weder
an einem epileptischen Anfall, noch an einer sichtbaren Infektion, sondern vermutlich
aufgrund von Schäden durch operative und anästhetische Schwierigkeiten während der OP.
Bipolar
MCR1-MCR2
MCR1-MCL
500 µV
MCR2-MCL
PCR-PCL
MCR1-PCR
MCR2-PCR
MCL-PCL
1s
Abb. 3-3: ECoG Ratte 5
Alle schwarze vertikale Balken entsprechen 500 µV, horizontale Balken 1 s
Die Abbildung zeigt einen gut abgegrenzten Anfall in der bipolaren Ansicht mit Frequenzund Amplitudenentwicklung und deutlichen Spike-Wave-Komplexen an Tag 1 post OP,
welche im 10 s Fenster zu sehen sind.
Ergebnisse
45
3.1.1.3 Ratte Nr. 6
Im Gegensatz zu den Tieren der NaCl-Gruppe der vorausgegangenen Versuche, welche in
Altenmüller et al. (2013) [4] beschrieben sind und eine hohe Dosis TeT (225 ng) und CoCl2
(15 mg) erhielten, konnte in dieser Arbeit mit Ratte 6 gezeigt werden, dass diese bei
reduzierter Toxindosis ohne lokale Therapie überlebte und repetitive, nicht provozierte
Anfälle präsentierte. Bei kontinuierlicher 24h-Video-ECoG-Ableitung wurden häufige, nicht
provozierte Anfälle mit Myokloni bis einschließlich Tag 12 dokumentiert. Diese Ergebnisse
sind ebenfalls in Altenmüller et al. (2013) [4] veröffentlicht.
Ratte 6 wurde insgesamt 822 h abgeleitet: 30 Tage nahezu kontinuierlich nach der OP
ohne längere Dekonntektionszeiten und zusätzlich vier Tage vom 50. bis 53. Tag
postoperativ. Hiervon wurden 558 h ausgewertet und 247 Anfälle detektiert; davon hatten 153
ein Videokorrelat und waren somit klinische Anfälle, die anderen restlichen 94 zählten als
subklinisch.
Vom Tag der OP an zeigte Ratte 6 wiederholt spontan auftretende Anfälle bis
einschließlich Tag 12. Die Mehrheit der Anfälle ging von Tag 1 bis 4 elektrophysiologisch
sowie klinisch vom linken Motorkortex aus. Klinisch zeigten sich vorrangig Myokloni des
Kopfes sowie der rechten, vorderen Extremität, also passend zum kontralateralen Fokus. Im
Rahmen der Epileptogenese wanderte der Fokus ab dem 5. Tag in den rechten Parietalkortex,
was sich elektrophysiologisch zeigte, sowie sich klinisch durch Myokloni der linken
Hinterpfote, des Kopfes und Version nach rechts äußerte. Einige Anfälle generalisierten
sekundär. Erstaunlicherweise gingen nur wenige Anfälle elektrophysiologisch vom rechten
Motorkortex, dem eigentlich induzierten Fokus, aus. Ab Tag 13 waren keine epileptischen
Anfälle mehr aufzufinden. Das Ausbleiben der Anfälle bestätigte sich bei erneuter ECoGVideo-Ableitung von Tag 50 bis 53.
Die folgende Grafik (Abb. 3-4) zeigt die Anfallsentwicklung von Ratte 6 im Verlauf. Es
werden die Anfälle/Tag und nicht pro Stunde wie bei den anderen Tieren dargestellt, da es bei
dieser Ratte so gut wie keine Dekonnektionszeiten gab und alle 24 h/Tag ausgewertet wurden.
Unterschieden werden von der in blau dargestellten Gesamtanzahl der Anfälle pro Tag, die
klinischen (rot) und subklinischen (grün) Anfälle.
Ergebnisse
46
Anzahl der Anfälle/Tag
100
90
Anfälle gesamt
80
Klinische Anfälle
70
Subklinische Anfälle
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
50 51 52 53
Tage post-OP
Abb. 3-4: Anfallsentwicklung Ratte 6
Die subklinischen Anfälle zeigten ihr Maximum am ersten postoperativen Tag und waren
danach selten zu sehen, wobei diese möglicherweise direkt Toxin-bedingt gewesen sein
könnten. Die klinischen Anfälle zeigen nach initialem Abfall der Frequenz einen Peak an Tag
5 post-OP, wie in den Vorversuchen in Altenmüller et al. (2013) [4] beschrieben.
Ab Tag 13 wurden keine Anfälle mehr registriert.
Ergebnisse
47
ECoG Ratte 6
MCR1
MCR2
MCL
1s
PCR
500 µV
PCL
TML
2s
a
MCR1
500 µV
MCR2
MCL
PCR
PCL
2s
TML
1s
b
MCR1
500 µV
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
5s
c
Abb. 3-5: ECoG Ratte 6
Rote Pfeile = Fokus; Orange Pfeile = Propagation; Vertikale Maßstabsbalken = 500 µV
a) Anfall mit Fokus in der MCL, Propagation in die MCR1/2 und die PCL
b) Anfall mit Fokus in der PCR, Propagation in die PCL
c) Anfall mit Fokus in der MCR 1/2, Propagation in die linke Hemisphäre
Ergebnisse
48
3.1.1.4 Ratte Nr. 7
Wie Ratte Nr. 6 zeigte auch das Tier Nr. 7 ein Überleben bei reduzierter Toxindosis mit
spontanen, reproduzierbaren Anfällen, allerdings nur in den ersten Tagen nach OP. Der
elektrophysiologische Fokus der Anfälle präsentierte sich bei diesem Tier in der MCLElektrode, kontralateral zu unserer Induktionsseite, wie bei Tier 6 in den ersten vier Tagen.
Semiologisch äußerten sich die Anfälle mit Myokloni der rechten Vorderpfote sowie des
Kopfes. Wenige sekundär generalisierte Anfälle führten zum Aufbäumen und Fallen durch
Verlust der Stellreflexe der Ratte. Insgesamt dauerten die Anfälle im Durchschnitt 33 (4112) s an. Ab Tag 3 post-OP waren keine Anfälle mehr zu finden.
Zu beachten ist, dass die Anfälle sich mit einer unterschiedlichen Frequenz präsentierten.
Abb. 3.7 zeigt zwei Anfälle, wobei Anfall a sich durch 3-4/s Spike-Wave-Aktivität
präsentierte, während Anfall b nur 1-2/s zeigte.
12
10
Anfälle/h
8
6
4
2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tage post OP
Abb. 3-6: Anfallsentwicklung Ratte 7
8
9
10
11
12
Ergebnisse
49
ECoG Ratte 7
MCR1
500 µV
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
5s
a
1s
1s
500 µV
MCR1
MCR2
MCL
PCR
PCL
1s
TML
b
Abb. 3-7: ECoG Ratte 7
Rote Pfeile = Fokus; Orange Pfeile = Propagation; Vertikale Maßstabsbalken = 500 µV
a) Anfall mit Fokus in der MCL, Propagation in die PCL und MCR1/2, 2 min-Fenster;
Zwei Ausschnitte des Anfalls in der REF- und Bipolaren Ansicht im 10 s-Fenster zeigen die
klaren Spike-Wave-Komplexe.
b) Ein weiterer Anfall im 30 s-Fenster mit Fokus in der MCL, Propagation in die MCR1/2
und PCL, postiktal ist ein Schüttelartefakt zu sehen, was häufig nach einem Anfall
beobachtet wurde.
Ergebnisse
50
Zusammenfassung Gruppe I
Die Versuchstiere der Gruppe I, die mit einer Trippelinjektion von je 62.6 ng TeT und 7.5 mg
CoCl2 behandelt wurden, zeigten spontane, wiederholt auftretende Anfälle besonders in den
ersten Tagen postoperativ. Mit der gekoppelten Behandlung der epileptogenen Substanzen
TeT und CoCl2 und einer Dosistitrierung im Vergleich zu den Vorversuchen erhielten wir
zwei überlebende Ratten mit spontanen, reproduzierbaren Anfällen bis maximal Tag 12.
Elektrophysiologisch zeigte das ECoG der Tiere interiktal vorwiegend einen ThetaRhythmus, der intermittierend mit Alpha und Delta-Aktivität variierte. Die iktale Amplitude
lag in einem Bereich von 150-1500 µV.
Ergebnisse
51
3.1.2 Gruppe II: Ratte Nr. 8-12 TeT unterschiedlicher Dosierung
3.1.2.1 Ratte Nr. 8
Bei Tier Nr. 8, das erste mit alleiniger TeT Injektion, begannen die Anfälle am Tag 1 postOP. Insgesamt konnten an diesem Tag 105 Anfälle mit Spike-Wave-Muster gezählt werden,
d.h. die Anfälle traten mit einer Frequenz von 4.5/h auf und hatten eine Durchschnittsdauer
von 21 s. Der elektrophysiologische Fokus der Anfälle war direkt in unserem induzierten
Fokus. Passend dazu zeigten sich klinisch Myokloni der kontralateralen, linken Vorderpfote
sowie des Kopfes. Im Verlauf ging die Frequenz rapide zurück und ab dem 4. Tag post OP
konnten keine Anfälle mehr gefunden werden. Die durchschnittliche Anfallsdauer nahm im
Gegensatz zur Frequenz im Verlauf zu. Sie betrug an Tag 2 post OP 27 s und an Tag 3 post
OP 30 s.
Da ab Tag 4 keine epileptischen Anfälle zu sehen waren, wurde an Tag 6 eine doppelte
Dosis TeT nachinjiziert. Danach traten jedoch keine Anfälle mehr auf und die Ratte verstarb,
wahrscheinlich durch das TeT verursacht, neun Tage nach der ersten OP. Ein Status
epilepticus oder eine sichtbare Infektion, die zum Tode hätten führen können, war weder im
Video-ECoG noch sonst feststellbar.
120
Anfälle gesamt
100
Anzahl der Anfälle/Tag
Klinische Anfälle
80
Subklinische Anfälle
60
Reinjektion:
2 x 62.5 ng TeT
40
20
0
0
1
2
3
4
5
Tage post OP
Abb. 3-8: Anfallsentwicklung Ratte 8
6
7
8
9
Ergebnisse
52
ECoG Ratte 8
MCR1
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
500 µV
1s
Abb. 3-9: ECoG Ratte 8
Rote Pfeile = Fokus; Orange Pfeile = Propagation; Vertikale Maßstabsbalken = 500 µV
Anfall Tag 1 post OP, Fokus MCR1, d.h. im induzierten Fokus; nach ca. 2 s propagiert der
Anfall in die linke Hemisphäre, synchron dazu ist im Video der Beginn von Myokloni der
Vorderpfoten zu sehen. Später auch Propagation in den rechten Parietalkortex. Die
Frequenzentwicklung des Anfalls ist klar sichtbar.
Ergebnisse
53
3.1.2.2 Ratte Nr. 9
Tier Nr. 9, identisch operiert wie Ratte 8, zeigte in den ersten Tagen post-OP keine Anfälle,
weder in unserem Fokus, noch außerhalb. Möglicherweise ist dies durch intraoperative
Probleme mit dem Injektionssystem der Hamiltonspritze zu erklären, weshalb zweifelhaft
war, ob das Toxin im Neokortex angekommen ist. Da die ersten drei Tage keine Anfälle
detektiert wurden, bekam das Tier am Tag 3 eine Triple-Dosis von 62.6 ng TeT nachinjiziert
und bei anhaltender Anfallsfreiheit erneut an Tag 6.
Nach der 2. Nachinjektion trat ein neues Phänomen auf: Es waren Anfälle mit einem
anderen elektrophysiologischen Muster zu sehen und zwar mit BSM. Diese Anfälle von BSM
stellten sich durch spontane Entladungen dar, die sich deutlich in der Frequenz und Amplitude
von der Grundaktivität abhoben und von einer Phase der unterdrückten Hirnaktivität gefolgt
wurden. Klinisch manifestierten sich diese durch einen oder mehrere Myokloni. Zwischen
den Anfällen mit BSM zeigten sich zusätzlich einzelne iktale ETPs mit Myokloni gekoppelt.
Die Anzahl der Anfälle nahm innerhalb der nächsten drei Tage (Tag 7-9) so stark zu, dass
sich der Allgemeinzustand der Ratte bedeutend verschlechterte und sie schließlich an Tag 9
getötet werden musste. Am Ende zeigte das Tier teilweise über 20 Anfälle/h, die jeweils
mehrere Sekunden andauerten und befand sich somit in einem Status epilepticus.
35
ETPs mit Myokloni
30
Anfälle mit BSM (BurstSuppression-Muster)
Ereignisse/h
25
ETPs mit Kloni + BSM
20
15
Reinjektion:
3 x 62.5 ng TeT
10
Reinjektion:
3 x 62.5 ng TeT
5
0
0
1
2
3
4
5
Tage post-OP
Abb. 3-10: Anfallsentwicklung Ratte 9
6
7
8
9
Ergebnisse
54
ECoG Ratte 9
MCR1-MCR2
MCR1-MCL
MCR2-MCL
PCR-PCL
500 µV
MCR1-PCR
MCR2-PCR
MCL-PCL
1s
Abb. 3-11: ECoG Ratte 9
Die Abb. zeigt einen BSM-Anfall in der bipolaren Ansicht von Ratte 9: Ein
Spike-Wave-Komplex mit hohen Amplitude, gefolgt von einer Suppression.
Klinisch korrelierten die Anfälle im EEG mit Myokloni der Vorderpfoten
begleitet von einer Rotation nach rechts.
Ergebnisse
55
3.1.2.3 Ratte Nr. 10
Tier Nr. 10 erhielt bei Erst-OP, genauso wie Tier 8 und 9, eine Dreifachinjektion von 62.6 ng
TeT. Die Epileptogenese dieses Tieres zeigte interessanterweise eine Mischung der
Epileptogenese der anderen beiden Tiere. In den ersten beiden Tagen wurden länger
andauernde, rekurrierende Anfälle mit repetitiven Spike-Wave-Mustern gefunden. Anfangs
befand sich der elektrophysiologische und klinische Fokus im injizierten Fokus, d.h. im
rechten frontalen Motorkortex. Passend dazu zeigten sich das klinische Bild von Myokloni
der linken Vorderpfote und des Kopfes. Teilweise propagierten die Anfälle in die
kontralaterale Hemisphäre, was in der MCL sichtbar war.
Dann migrierte der Fokus am zweiten Tag in den linken Motorkortex, teilweise mit
Propagation nach posterior und dazu passendem klinischem Bild: kontralaterale Myokloni
rechts und des Kopfes.
Insgesamt wurden am 1. Tag post OP zwölf längere Anfälle mit Spike-Wave-Muster mit
einer Durchschnittsdauer von 19 s und am 2. Tag post OP elf mit einer Durchschnittsdauer
von 22 s gefunden.
0,6
Anfälle gesamt
Anzahl der Anfälle/h
0,5
Klinische Anfälle
0,4
Subklinische Anfälle
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tage post-OP
Abb. 3-12: Länger andauernde Anfälle/h Ratte 10
Gleichzeitig konnten ab Tag 2 einzelne ETPs mit synchronen Myokloni beobachtet werden,
die in den folgenden Tagen an Frequenz zunahmen.
Ab Tag 3, als keine länger anhaltenden Anfälle mehr zu finden waren, begannen
stattdessen tonische und tonisch-klonische Anfälle mit BSM korrelierend mit dem Signal in
der Muskelelektrode, der TML.
Ergebnisse
56
Fünf Tage nach der TeT Injektion konnten keine klar zählbaren Anfälle mehr gefunden
werden. Das ECoG zeigte viele repetitive ETPs, welche sich klinisch in einzelnen Myokloni
der linken Vorderpfote äußerten.
Da die ETPs beinahe jede Sekunde, also nahezu kontinuierlich auftraten, konnten sie nicht
gezählt werden. Das Bild erinnerte an eine neokortikale Epilepsie beim Menschen,
insbesondere an eine Epilepsia partialis continua (EPC), welche klinisch als Syndrom mit
kontinuierlichen fokalen Zuckungen eines Körperteils definiert ist [112, 116] und als erstes
von dem russischen Neurologen Kojewnikow beschrieben wurde [74, 135]. Ab Tag 8 konnten
zusätzlich wieder einige klar abgrenzbare Anfälle vom BSM zwischen iktalen ETPs mit
Myokloni gefunden werden, wodurch sich der Allgemeinzustand des Tieres verschlechterte:
Die Ratte aß und trank nichts mehr, war schreckhaft und aggressiv. Am 11. Tag nach
Induktion des epileptischen Fokus wurde sie anlässlich ihres schlechten Allgemeinzustandes
getötet.
25
20
Ereignisse/h
ETP mit Myokloni
15
Anfälle mit BSM
ETP + BSM
10
Anfälle mit SpikeWave-Muster
5
0
0
1
2
3
4
Tage post OP
Abb. 3-13: Anfallsentwicklung Ratte 10 der ersten Tage
Ergebnisse
57
ECoG Ratte 10
MCR1
500 µV
MCR2
MCL
PCR
PCL
1s
TML
a
500 µV
MCR1
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
1s
b
MCR1
500 µV
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
1s
c
Abb. 3-14: ECoG Ratte 10
Rote Pfeile = Fokus; Orange Pfeile = Propagation; Vertikale Maßstabsbalken = 500 µV
a) Myoklonische Anfall mit elektrophysiologischem Fokus in der MCR1/2 an Tag 1
b) Anfall mit Fokus in der MCL an Tag 2
c) Tonischer Anfall mit BSM korrelierend mit dem muskulären Signal in der TML an Tag 3
Ergebnisse
58
Zusammenfassung Ratte 8-10
U
Zusammenfassend kann man sagen, dass alle drei Ratten, die bei Erst-OP dieselbe Dosis TeT
erhalten hatten, eine unterschiedliche Epileptogenese entwickelten. Alle Tiere hatten zwar
Anfälle, jedoch mit unterschiedlicher Anfallsfrequenz und unterschiedlichen Mustern. Zwei
von ihnen, Nr.8 und 10, hatten Anfälle mit einem repetitiven Spike-Wave-Muster und
ebenfalls zwei, Ratte Nr. 9 und 10, welche vom BSM-Typ. Allen drei Ratten gemeinsam war
der Tod innerhalb der zweiten Woche.
3.1.2.4 Ratte Nr. 11
Da die ersten drei Versuchstiere der Gruppe II alle innerhalb der zweiten Woche verstarben,
wurde die TeT-Menge bei Ratte 11 bei Erst-OP von einer dreifachen auf eine doppelte Menge
TeT, 2 x 62.6 ng, reduziert. Auch bei dieser weiter reduzierten Toxindosis traten längere
Anfälle mit Spike-Wave-Muster auf, allerdings erst am Tag 2 post OP. Der elektrophysiologische und klinische Fokus lag bei den 16 Anfällen ebenfalls in dem induzierten Fokus, im
rechten Motorkortex. Die Durchschnittsdauer der Anfälle lag bei 15 (6-42) s Klinisch waren
die Anfälle von Myokloni der kontralateralen Vorderpfote und des Kopfes gekennzeichnet.
Auch an Tag 6 und 7 fanden sich länger andauernde Anfälle, jedoch nicht mehr mit einem
eindeutigen Fokus, sondern mit elektrophysiologisch generalisiertem Beginn. Klinisch
manifestierten sich die Anfälle durch einen Initialklonus, gefolgt von einer Rotation nach
rechts und Kopfkloni, teilweise auch Myokloni beider Vorderpfoten mit einer
durchschnittlichen Dauer von 34 (5-77) s Es wurden keine subklinischen Anfälle gefunden.
2,5
Anfälle/h
2
1,5
1
0,5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tag post-OP
Abb. 3-15: Längere Anfälle mit Spike-Wave-Muster/h Ratte 11
Außerdem begannen ab Tag 2 einzelne Spikes mit synchronen myklonischen Zuckungen
aufzutreten, nahmen dann täglich stark an der Anzahl zu, so dass ab Tag 7 das Video nicht
mehr zu jedem Spike gesichtet werden konnte. Aus den ersten Tagen ergab sich jedoch, dass
Ergebnisse
59
sich bei insgesamt 75 % der ETPs synchron im Video Myokloni zeigten. Ab Tag 8 begannen
eindeutige Anfälle mit BSM.
250
ETPs
ETPs mit Myokloni
Benzodiazepin - Therapie
200
ETPs/h
150
100
50
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Tage post-OP
Abb. 3-16: Epilepsietypische Potentiale/h Ratte 11
Die Anfälle mit BSM nahmen bis Tag 10 sehr stark zu, sodass sich die Ratte interiktal nicht
erholen
konnte.
Das
Tier
zeigte
typische
Frontallappen-Anfälle
mit
komplex
hypermotorischem klinischen Korrelat, Myokloni ein- und beidseitig und Rotation nach
rechts.
Aufgrund des schlechten Allgemeinzustandes der Ratte und weil das Tier nicht erneut zu
solch einem frühen Zeitpunkt geopfert werden sollte, wurde ein Therapieversuch
durchgeführt. Im ersten Schritt bekam das Tier 0.8 mL VPA (100 mg/mL Orfiril®) i.p. bei
einem geschätzten Gewicht von 400 g injiziert. Die Dosis wurde auf der Grundlage von
Löscher et al. (1993) [87] festgelegt, bei denen Phenytoin-resistente Kindling-Ratten
200 mg/kg KG VPA i.p. erhielten. Im Anschluss zeigten sich weiterhin ETPs mit komplex
motorischen Anfällen, teils kontinuierlichen Kloni ohne ECoG-Korrelat. Der interiktale
ECoG-Befund zeigte unverändert Delta-Aktivität.
Unter systemischer VPA-Gabe zeigte sich weder eine Anfallsfreiheit noch eine
ausreichende Minderung der Anfallsfrequenz, obwohl VPA eines der Medikamente in der
Ersttherapie bei fokalen Epilepsien beim Menschen ist [42]. Zur Unterbrechung der sehr
hohen Anzahl von Anfällen, von denen sich die Ratte nicht erholte, wobei der Zustand somit
einem Status epilepticus glich, wurde ihr drei Stunden nach VPA-Injektion DZP i.p injiziert.
Ergebnisse
60
Basierend auf der Arbeit von Walker et al. (1998) [137] wurde eine hohe Dosis von
30 mg/kg KG i.p. gewählt. Das entspricht bei einem Gewicht von ca. 400 g etwa 12 mg DZP.
Direkt nach DZP-Injektion konnten im ECoG noch häufig BSM anderer Konfiguration
mit starker Suppression zwischen den Bursts gefunden werden, wobei die Ratte klinisch
weder Kloni noch sonstige Bewegungen präsentierte, höchstwahrscheinlich durch die DZP
bedingte Muskelrelaxierung und Sedierung. Etwa eine Stunde später änderte sich das ECoGMuster: Das BSM endete und ging in diffuse Beta-Aktivität über. Dies wurde als
Benzodiazepineffekt gewertet und der Status war durchbrochen. Aus der klinischen
Anwendung ist ein solcher Effekt von Barbituraten bekannt. DZP hat eine Halbwertszeit von
>24 h und seine aktiven Metaboliten eine von 30-90 h [46], was erklärt weshalb der Effekt
mehrere Stunden anhielt.
An Tag 12, eineinhalb Tage nach DZP-Injektion, ließ der Effekt allerdings nach und es
wurden erneut Spikes mit Kloni, sowie größere Frontallappenanfälle mit komplex
hypermotorischer Klinik gefunden. Deshalb wurde dem Tier erneut DZP injiziert, diesmal in
niedrigerer Dosis von 15 mg/kg KG, um das Tier nicht gleichzeitig zu narkotisieren.
Der Status konnte auch mit reduzierter Dosis unterbrochen werden, jedoch ohne lang
anhaltenden Effekt. Der Wiedereintritt der rhythmischen Aktivität war viel fokaler, klinisch
begleitet durch EPC der linken Vorderpfote, welche nur teilweise ein elektrophysiologisches
Korrelat kontralateral in der MCR hatte.
Da sich die Ratte schließlich wieder im Status befand, wurde ein letzter Therapieversuch
unternommen: Mit Hilfe des direkt über dem Fokus implantierten Schlauches wurden lokal
im OP nach Freifräsen des Schlauches 0.3 mL Orfiril, d.h. 30 mg VPA, injiziert. Es kam zu
keinem durchschlagenden Effekt. Nach Abklingen des Isofluraneffektes zeigte sich innerhalb
von Minuten wieder rhythmische Aktivität mit 2 Hz in der MCL-Elektrode und
intermittierendem BSM.
Zusammenfassend kann man sagen, dass DZP den epileptischen Status für einige Stunden
unterbrechen konnte, während VPA weder i.p. noch intrakortikal verabreicht eine Wirkung
zeigte. Es ließ sich feststellen, dass der Status sowie die vielen Anfälle zuvor von dem
induziertem Fokus ausgingen, da bei niedriger DZP-Dosis die Unterbrechung der Kloni aus
der Motorregion nicht erreicht wurde, die Semiologie also weiterhin bestand.
Am Tag 13 post OP wurde die Ratte aufgrund des schlechten Allgemeinzustand getötet.
Ergebnisse
61
ECoG Ratte 11
500 µV
MCR1
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
1s
a
Bipolar
500 µV
REF
1s
b
1s
Abb. 3-17: ECoG Ratte 11 – Längere Anfälle
Rote Pfeile = Fokus; Orange Pfeile = Propagation; Vertikale Maßstabsbalken = 500 µV
a) Anfall Tag 2 post OP mit Fokus in der MCR1/2, Propagation in die PCR und einige
Sekunden später in die PCL
b) Anfall Tag 6 beginnt mit Initial-Spike und Initialklonus. Der Beginn des Anfalls ist
zusätzlich in der REF dargestellt.
Ergebnisse
62
Abb. 3-18: ECoG Ratte 11 – Therapieversuche
a) Vor Therapie: repetitive Anfälle mit BSM
b)nach VPA i.p.: weiterhin repetitive BSM-Anfälle
c) 2 h nach DZP 30 mg/kg KG i.p.: keine Anfälle
mehr sichtbar, beta Rhythmus
d) Nach Ende der DZP Wirkung: erneute BSMAnfälle
e) Nach DZP 15 mg/kg KG i.p.: vereinzelt ETPs
mit Myokloni, aber fokaler: ETPs vor allem in
der MCR1/2!
f) Nach VPA intrakortikal: trotzdem Anfälle vom
BSM-Typ
Alle horizontalen Maßstabsbalken entsprechen 1 s; Die vertikalen Maßstabsbalken wurden zwecks
besserer Übersichtlichkeit nicht eingetragen. Alle Abbildungen des Therapieversuchs wurden jedoch
zur Vergleichbarkeit mit derselben Amplitude aufgenommen.
Ergebnisse
63
3.1.2.5 Ratte Nr. 12
Da auch eine Doppelinjektion von 62.6 ng TeT noch immer zu einer extrem hohen Anzahl
von repetitiven, spontanen Anfällen geführt hatte, bekam Tier Nr. 12 nur eine Einzelinjektion
von 62.6 ng TeT. In den ersten Tagen nach OP wurde lediglich ein einzelner, 19 s langer
Anfall an Tag 1 post OP detektiert, weshalb das Tier an Tag 5 eine zusätzliche Einzeldosis
von 62.6 ng TeT nachinjiziert bekam. Ab Tag 10 post OP zeigte sich nach insgesamt
zweimaliger TeT-Injektion epileptische Aktivität durch ETPs mit synchronen Myokloni, die
im Verlauf an Frequenz zunahmen und über einen Zeitraum von bis zu mindestens 25 Tagen
relativ konstant anhielten. Bei Erreichen einer hohen Anzahl an ETPs konnte nicht mehr zu
jedem ETP das Video gesichtet werden. Auch hier zeigten sich in den ersten Tagen bei
ca.75 % der ETPs zeitgleich Myokloni. Von Tag 12 bis Tag 21 wurden außerdem Anfälle
vom BSM beobachtet und an Tag 30 konnte ein weiterer längerer Anfall aufgezeichnet
werden. Bei gutem Allgemeinzustand und uneingeschränkter Mobilität riss sich das Tier an
Tag 36 die gesamte „Ableitekrone“ samt Elektroden vom Schädel ab, sodass keine weiteren
Ableitungen durchgeführt werden konnten. An Tag 58 wurden der Ratte neue Elektroden
implantiert, um den Verlauf der Epileptogenese beurteilen zu können. In weiteren
Ableitungen konnten jedoch keine ETPs mehr mit synchronen Myokloni im Verlauf gesichtet
werden. In Abb. 3-19 ist die epileptische Aktivität bis Tag 35, bis zum Verlust der
„Ableitekrone“, dargestellt.
80
ETP mit Myokloni
70
ETP
60
Anfälle mit BSM
Ereignise/h
50
Anfälle mit SpikeWave-Muster
40
30
Reinjektion:
62.5 ng TeT
20
10
0
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tage post OP
Abb. 3-19: Epileptische Aktivität Ratte 12
Ergebnisse
64
Ratte 12 präsentierte sich als ein überlebendes Tier mit Induktion des epileptischen Fokus
durch zweimalige TeT-Injektion mit niedriger Dosis und anhaltender epileptischer Aktivität
über mindestens 25 Tage (Keine ECoG Aufzeichnungen zwischen Tag 35 und 58), welche
sich durch ETPs mit synchronen Myokloni und Anfälle mit BSM äußerten.
ECoG Ratte 12
U
REF
BIPOLAR
500 µV
REF
BIPOLAR
500 µV
a
b
MCR1
MCR2
MCL
500 µV
PCR
PCL
TML
c
Abb. 3-20: ECoG Ratte 12
Alle vertikalen Maßstabsbalken entsprechen 500 µV
a) ETP mit Myoklonus Tag 10
b) Anfall mit BSM Tag 14
c) ETP mit Myoklonus und interiktales Auftreten von Slow-Spike-Wave-Komplexen in der
MCR 1/2 Tag 29 post OP.
Ergebnisse
65
Zusammenfassung Gruppe II
Die Tiere der Gruppe II erhielten als einziges epileptogenes Agens TeT, wie in einigen
Vorversuchen (siehe 1.7) und bei Nilsen et al. (2005, 2006) beschrieben [105, 106]. Als
Neuheit wurde zusätzlich ein Schlauch mit Mandrin zur Nachinjektion von TeT implantiert
und ein sogenanntes chemisches Kindling durchgeführt. Die Tiere zeigten ebenfalls Anfälle,
jedoch mit verschiedenen Mustern. Teilweise fanden sich in den ersten Tagen post OP
gleichermaßen tonisch-klonische Anfälle mit repetitiven Spike-Wave-Muster, wie bei den
Tieren der Gruppe I. Zusätzlich präsentierten sich Anfälle mit BSM und klinischem Korrelat.
Elektrophysiologisch war interiktal meist ein Theta-Rhythmus zu sehen, der sich mit Alpha
und Delta-Aktivität abwechselte. Die Amplitude der ETPs lag in einem Bereich von 150700 µV und bei den Spikes der Anfälle mit BSM bis 2000 µV.
Betrachtet man nur Anfälle mit BSM und ETP mit Myokloni, zeigt sich die in der
folgenden Grafik aufgeführte Epileptogenese. Eine hohe Dosis TeT, wie bei Ratte 9-11,
führte zur schnellen überschießenden epileptischen Aktivität mit schlechter Verträglichkeit.
Bei Ratte 9 ist der spätere Eintritt durch Probleme mit dem Injektionssystem erklärbar, da
möglicherweise erst bei Nachinjektion TeT im Neokortex ankam. Auch Ratte 11 präsentierte
bei leicht reduzierter Toxindosis eine zu starke epileptische Aktivität. Nach weiterer
Reduktion der Toxindosis und chemischen Kindling nach fünf Tagen zeigte Ratte 12
schließlich eine sich langsam entwickelnde Epileptogenese mit anhaltender epileptischen
Aktivität für mindestens 25 Tage.
ETPs mit Myokloni + BSM/h
180
160
Ratte 9
140
Ratte10
120
Ratte 11
100
Ratte 12
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Tage post OP
Abb. 3-21: Epileptogenese nach TeT-Injektion
Ergebnisse
66
Ein TeT-Modell mit Implantation eines Schlauches zur Nachinjektion und Induktion des
epileptische Fokus durch mehrere niedrige Dosen von TeT stellt ein gutes Modell für fokale
neokortikale Epilepsien und der Entwicklung neuer Therapieoptionen dar.
Ergebnisse
67
3.1.3 Gruppe III: Ratte Nr. 13 Kobaltdraht
3.1.2.6 Ratte Nr. 13
Versuchstier Nr. 13 wurde als epileptogenes Agens ein Kobaltdraht 1 mm in den Kortex
implantiert. Es zeigte ausschließlich subklinische Anfälle und zwar nur an den Tagen 5 und
11 mit einer durchschnittlichen Dauer von 15 (11-18) s.
1,6
1,4
Anfälle/h
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
2
3
4
5
6
7
Tag post OP
8
9
10
11
12
Abb. 3-22: Anfallsentwicklung Ratte 13
ECoG Ratte 13
U
MCR1-MCR2
500 µV
MCR1-MCL
MCR2-MCL
PCR-PCL
MCR1-PCR
MCR2-PCR
MCL-PCL
1s
Abb. 3-23: ECoG Ratte 13
Subklinischer Anfall Tag 11, bipolare Ansicht
Ergebnisse
68
3.1.3 Gruppe IV: Kontrollgruppe
Den Tieren A und B wurden bei ihrer ersten OP keine Toxine in oder auf den Neokortex
appliziert; sie dienten somit der Evaluation des OP-Traumas auf die Epileptogenese.
Während Ratte B in den gesamten 27 Tagen als Kontrolltier keinen einzigen Anfall zeigte,
wurden bei Ratte A interessanterweise in den ersten drei Tagen nach OP länger andauernde
Anfälle mit Spike-Wave-Muster gefunden. Allerdings war der elektrophysiologische Fokus
der Anfälle nicht im rechten Motorkortex lokalisiert, sondern im linken Motorkortex und im
rechten Parietalkortex, wie bei den Tieren 6 und 7 und teilweise auch 10. Klinisch äußerten
sich die Anfälle passend dazu mit kontralateralen Myokloni und Kopfkloni und hatten eine
durchschnittliche Dauer von 29 s.
1
Ratte A
0,9
Ratte B
0,8
0,7
Anfälle/h
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
Tage post OP
Abb. 3-24: Epileptogenese der Kontrolltiere
6
7
27
Ergebnisse
69
ECoG Ratte A
MCR1
500 µV
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
2s
MCR1
a
500 µV
MCR2
MCL
PCR
PCL
TML
2s
b
Abb. 3-25: ECoG Ratte A
Rote Pfeile = Fokus; Orange Pfeile = Propagation; Vertikale Maßstabsbalken = 500 µV
a) Anfall mit Fokus in der MCL und Propagation an Tag 1 post OP
b) Anfall mit Fokus in der PCR und Propagation in die PCL an Tag 2 post OP
Ergebnisse
70
Epileptogenese der Tiere A und B nach TeT-Nachinjektion
Die beiden Kontrolltiere bekamen 28 Tage nach Schein-OP jeweils 2 x 62.6 ng TeT über den
implantierten Schlauch nachinjiziert. Tier A zeigte im Anschluss keine epileptische Aktivität
und verstarb fünf Tage später möglicherweise toxinbedingt. Tier B zeigte einige epileptische
Anfälle am dritten Tag post OP und verstarb infolge eines Anfalls.
Nach Auswertung der Daten von Ratte 12 lässt sich schlussfolgern, dass die TeT-Dosis
bei Nachinjektion über den Schlauch zu hoch war und zusätzlich das gesamte TeT nur an eine
einzige Stelle des Kortex appliziert wurde.
Ergebnisse
71
3.2 Histologische Ergebnisse
Die folgenden Abbildungen präsentieren die histologischen Frontalschnitte jeder Ratte ca.
2.52 mm frontal des Bregmas. Anschließend folgen ebenfalls Frontalschnitte der jeweils
größten Läsionen.
Beispielhaft ist Bild 13 des Ratten-Gehirn-Atlas [114] aufgeführt.
Ratten Gehirn Atlas, Bild 13, Bregma 2.52 mm
M2
M1
M1 = primär
motorische Rinde
M2 = sekundär
motorischer Kortex
Histologische Frontalschnitte ca. 2.52 mm vor dem Bregma jeder Ratte
Gruppe I: 187.8 ng TeT + 7.5 mg CoCl2
Ratte 4
Ratte 5
Ratte 6
Ratte 7
Abb. 3-26: Histologische Darstellung Gruppe I 2.52 mm vor dem Bregma
Sehr große Läsionen bei Ratte 4 und 5, die durch unerwartetes Versterben nicht perfundiert
werden konnten. Tier 4 zeigt eine ausgeprägte Nekrosezone; Tier 5 ebenfalls ein großes
geschädigtes, aufgelockertes Areal; kleinere Läsionen bei Tier 6 und 7, wobei Tier 6
Ergebnisse
72
außerdem einen Hydrocephalus internus zeigte. Die histologischen Schnitte von Tier 4 und 5
liegen noch weiter frontal des Bregmas als 2.52 mm. Da die beiden Tiere nicht perfundiert
werden konnten, war die Fixierung des Gewebes schlecht und es konnten somit nur wenige
Schnitte gewonnen werden. Die hier präsentierten Schnitte liegen der Ebene 2.52 mm vor
dem Bregma am nächsten.
Gruppe II: TeT in unterschiedlicher Gesamtdosierung
Ratte 8: 313 ng TeT
Ratte 9: 563.4 ng TeT
Ratte 11: 125.2 ng TeT
Ratte A: 125.2 ng TeT
Ratte B: 125.2 ng TeT
Gruppe III: Kobaltdraht 1 mm tief
Abb. 3-27: Histologische Darstellung Gruppe II + III 2.52 mm vor dem Bregma.
Gruppe II: Unterschiedlich große Läsionen, ohne Korrelation mit der verabreichten TeTDosis. Der schwarze Pfeil bei Ratte 11 kennzeichnet eine kleine Läsion durch den
Elektrodenverlauf. Bei Ratte B wurde zu tief gefräst.
Gruppe III: Große Läsion, auch kontralateral.
Ergebnisse
73
Alle Läsionen von Gruppe I + II betreffen nur die ipsilaterale Hemisphäre, die kontralaterale
Seite ist unversehrt (bei Tier 4 und 5 fixierungsbedingte schlechtes Darstellen der
kontralateralen Seite). Bei Tier 13, Gruppe III, ist auch die kontralaterale Seite betroffen.
Histologische Schnitte der größten, abgrenzbaren Läsion jeder Ratte
Gruppe I: 187.8 ng TeT + 7.5 mg CoCl2
Ratte 4
Ratte 5
Ratte 6
Ratte 7
Abb. 3-28: Histologische Schnitte Gruppe I auf der Höhe der größten Läsion
Auch bei Messung der größten Läsion verhältnismäßig große Läsion bei Tier 4 und 5 im
Vergleich zu Tier 6 und 7
Ebenfalls auch auf diesen Schnitten gut zu erkennen die ausgeprägte Nekrosezone bei Tier 4;
das aufgelockerte, geschädigte Gewebe bei Tier 5; kleinere Läsionen bei Tier 6 und 7.
Ergebnisse
74
Gruppe II: TeT in unterschiedlicher Dosierung
Ratte 8: 313 ng TeT
Ratte 11: 125.2 ng TeT
Ratte B: 125.2 ng TeT
Ratte 9: 563.4 ng TeT
Ratte A: 125.2 ng TeT
Gruppe III: Kobaltdraht 1 mm tief
Abb. 3-29: Histologische Darstellung Gruppe II + III auf Höhe der größten Läsion
Gruppe II: Unterschiedlich große Läsionen, ohne Korrelation mit der verabreichten TeTDosis. Bei Ratte B wurde zu tief gefräst. Der rote Pfeil bei Ratte A, weist auf eine minimale
Läsion der kontralateralen Seite hin.
Gruppe III: Große Läsion, teilweise auch kontralateral.
Auch auf Höhe der größten Läsionen von Gruppe I + II ist nur die ipsilaterale Hemisphäre
betroffen, die kontralaterale Seite ist unversehrt (bei Tier 4 fixierungsbedingte schlechtes
Darstellen der kontralateralen Seite). Bei Tier 13, Gruppe III, ist ebenfalls die kontralaterale
Seite mit betroffen.
Ergebnisse
75
3.2.1 Statistische Auswertung der Ausmessungen der Läsion
Die folgenden Grafiken zeigen die statistischen Auswertungen der Messungen der Läsionen
der histologischen Schnitte: Vergleich der Fläche (a), der Breite (b) und der Höhe (c) der
Läsion von Gruppe I TeT/CoCl2 versus Gruppe II TeT (ohne Ratte B).
1. Vergleich der Schnitte auf einer Höhe, 2.52 mm vor dem Bregma
2. Vergleich der Läsion an der Stelle, an der sich die größte messbare Läsion der jeweiligen
Ratte zeigte.
1. Läsion ca. 2.52 mm vor dem Bregma
a)
n=4
2. Größte messbare Läsion
a)
n=4
n=4
b)
Breite in mm
Breite in mm
b)
n=4
n=4
n=4
n=4
Höhe in mm
c)
Höhe in mm
c)
n=4
n=4
n=4
n=4
Abb. 3-30: Statistische Auswertung der histologischen Messungen
n=4
Ergebnisse
76
Beim Vergleich der drei Messungen auf den je zwei verschiedenen Schnitten ergaben sich
keine signifikanten Unterschiede, was auch die sich jeweils deutlich überlappenden
Konfidenzintervalle zeigen. In der Gruppe I, TeT/CoCl2, zeigten sich große Differenzen
zwischen den Tieren. Tier 4 und 5, die früh verstarben und zudem nicht perfundiert werden
konnten, präsentierten große Läsionen, während Tier 6 und 7 viel kleinere Läsionen
aufzeigten. Auch die Tiere der Gruppe II zeigten relativ große interindividuelle Differenzen.
Die verhältnismäßig große Läsion bei Ratte 11 kann durch die lokale VPA-Injektion mit
bedingt sein. Ratte B wurde von den Berechnungen ausgeschlossen, da intraoperativ zu tief
gefräst wurde. Insgesamt war eine Tendenz zu kleineren Läsionen der Gruppe II im Vergleich
zu Gruppe I sichtbar, jedoch ohne dass der Unterschied signifikant wurde.
Ergebnisse
77
3.3 Ergebnisse der automatischen Anfallsdetektion - Vergleich der visuellen
mit der automatischen Elektrokortikogramm-Auswertung
Anfälle mit Spike-Wave-Muster stellten sich mit dem Anfallsdetektionsprogramm als
Integrierte Power im 15 min-Fenster wie in folgender Abb. 3-31 dar. Mit einem Blick sind
sechs gut erkennbare Anfälle zu erfassen und durch Betätigung des „Go2EEG“-Button kann
man sich versichern, dass es sich um einen Anfall handelt. Durch den Blick auf nur eines
anstatt von 90 Bildern kann viel Zeit bei der Auswertung gespart werden. In der visuellen
Auswertung werden jeweils 10 Sekundenblöcke betrachtet, während bei der automatischen
Auswertung durch Darstellung der spektralen Leistungsdichte in 15 Minutenblöcken
gescreent werden kann und somit eine kompaktere Darstellung Hilfe leistet. Die
Beschleunigung der Auswertung im 15 min-Fenster trifft besonders dann zu, wenn keine
Anfälle aufzufinden sind und das ECoG insofern nicht eingesehen werden muss.
Abb. 3-31: Integrierte Power im 15 min-Fenster mit Spike-Wave-Anfällen
Dargestellt ist ein Ausschnitt der Integrierten Power von Tier 7 im 15 min-Fenster an Tag
1 post OP und zeigt sechs Anfälle, die durch schwarze Pfeile markiert sind. Beispielhafte
Darstellung eines Ausschnittes des zum 3. Peak gehörigen ECoG.
Die mit der Integrierten Power dargestellten ECoG-Dateien zeigten also gut erkennbare
Anfälle mit Spike-Wave-Muster und erleichtern die Auswertung der massenhaft anfallenden
ECoG-Dateien bei 24h-Ableitungen.
Anders sieht es bei der Auswertung von ECoG-Dateien aus, die Anfälle mit BSM
enthalten. Diese Anfälle sind ebenfalls gut in der automatischen Auswertung erkennbar (siehe
Abb. 3-32), jedoch in der Integrierten Power-Darstellung alleine nicht von ETPs mit
Myokloni (siehe Abb. 3-33) zu unterschieden, sondern nur durch Einsicht des ECoGs selbst.
Insgesamt ist die Erfassung aller ETPs jedoch nicht besonders sensitiv und nur ETPs mit
Ergebnisse
78
besonders großer Amplitudendifferenz zur Hintergrundaktivität werden erfasst. Um Anfälle
mit BSM schnell zu erfassen, welche bei Gruppe II auftraten, hilft das Programm somit nicht
weiter, da die Auswertung durch die zahlreichen ETPs erschwert und insgesamt nicht
beschleunigt wird.
REF
BIPOLAR
Abb. 3-32: Integrierte Power im 15 min Fenster mit BSM-Anfällen
Integrierte Power von Ratte 10 mit Detektion von drei Anfällen mit BSM (schwarze Pfeile)
Tag 3 post OP, sowie Darstellung des ECoG des 3.Peaks in der REF und bipolaren
Ansicht
Abb. 3-33: Integrierte Power im 15 min Fenster mit ETPs
Integrierte Power von Ratte 12, wobei die mit Pfeilen markierten Peaks ETPs mit Myokloni
repräsentieren. Von dem ersten Peak ist beispielhaft das ECoG in der bipolaren Ansicht
dargestellt.
Ergebnisse
79
3.3.1 Sensitivität der automatischen Anfallsdetektion
Die Sensitivität der Anfallserkennung mit dem halbautomatisierten Detektionsprogramm lag
bei allen vier so analysierten Tieren für Anfälle mit Spike-Wave-Muster über 90 % (94.397.7 %), während sie für ETPs mit Myokloni, eingeschlossen der Anfälle mit BSM, nur
zwischen 51.7 % und 73.7 % lag. Die Sensitivitäten sind im Folgenden für jede Ratte in
Sensitivität in %
Balkendiagrammen dargestellt.
Ratte 6
Ratte 7
Ratte 8
Ratte 10
Sensitivität in %
Abb. 3-34: Sensitivität der halbautomatisierten Anfallsdetektion für
Anfälle mit Spike-Wave-Mustern hinsichtlich der visuellen Detektion,
die als 100 % angenommen wurde.
Ratte 12
Ratte 10
Ratte 11
Abb. 3-35: Sensitivität der halbautomatisierten Anfallsdetektion für
Anfälle mit BSM + ETP im Vergleich hinsichtlich der visuellen
Detektion, die als 100 % angenommen wurde.
Ergebnisse
80
3.4 Ergebnisse der lokalen subduralen intraoperativen ValproatApplikation
Die quantitativen Ergebnisse der Patientendaten stammen von zwei unabhängigen,
verblindeten Auswertungen durch J.H. und mich (S.V.).
3.4.1 Ergebnisse Patient Nr. 1
Das folgende Balkendiagramm (Abb. 3-36) zeigt die Mittelwerte der Anzahl der SUPs/min
für die 20 min-Blöcke vor und nach NaCl-Gabe sowie nach VPA-Therapie des ersten
Patienten. Bei beiden unabhängigen Auswertungen zeigte sich nach NaCl- und nach VPATherapie keine signifikante Zu- oder Abnahme der Anzahl der SUPs/min. Bei S.V. zeigte sich
erst eine Zunahme nach NaCl und schließlich eine Abnahme der SUPs/min nach VPA.
Während sich bei J.H. eine geringe Zunahme der SUPs/min mit der Zeit, sowohl nach NaCl,
Anzahl der SUPs/min
als auch nach VPA zeigte.
CI95
Abb. 3-36: Statistische Auswertung der Anzahl der SUPs/min des Patienten Nr.1
Die schwarzen Balken entsprechen den Mittelwerten der Anzahl der SUPs/min
der Baseline-Ableitungen der ersten 20 min.
Die roten Balken entsprechen den Mittelwerten der Anzahl der SUPs/min nach
20 min Auflage eines NaCl-befüllten Neurotupfer.
Die blauen Balken ensprechen den Mittelwerten der Anzahl der SUPs/min
nach 20minütiger Auflage eines VPA-befüllten Neurotupfer.
Die jeweiligen Mittelwerte sind mit den zugehörigen 95 % Konfidenzintervall
angegeben.
Ergebnisse
81
Zwar zeigten sich bei Patient Nr. 1 keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl epileptischer Entladungen, dafür konnten wir hoch signifikante Unterschiede (p < 0,0001) nach
lokaler VPA-Therapie im Hinblick der Dauer der SUPs erzielen. Das anschließende
Balkendiagramm (Abb. 3-37) zeigt die Mittelwerte der Dauer der SUPs [s] für die 20 minBlöcke vor, nach NaCl-Gabe und nach VPA-Therapie des ersten Patienten. Bei beiden
verblindeten, unabhängigen Auswertungen zeigte sich eine hoch signifikante Zunahme der
durchschnittlichen Dauer der SUP nach lokaler VPA-Therapie sowohl im Vergleich zur
Baseline-Ableitung, als auch im Vergleich nach NaCl-Kontrolle. Nach alleiniger 0.9 % NaClAuflage zu Baseline-Ableitung zeigte sich hingegen kein signifikanter Unterschied im
Vergleich. Insgesamt war die Dauer der SUPs bei mir (S.V.) konstant etwas höher als bei J.H.
im Rahmen eines Ermessensspielraumes der Messungen. Insgesamt war der Unterschied nach
VPA jedoch identisch: Anstieg der Dauer um ca. 0.3 s.
***
***
Ø Dauer der SUPs [s]
***
***
CI95
Abb. 3-37: Statistische Auswertung der Dauer der SUPs [s] des Patienten Nr.1
Die schwarzen Balken entsprechen den Mittelwerten der Dauer der SUPs [s]
der Baseline-Ableitungen der ersten 20 min.
Die roten Balken entsprechen dem Mittelwerten der Dauer der SUPs [s] nach
20 min Auflage eines NaCl-befüllten Neurotupfer.
Die blauen Balken ensprechen dem Mittelwerten der Dauer der SUPs [s] nach
20 min Auflage eines VPA-befüllten Neurotupfer.
Die jeweiligen Mittelwerte sind mit den zugehörigen 95 % Konfidenzintervall
dargestellt.
Ergebnisse
82
3.4.2 Ergebnisse Patient Nr. 2
Das folgende Balkendiagramm (Abb. 3-38) zeigt die Mittelwerte der ETPs/min für die
20 min-Blöcke vor, nach NaCl-Gabe und nach VPA-Therapie des zweiten Patienten. Nach
VPA-Therapie ist bei beiden unabhängigen Auswertungen bemerkenswerterweise eine hoch
signifikante Abnahme (p < 0,0001) der ETPs/min im Vergleich zur Baseline zu beobachten.
Genauso zeigt sich eine signifikante Abnahme (p < 0,05) im Vergleich nach NaClApplikation. Der Mittelwert nach NaCl-Applikation im Vergleich zur Baseline ist
interessanterweise ebenfalls sehr signifikant niedriger (p < 0,01).
***
***
**
**
Anzahl der ETPs/min
CI95
*
*
Abb. 3-38: Statistische Auswertung der ETPs/min des 2.Patienten
Ergebnisse von zwei unabhängigen Auswertern, S.V. und J.H.
Die schwarzen Balken entsprechen den Mittelwerten der ETPs/min der
Baseline-Ableitungen der ersten 20 min.
Die roten Balken entsprechen den Mittelwerten der ETPs/min nach 20 min
Auflage eines NaCl-befüllten Neurotupfer.
Die blauen Balken ensprechen den Mittelwerten der ETPs/min nach
20minütiger Auflage eines VPA-befüllten Neurotupfer.
Die jeweiligen Mittelwerte sind mit den zugehörigen 95 % Konfidenzintervall
dargestellt.
Ergebnisse
83
Die folgende Grafik (Abb. 3-39) zeigt die Ergebnisse des 2. Patienten der beiden
unabhängigen, verblindeten Auszählungen der ETPs/min, sowie die Mittelwerte der beiden
Zählungen. Die ersten 20 min entsprechen der Baselineableitung (schwarz); der zweite
Abschnitt (rot) stellt die 20-minütige Ableitung nach NaCl-Applikation dar, während die
letzten 20 min die Ableitung nach lokaler VPA-Therapie (blau) präsentieren.
Es ist eine leichte Abnahme der Anzahl der Spikes im zeitlichen Verlauf zu erkennen.
Nach 20 minütiger lokaler VPA-Einwirkzeit ist ganz deutlich zu erkennen, dass nach
Anfluten des VPAs die Anzahl der Spikes auf null sank und danach mit der Zeit langsam
wieder zunahm.
120
Auswertung S.V.
Auswertung J.H.
100
Auswertung gemittelt
Anzahl der ETPs/min
80
60
40
20
0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
21 23 25 27 29 31 33 35 37 39
Minuten
41 43 45 47 49 51 53 55 57 59
Abb. 3-39: Entwicklung der intraoperativen epileptischen Aktivität – Patient 2
Diskussion
84
4. Diskussion
Um die Entwicklung neuer Therapiemethoden, speziell der lokalen medikamentösen
Therapie, für fokale neokortikale Epilepsien prüfen und etablieren zu können, wird ein
geeignetes Tiermodell gebraucht. Dieses sollte einen chronischen epileptogenen Fokus
aufweisen, der repetitive, spontane Anfällen erzeugt, damit das Modell repräsentativ ist und
eine Übertragung der Ergebnisse auf den Menschen erlaubt.
4.1 Tiermodell
Es gibt eine große Anzahl unterschiedlicher Tiermodelle für die verschiedenen Typen der
Epilepsien [86]. Für fokale, neokortikale Epilepsien sind Modelle mit Kobalt- [19, 25-27, 35,
45, 48], TeT- [17, 89, 105, 106], Eisenchlorid- [98, 143], Acetylcholin- [90] und Bicucullin[40] Induktion beschrieben. Die meisten dieser Modelle zeigen jedoch akute provozierte oder
akute und subakute spontane fokale Anfälle. Um ein repräsentatives Modell für neokortikale
Epilepsien beim Menschen darzustellen, sollte ein solches jedoch chronische Anfälle zeigen.
Ein von Nilsen et al. (2005) [106] als chronisch beschriebenes Modell konnte von unserer
Arbeitsgruppe in den Vorversuchen mit TeT nicht reproduziert werden. Trotz starker
Erhöhung der TeT-Dosis und des Nachweises in parallelen in vitro-Versuchen, dass das TeT
aktiv war und wirkte [71], waren keine stabilen repetitiven Anfälle aufzufinden. Deshalb
wurden die beiden epileptogenen Substanzen TeT und CoCl2 kombiniert und zusätzlich die
Ableitebedingungen verbessert, worunter sich spontane repetitive Anfälle in 6 von 8 Tieren
bei 3 x 75 ng TeT + 15 mg CoCl2 zeigten [4], jedoch mit einer hohen Mortalität von nicht
therapierten Tieren.
Die in der vorliegenden Arbeit beschriebene Weiterentwicklung eines fokalen
neokortikalen Epilepsiemodells an Ratten mit Induktion des epileptischen Fokus durch
TeT/CoCl2 in und auf den primären Motorkortex zeigte, dass bei Dosisreduktion beider
Toxine auf 3 x 62.6 ng TeT + 7.5 mg CoCl2, noch weiter verbesserter Anfallsdetektion mit
einer
höheren
Anzahl
von
Tiefenelektroden
sowie
24h-Video-ECoG-Ableitungen,
überlebende Ratten mit repetitiven spontan auftretenden Anfällen präsentiert werden können.
Alle vier Tiere der Gruppe I zeigten Anfälle. Diese hielten bis maximal Tag 12 post OP an,
wie es in Altenmüller et al. (2013) [4] beschrieben ist.
Der Rückgang von Kobalt-induzierten Anfällen gegen Ende der zweiten bis dritten Woche
bei Anfallsinduktion durch einen Kobaltdraht ist von verschieden Arbeitsgruppen [19, 25, 27]
bekannt. Auch Dow et al. (1962) [35] beschrieben nach Applikation von Kobalt-Pulver einen
Diskussion
85
Rückgang der epileptischen Aktivität innerhalb von 4-6 Wochen, während Fischer et al.
(1967) [48] nach epileptischer Induktion mit einem Kobalt-Gelatine-Stab die epileptische
Aktivität einfach nur bis Tag 21 verfolgten. Der pathophysiologische Grund für das
Abklingen der Anfälle ist bisher genauso wenig geklärt, wie der prokonvulsive Mechanismus,
der die Epilepsien auslöst. Esclapez & Trottier (1989) [45] fanden heraus, dass es nach
Kobaltapplikation auf den Motorkortex zur Abnahme der Zelldichte von GABAergen
Neuronen kam, die sich bei Rückgang der epileptischen Aktivität wieder regenerierten.
Während Gerber & Gahwiler (1991) [52] unspezifische Wirkungen von Kobalt auf Glutamat-,
GABA-, Adenosin- und Acetylcholin-Rezeptoren zeigten, beschrieben He et al. (2009) [64],
dass möglicherweise eine von der Aktivität abhängige Erleichterung der Gap-JunctionKommunikation eine wichtige Rolle spielt.
Die fehlende Chronizität bei Kobalt-induzierten fokalen neokortikalen Epilepsiemodellen
ist jedenfalls ein klarer Nachteil, da es somit kein geeignetes Modell für die definitionsgemäß
chronischen fokalen neokortikalen Epilepsien beim Menschen darstellt und Aussagen über
den langfristigen Verlauf von Epilepsien, sowie deren Therapien nicht erlaubt.
Da sich unter Dosisreduktion des kombinierten TeT/CoCl2-Modells zwar überlebende
Ratten mit subakuten Anfällen ergaben, jedoch keine Verbesserung der Chronizität des Fokus
erreicht wurde, beschlossen wir, erneut eine Induktion des epileptischen Fokus allein durch
TeT zu versuchen. Der Unterschied dieses Mal war die Induktion des epileptischen Fokus
gemäß dem Prinzip des chemischen Kindling durch Nachinjektion geringer Mengen TeT mit
der Neueinführung eines implantierten Schlauches direkt über dem Fokus sowie die
Durchführung mit verbesserten Ableitebedingungen im Vergleich zu den Vorversuchen. Alle
fünf TeT-Tiere der Versuchsgruppe II zeigten Anfälle. Ratte Nr. 12 zeigte bei minimaler
Dosisgabe von 62.6 ng und Nachinjektion fünf Tage später mit derselben Dosis einen relativ
konstanten epileptischen Fokus für mindestens 25 Tage, der am Tag 10 begann und
mindestens bis Tag 35 post OP vorhanden war. Vermutlich war der Fokus sogar noch länger
aktiv. Da die Auswertung der Daten jedoch zeitversetzt erfolgen musste, wurden die
Elektroden für die Ableitung nach deren akzidentellem Abriss erst viel später reimplantiert,
weshalb keine Aufzeichnungen zwischen Tag 36 und 57 erfolgten. Nach der späten
Reimplantation konnte allerdings keine epileptische Aktivität mehr festgestellt werden.
Um die Ergebnisse des Tieres Nr. 12 zu bestätigen und weiter zu entwickeln, müssen
Versuche mit der gleichen Dosis und kontinuierlicher Ableitung durchgeführt werden, sowie
sofortiger Elektrodenreplantation bei Verlust der „Ableitungs-Krone“. Mittels des TeTModells mit chemischen Kindling mit niedriger, mehrfach verabreichter Dosis von 62.6 ng
Diskussion
86
TeT präsentierten wir letztendlich ein gutes Modell für fokale, neokortikale Epilepsie zur
Entwicklung neuer Therapieoptionen.
Im Gegensatz zu Nilsen et al. (2005) [106] konnten weder in dieser Arbeit, noch in den
Vorversuchen nach einmaliger Injektion von TeT die beschriebenen „persistierenden häufigen
und milden Anfälle mit Myokloni des Gesichtes“ erzeugt werden. Klinisch zeigten sich bei
uns zwar ebenfalls Kopfkloni, meist jedoch zusätzlich mit eindeutigen Myokloni der
kontralateralen vorderen Extremität, mit teilweiser sekundärer Generalisation. Die
elektrophysiologischen Bilder der Anfälle dieser Arbeit bei höherer, mehrfacher Toxindosis
zeigten dafür im Gegensatz zu den veröffentlichten Anfällen von Nilsen et al. (2005) [106]
klar abgrenzbare, rhythmische Anfälle mit eindeutigen Spike-Wave-Mustern (Tier 8 und 10)
sowie vor allem Anfälle mit BSM (Tiere 9-12) mit eindeutiger Amplituden- und Frequenzdifferenz zur Hintergrundaktivität (Siehe Abb. 4-1). Auch im Modell von Mainardi et al.
(2012) [94] (TeT-Injektion in den visuellen Kortex der Maus) lässt sich − wie bei Nilsen et al.
(2005) [106] − die präsentierte iktale und interiktale Aktivität nicht von Artefakten
unterscheiden. Es sind keine eindeutigen Anfallsmuster oder ETPs erkennbar. Passend dazu
beschrieb Mainardi et al. (2012) [94], dass kein klinisches Korrelat der epileptischen Aktivität
gefunden werden konnte.
Diskussion
87
a)
b)
c)
d)
500 µV
500 µV
1s
2s
1s
Abb. 4-1: Epileptische EEG-Muster im Vergleich
a) Nilsen et al. (2005) – Klinisch: motorischer Anfall
b) Mainardi et al. (2012) – Iktale und interiktale EEG-Muster am Tag 10
c) Fokaler Anfall (Ratte Nr. 8) mit klar abgrenzbarem Beginn und Ende sowie
charakteristischen Spike-Wave-Komplexen in der 10 s-Ansicht (Einfügung)
d) Anfall mit BSM (Ratte Nr. 10) mit eindeutigem Amplitudenunterschied und
motorischem Korrelat
Brener et al. (1991) [15] beschrieben einen über sieben Monate persistierenden chronischen
epileptischen Fokus, ausgelöst durch TeT. Allerdings berichteten sie nur über beobachtete,
nicht jedoch elektrophysiologisch bestätigte Anfälle. In ihren EEG-Aufnahmen konnten diese
Autoren nur interiktale epileptischen Spikes zeigen, die nicht von klinischen Symptomen
begleitet und maximal für 3 Monate abgeleitet wurden. Das bedeutet zusammenfassend, dass
sie in ihren in vivo Experimenten nur interiktale epileptische Spikes bis zu drei Monaten
präsentieren konnten und sich die Persistenz epileptischer Aktivität über 7 Monate auf in vitro
Experimente beschränkt.
Auch Wykes et al. (2013) [144] reproduzierten das von Nilsen et al. (2005) veröffentlichte
Modell. Sie injizierten nur 10 bis 35 ng TeT und beobachteten innerhalb 72 h Bursts von
hochfrequenter EEG-Aktivität von denen manche mit fokalen und sekundär generalisierten
Anfällen assoziiert waren.
TeT wurde an Ratten auch schon zur Induktion von Temporallappenanfällen durch
Injektionen in den Hippocampus verwendet; diese Ratten präsentierten ebenfalls
intermittierende Anfälle [7, 63, 68, 97, 120]. Alle diese Autoren beschrieben, dass auch nach
Diskussion
88
hippocampaler Injektion die motorischen Anfälle nicht von Dauer waren. Teilweise dauerte
die elektrophysiologische epileptische Aktivität jedoch länger an [7, 63].
Vor Nutzung von TeT für die Induktion hippocampaler Epilepsien wurde es für die
Injektion in den Neokortex verwendet. Carrea und Lanari beschrieben bereits 1962 [17] die
Induktion eines neokortikalen epileptischen Fokus mittels TeT in Hunden und Louis et al.
1990 [89] dann in Katzen. Bei Louis et al. (1990) [89] zeigte sich an fünf Tieren ein sehr
unterschiedlicher Anfallsbeginn nach verschiedenen Toxindosen und ein Persistieren der
Anfälle für nur 7 bis 37 Tage. Eine isolierte Epileptogenese ohne eventuell beeinflussende
Therapie wurde hier jedoch nur zwischen Tag 1 und 10 beobachtet. Zur epileptogenen
Induktion wurde, wie in unserem Modell, mehrfach TeT injiziert und somit wahrscheinlich
ein chemisches Kindling durchgeführt. Damals wurde zur Nachinjektion jedoch direkt eine
Kanüle implantiert und nicht wie bei uns, ein Schlauch zum Platzieren einer Injektionskanüle.
Der Vorteil eines Schlauches ist zum einen, dass das Material weicher ist und somit die
Gehirnoberfläche weniger irritiert und zum anderen, dass dieser mit einem Mandrin
verschlossen werden kann. Aufgrund des verwendeten Mandrins konnte der Schlauch
zusätzlich mit Zahnzement abgedichtet werden, ohne dass dieser in den Schlauch eindrang.
Durch kompletten Verschluss des Systems wurde das Risiko der Infektionsgefahr minimiert.
Keines unserer Tiere entwickelte, im Gegensatz zu den Tieren von Louis et al. (1990) [89],
eine Meningitis oder eine andere Infektion und das ohne Verwendung einer Antibiose. Diese
wurde von uns vermieden, da eine Antibiose die Epileptogenese beeinflussen kann. Für
Penicilline, wie sie von Louis et al. (1990) [89] verwendet wurden, ist nachgewiesen, dass sie
über Hemmung der GABA-Transmission epileptogen wirken [11]. Einige Arbeitsgruppen
verwenden sogar Penicilline um ein Epilepsiemodell zu erzeugen [2, 3].
Nilsen et al. (2006) [105] beschrieben die Verwendung eine Injektionskanüle ohne
Mandrin zur therapeutischen Medikamentenverabreichung, nicht jedoch zum chemischen
Kindling. Auch bei ihnen traten Komplikationen wie Infektionen und Verstopfung der Kanüle
auf, die durch einen Mandrin eventuell hätten verhindert werden können.
Die Einführung eines verschließbaren Systems mittels Schlauch und Mandrin kann somit
als ein geeignetes Vorgehen für ein chemisches Kindling angesehen werden.
Ein Tiermodell an Ratten, anstatt an Katzen, Hunden oder anderen größeren Tieren, hat
sich für die Evaluation neuer Therapiemethoden als wirtschaftlicher erwiesen, da ihre Haltung
platz- und zeitsparender sowie kostengünstiger und das Handling einfacher ist.
In unserem Modell konnten insgesamt vier verschiedene Anfallstypen beobachtet werden:
Einfache fokal motorische Anfälle, fokal motorische Anfälle mit sekundärer Generalisation,
Diskussion
89
EPC, sowie motorische Anfälle vom BSM. Die ersten drei Anfallstypen wurden auch bei
Louis et al. (1990) [89] im TeT-Modell an Katzen beschrieben.
Klinisch äußerten sich die Anfälle mit Fokus im Motorkortex durch Myokloni der
kontralateralen Vorderpfoten und des Kopfes sowie die Anfälle mit Fokus im Parietalkortex
durch Myokloni der kontralateralen Hinterpfoten. Dies wurde auch von Dow et al. (1972)
[34] so beschrieben, obwohl die Literatur nicht eindeutig die motorische Region für die
hintere Extremität in den Parietalkortex lokalisiert.
Um das Tiermodell der fokalen neokortikalen chronischen Epilepsie zukünftig noch
kliniknäher zu gestalten, ist ein chemisches Kindling mit Eisenchlorid als epileptogene
Substanz anzustreben [98]. Begründet ist dies damit, dass bei Patienten nach Hirnblutungen
häufiger epileptische Anfälle auftreten [145].
4.1.1 Tetanus Toxin-Effekt
Wie bereits in der Einleitung beschrieben wird angenommen, dass TeT durch verstärkte
Hemmung der inhibitorischen Transmitterfreisetzung im Vergleich zur exzitatorischen, zu
epileptischer Aktivität führt [10, 70, 71, 142]. TeT ist eine Zink-Endopetidase, die
Neurotransmitterfreisetzungen durch proteolytische Spaltung von Synaptobrevin, einem
Protein des SNARE-Komplexes, blockiert [65, 125]. Die in vitro genannte Halbwertszeit liegt
je nach Literatur zwischen 3 und 6 Tagen [44, 57]. Empson et al. (1993) [43] beschrieb
passend dazu eine Blockade der GABAergen Freisetzung nur in den ersten Tagen nach TeT
Injektion. Das Hervorrufen zahlreicher spontan aufgetretener Anfälle über einen deutlich
längeren Zeitraum, als die von Empson et al. (1993) [43] beschriebene Blockade der
GABAergen Freisetzung, spricht gegen die Annahme, dass die Anfälle direkt durch das
verabreichte Toxin verursacht wurden. Stattdessen ist es wahrscheinlicher, dass die
repetitiven Anfälle durch Toxin-induzierte sekundär epileptogene Prozesse entstanden. Eine
langfristige Änderung der neuronalen Erregbarkeit oder der Zytoarchitektur, welche länger als
die unmittelbare Toxinwirkung andauert, beschrieben auch Hagemann et al. (1999) [59] und
Vreugdenhil et al. (2002) [136]. Kommt es bis zur Regeneration der GABA-Transmission
nicht zur Epileptogenese, verschwinden die Anfälle nach wenigen Tagen wieder oder es treten
erst gar keine auf, wie z.B. anfangs bei Tier Nr.8, 9, und 12. Der Rückgang TeT-induzierter
Anfälle nach ungefähr 1-2 Monaten wird möglicherweise durch die Ausbildung
antiepileptischer Mechanismen hervorgerufen [136]. Deshalb ist chemisches Kindling durch
mehrfache Nachinjektion kleiner TeT-Dosen bei Ausbleiben der Anfälle oder deren
Rückgang sinnvoll, um die Epileptogenese zu induzieren und proepileptische Veränderungen
zu fördern.
Diskussion
90
Zusätzlich sind noch weitere die Epileptogenese beeinflussende Effekte durch TeTInjektionen in den Neokortex beschrieben, wie beispielsweise die reziproke Hoch- und
Herunterregulation des Wachstumsfaktors BDNF [83, 84].
Wenn man die Ergebnisse dieser Dissertation allerdings auf die Arbeit von Mainardi et al.
(2012) [94] bezieht, ist auch eine direkt toxininduzierte Entstehung von Anfällen möglich.
Mainardi et al. (2012) [94] beobachteten die stärkste Synaptobrevinspaltung nach zehn Tagen
und zeigten, dass diese bis mindestens Tag 35 anhielt.
4.1.2 Mortalität im Tiermodell
Eine hohe Mortalität, wie sie für die nicht therapierten Tiere mit hoher Toxindosis der
Altenmüller et al.-Publikation (2013) [4], der Rassner et al.-Publikation (2014) [121] sowie
für zwei von den vier Tieren der Versuchsgruppe I dieser Dissertation zutrifft, ist auch von
anderen Tiermodellen bekannt. Brener et al. (1991) [15] beschrieben für die TeT-Induktion
eine dosisabhängige Mortalität bis zu 36 %. Auch Liang et al. (1998) [84] berichtete nach
epileptischer Induktion mit TeT und Tamargo et al. (2002) [132] nach CoCl2-Induktion eine
hohe Todesrate infolge generalisierter Anfälle bzw. einem Status epilepticus innerhalb der
ersten zwei Wochen.
Durch Dosisreduktion der kombinierten Behandlung mit TeT/CoCl2 konnten in dieser
Arbeit zwei überlebende Tiere bis zur Tötung präsentiert werden. Tier Nr. 5 unterlag
operativen und anästhetischen Problemen am ersten Tag post OP, wodurch sich unter
Ausschluss von Tier Nr.5 eine Mortalität von 33.3 % für Gruppe I innerhalb der ersten zwei
Wochen ergibt. Drei Tiere der Versuchsgruppe II mussten aufgrund zu starker Anfälle in der
zweiten Woche geopfert werden. Dies ist auch in Liang et al. (1998) [84] beschrieben, und
nur Tier Nr. 12 zeigte bei minimaler Toxindosis ein dauerhaftes Überleben.
Insgesamt ist eine hohe Mortalität aufgrund von epileptischen Anfällen in neokortikalen
Epilepsiemodellen durch TeT oder CoCl2 bislang leider die Regel.
4.1.3 Kobaltdraht-Modell
Das Kobaltdraht-Modell der Versuchsgruppe III, die aus nur einem einzelnen Tier bestand,
lieferte kein zufriedenstellendes Ergebnis. Man muss jedoch festhalten, dass die Anzahl n = 1
nur eine geringe Aussagekraft besitzt und dieser Versuchstiergruppe weitere Tiere hinzu
gefügt werden müssten, um Ergebnisse bewerten zu können. Weshalb das Tier Nr. 13 nur
subklinische Anfälle und nicht wie die in Chang et al. (2004) [19] und Colasanti et al. (1974)
[25] beschriebenen klinischen Anfälle zeigte, ist unklar und muss durch weitere Versuche
evaluiert werden. Eine mögliche Erklärung ist, dass kein gesamtes Kobaltdrahtsstück wie bei
Diskussion
91
den genannten Autoren implantiert wurde, sondern ein längerer Draht um 1 mm
vorgeschoben wurde und somit die Kontaktfläche des Drahtes kleiner war.
4.1.4 Kontrolltiere
Mit den beiden Kontrolltiere untersuchten wir die Auswirkung des Operationstraumas auf die
Epileptogenese. Die Ergebnisse von Tier A legen dar, dass epileptische Anfälle mit SpikeWave-Mustern in den ersten Tagen nach der OP nicht unbedingt toxininduziert sein müssen,
sondern auch durch das Operationstrauma bedingt sein können. Wenn das Auftreten der
länger anhaltenden Spike-Wave-Anfälle aller Ratten insgesamt betrachtet wird, wie in der
folgenden Grafik (Abb. 4.2) dargestellt, fällt auf, dass sich ein Großteil dieser Art von
Anfällen in den ersten Tagen post OP abspielte. Die Tiere von Gruppe I zeigten hier die
höchste Anfallsfrequenz; möglicherweise durch die Kombination von Operationstrauma +
TeT + CoCl2.
12
R4
10
R5
R6
Anfälle/h
8
R7
6
R8
R10
4
R11
RA
2
RB
0
0
1
2
3
4
5
6
7 8 9
Tag post OP
10 11 12 13 14 15
Abb. 4-2: Anfallsentwicklung der Spike-Wave-Anfälle aller Versuchstiere
Es ist die Entwicklung der Spike-Wave-Anfälle aller Versuchstiere dargestellt,
welche diesen Anfallstyp präsentierten. Anfälle mit BSM sind nicht mit
einbezogen.
Auch Tamargo et al. (2002) [132] beschrieben, dass nach Elektrodenimplantation einige
Ratten aufgrund von epileptischer Aktivität nach alleiniger Elektrodenimplantation vor
Kobaltinduktion von den Versuchen ausgeschlossen werden mussten.
Einige Arbeitsgruppen führten sogar ein spezielles „Operationstrauma“ durch, um
Epilepsie zu induzieren und entwickelten so Modelle für post-traumatische Epilepsien [28,
29, 30, 101]. Epileptische Anfälle nach Operationstraumata sind also nicht ungewöhnlich.
Diskussion
92
Zu beachten ist, dass die Anfälle des Kontrolltieres A elektrophysiologisch und klinisch
nicht vom rechten Motorkortex ausgingen, sondern vom linken Motorkortex und dem rechten
Parietalkortex. Tier 6, 7 und 10 zeigten ebenfalls Anfälle mit Fokuslokalisation in der MCLund der PCR-Elektrode. Anlässlich der Anfälle des Kontrolltieres müssen wir eventuell davon
ausgehen, dass Anfälle mit Fokus außerhalb des rechten Motorkortex möglicherweise durch
ein Operationstrauma bedingt sind. Denkbar ist, dass diese durch die Halteschrauben, die
Elektroden selbst oder kleine Blutungen verursacht wurden. Ein Hinweis dafür, dass die
Anfälle operationsbedingt ausgelöst sein konnten, liefert der histologische Schnitt von
Ratte A auf Höhe der größten Läsion (Abb. 3-29). Mit Rot markiert ist eine minimale Läsion
der kontralateralen Seite, die durch einen der oben beschriebenen Mechanismen entstanden
sein kann und möglicherweise zu den Anfällen mit Fokus in der MCL führten.
Eine mögliche alternative Erklärung ist, dass durch eine ausgeprägte neokortikale Nekrose
im rechten Motorkortex um die Elektroden herum keine neuronale Erregung entstehen konnte
und die am Rande der Läsion aufgekommene epileptische Aktivität erst auf der kontralateralen Seite in der MCL und posterior in der PCR topographisch registriert wurde. Mit der
im Vergleich zu den Vorarbeiten zusätzlichen, am medialen Rande des induzierten Fokus
platzierten Elektrode, der MCR2, hätte man iktale elektrophysiologische Aktivität am Rande
der Läsion detektieren können. Die Histologie zeigte jedoch, dass die Läsion teilweise größer
als der induzierte Fokus war und somit die MCR2-Elektrode teilweise auch noch in
nekrotischem Gewebe platziert war.
Ein
elektrophysiologischer
Fokus
auf
der
kontralateralen
Seite
bei
frontaler
Toxinapplikation wurde auch von Dow et al. (1972) [34] beschrieben, während bei
Toxinverabreichung in den Parietalkortex kein Hinweis auf einen kontralateralen Fokus
gefunden wurde. Fischer et al. (2004) [49] berichteten, dass zwei bis vier Wochen nach
Einsetzen eines Kobalt-Agar-Pellet in den sensomotorischen Kortex zusätzlich ein Fokus auf
der kontralateralen Seite auftrat.
Um den epileptogenen Effekt der Toxine alleine zu erforschen, müssten zunächst die
Elektroden implantiert und erst danach, nach Ausschluss einer operationsbedingten
Epileptogenese, das Toxin injiziert werden, sowie z.B. Tamargo et al. (2002) [132]
vorgegangen sind.
4.1.5 Video-Elektroenzephalographie-Ableitebedingungen
Mit der Erweiterung der Anzahl neokortikaler Tiefenelektroden auf fünf, platziert in beiden
Hemisphären ipsi- und kontralateral, fokal und extrafokal, sowie im Motor- als auch im
Parietalkortex, anstatt drei wie bei der VLP/NaCl-Studie von Altenmüller et al. (2013) [4],
Diskussion
93
wurden sehr gute Erkenntnisse der Lokalisation des epileptischen Fokus sowie dessen
Propagation erreicht. Eine topographisch großflächige Abdeckung elektrophysiologischer
Messungen iktaler und interiktaler Aktivität ist entscheidend für die zuverlässige Beurteilung
der Epileptogenese.
In dieser Arbeit, wie auch in unseren Vorarbeiten, wurden im Gegensatz zu den
Versuchen anderer Arbeitsgruppen keine epiduralen, und damit extrakortikalen Elektroden
benutzt [19, 24-27, 28, 34, 35, 131, 132]. Es wurde genauso wenig mit einer einzigen
Tiefenelektrode gearbeitet, wie von Nilson et al. (2005) [106] beschrieben; wir verwendeten
vielmehr mehrere intrakortikale Tiefenelektroden. Dadurch ist die Aussagekraft des
Epilepsie-Modells der vorliegenden Arbeit deutlich höher, da die elektrophysiologische
Fokuslokalisation genauer beurteilt und Anfälle besser detektiert werden konnten.
Tiefenelektroden oder subdurale Elektroden werden auch im klinischen Alltag bei der
invasiven prächirurgischen Diagnostik eingesetzt.
Hinzu kommt die Wichtigkeit einer ausreichend langen Ableitedauer, um bei niedriger
Anfallsfrequenz die Anfalls-Dokumentation zu sichern. Dies zeigt die Publikation von
Tamargo et al. (2002) [132], die nur bei der Hälfte der Tiere epileptische Aktivität bei einer
Ableitedauer von nur 10 min/Tag fanden. Chang et al. (2004) [19] beobachteten bei
kontinuierlicher Ableitung für drei Wochen in allen neun beschriebenen Tieren epileptische
Anfälle, genauso wie Colasanti et al. (1974) [25]. Da auch in unserer Arbeitsgruppe in den
Vorversuchen nur stundenweise abgeleitet wurde, erklärt dies möglicherweise, weshalb nur
wenige Anfälle gefunden werden konnten. Die Ergebnisse, bei den in dieser Dissertation
beschriebenen Versuchstieren verwendeten 24h-Ableitung, unterstreicht die Wichtigkeit einer
kontinuierlichen Ableitung. Problematisch war hierbei zum einen, dass man entweder nur ein
einziges Tier zur gleichen Zeit untersuchen konnte, oder genügend Video-EEG-Geräte, sowie
Speicherplatz gebraucht hätte, was sehr teuer ist. Des Weiteren fielen dadurch riesige
Datenmengen an, die ausgewertet werden mussten, was wiederum einen großen personellen
Aufwand erforderte. Da sich der Ansatz dieser Arbeit an den klinischen Gegebenheiten des
invasiven Video-ECoG-Monitoring beim Menschen orientierte, um ein möglichst
repräsentatives Modell zu liefern, führten wir ein kontinuierliches Video-ECoG-Monitoring
durch. Die Beurteilung der ECoG-Ableitungen und der Anfallssemiologie erfolgte visuell,
wie es im klinischen Alltag der Universitätsklinik Freiburg durchgeführt wird. Die
Auswertungen der Daten des Tiermodells orientierten sich an den Definitionen epileptischer
Aktivität in intrakraniellen EEGs und der Anfallssemiologie bei Patienten.
Diskussion
94
Andere Arbeitsgruppen quantifizieren Verhalten von Tieren, um die Intensität von
Krampfanfällen in ihren Modellen zu beurteilen. Die Racine Skala [118], die ursprünglich für
Amygdala-Kindling-Modelle entwickelt wurde, ist eine der am häufigsten verwendeten
Skalen, mithilfe derer andere Arbeitsgruppen die Intensität der epileptischen Aktivität
beurteilen [32, 53]. Die Anfälle werden in der Racine Skala anhand der motorische Aktivität
in 5 Stärken eingeteilt: 1. Mund- und Gesichtsbewegungen, 2. Kopfnicken, 3. Klonus einer
vorderen Extremität, 4. Anfälle, charakterisiert durch Aufrichten auf die Hinterbeine, 5.
Anfälle, charakterisiert durch Aufrichten auf die Hinterbeine und Umfallen [118]. In der
vorliegenden Arbeit wurde diese Auswertung anhand der Videodateien abgelehnt, da keine
Bewegungen oder Anspannungen der Ratten als epileptische Aktivität missgedeutet, sondern
nur eindeutige epileptische Aktivität bewertet werden sollte. Deshalb wurden die ECoGDaten gescreent und die zugeordneten Videodateien nur zur Beurteilung der Semiologie
hinzugezogen. Außerdem konnten so auch subklinische Anfälle detektiert werden.
4.1.6 Therapieversuch
Aufgrund der mehrfachen überschießenden epileptischen Aktivität der Versuchstiere der
Gruppe II beschlossen wir bei Ratte 11 einen Therapieversuch durchzuführen, um die Ratte
nicht opfern zu müssen und die Epileptogenese über einen längeren Zeitraum betrachten zu
können. Der erste Therapieversuch bestand aus systemisch verabreichtem VPA durch i.p.
Injektion.
VPA ist als ein Breitspektrum-AED bekannt und gehört zu den empfohlenen
Medikamenten bei fokalen Epilepsien [46, 109]. In einem fokalen Status epilepticus, der einer
EPC ähnelte, konnten wir bei systemischer Verabreichung weder im anschließend
abgeleiteten ECoG noch klinisch in den Videoaufzeichnungen eine therapeutische Wirkung
finden.
Das als nächstes verabreichte DZP i.p. konnte im Gegensatz zu VPA i.p. den Status
elektrophysiologisch und klinisch unterbrechen. Auch Nilsen et al. (2005) [106] versuchten
mit DZP i.p. bei einer maximalen Dosis von 20 mg/kg die beschriebene milde epileptische
Aktivität zu unterdrücken. Als Ergebnis zeigte sich jedoch keine Abnahme der klinischen und
elektrophysiologischen Anfallshäufigkeit, also eine Therapieresistenz gegenüber DZP.
Gemäß eines Patienten-Fallberichts von Rejdak et al. (2008) [124] konnte in einem
Einzelfall die EPC durch systemisches VPA erfolgreich beendet werden, während eine
Therapie mit DZP versagte. Sowohl VPA- als auch DZP-Infusionen sind bei einem
generalisierten Status epilepticus in randomisierten, kontrollierten Studien als effektive
Zweitlinien-AED beschrieben worden [20]. Im TeT-Tiermodell dieser Arbeit konnte bei
Diskussion
95
einem fokalen Status epilepticus mit systemisch verabreichten VPA keine Wirkung erzielt
werden, während DZP den Status erfolgreich unterbrach. Unser Tier Nr.11 zeigte also einen
gegensätzlichen Effekt zu dem von Rejdak et al. (2008) [124] präsentierten Patienten, wobei
man berücksichtigen muss, dass es sich jeweils nur um einen Fallbericht zweier verschiedener
„Säugetiere“ handelt.
Die Wirkdauer von DZP war allerdings auf seine Halbwertszeit und die der aktiven
Metaboliten beschränkt, weshalb sich die Ratte nach eineinhalb Tagen wieder im Status
epilepticus befand. Mit dem dritten Therapieversuch durch lokale Injektion von VPA, konnte
ebenfalls keine Verbesserung erzielt werden. Die Ergebnisse der bei Ratte 11 durchgeführten
Therapieversuche konnten an den folgenden Ratten nicht evaluiert werden, da diese entweder
keine überschießende epileptische Aktivität zeigten (Ratte 12 und 13) oder wie Ratte A und B
nach TeT-Nachinjektion eines plötzlichen Todes verstarben. Um die Aussagekraft der
Ergebnisse zu erhöhen, müssen weitere Therapieversuche mit derselben Dosis durchgeführt
werden.
In der Altenmüller et al.-Studie (2013) [4] wurde gezeigt, dass die lokale Therapie mit
VPA durch Freisetzung aus Polycaprolacton-Polymeren direkt über dem epileptischen Fokus
zu einem Überlebensvorteil im fokalen, neokortikalen Rattenmodell führt. Es wird
angenommen, dass die lokale antiepileptische Wirkung von VPA zu einer geringeren Inzidenz
tödlicher Anfälle führte. Allerdings konnte keine statistische Aussage über die lokale
Wirkung von VPA auf die epileptische Aktivität gemacht werden, da nur wenige
Kontrolltiere ausreichend lange für Video-ECoG-Aufnahmen zur Verfügung standen [4].
In der Arbeit von Rassner et al. (2014) [121] konnten wir beweisen, dass es einen
signifikanten Unterschied zwischen der Abnahme an ETPs/h durch VPA und der Zunahme
von ETPs/h in den Kontrolltieren im Vergleich der ersten zur zweiten Woche gab.
Unseres Wissens sind keine weiteren Studien an Tiermodellen mit TeT-induzierter
neokortikaler epileptischer Therapie und VPA-Therapie bekannt.
4.1.6.1 Systemische Valproat-Therapie in Tiermodellen
Eine systemische VPA-Therapie bei einer Kobalt-induzierten neokortikalen Epilepsie an
Ratten wurde, im Gegensatz zu TeT-induzierter Epilepsie, schon getestet. Walton und
Treiman (1992) [139] beschrieben nach entsprechender Auslösung sekundär generalisierter
tonisch-klonischer Anfälle und eines Status epilepticus durch zusätzlich HomocysteinThiolacton, dass diese durch i.p. Injektion mit VPA kontrolliert werden konnten. Die mittlere
effektive Dosis von VPA lag bei 212 mg/kg KG und führte zu einer Serumkonzentration von
270 µg/mL. Allerdings konnte die interiktale epileptische Aktivität auch bei Steigerung der
Diskussion
96
Serumlevel nur bei sehr wenigen Ratten komplett unterdrückt werden [139]. Eine weitere
Therapiestudie mit VPA wurde an einem Kobalt-induzierten neokortikalen Epilepsie-Modell
an Katzen beschrieben. Hier zeigte sich nach s.c. oder i.v. Applikation von 200 mg/kg KG
VPA keine Unterbrechung der epileptischen Aktivität des Fokus, jedoch nach i.v. Gabe eine
Unterdrückung der Ausbreitung vom epileptischen Fokus aus [36].
In der vorliegenden Arbeit wurde der Ratte Nr. 11 200 mg/kg KG VPA i.p. injiziert; im
Vergleich zu den in Kobalt-Modellen getesteten Studien mit VPA sahen wir im TeT-Modell
hier keinen Effekt.
4.1.6.2 Systemische Diazepam-Therapie in Tiermodellen
Ein Therapieversuch mit systemisch verabreichtem DZP an TeT-induzierter neokortikaler
Epilepsie in Ratten ist im Gegensatz zu VPA bekannt [106]. Bei niedrigerer Dosis von
20 mg/kg KG im Vergleich zu unserer Erstdosis von 30 mg/kg erreichten Nilsen et al. (2005)
[106] keine Senkung der Anzahl oder Dauer ihrer milden Anfälle, während wir einen
kompletten
Rückgang
der
Frontallappenanfälle
mit
komplexer
hypermotorischer
Symptomatik zeigen konnten und auch bei niedrigerer Dosis von 15 mg/kg KG eine
Abnahme der Anfallsfrequenz und -stärke sahen. Walton und Treiman (1988) [138]
beschrieben auch schon in ihrem Kobalt/Homocystein-Thiolacton-Modell mit fokalen
Anfällen und sekundärer Generalisation, dass mit einer niedrigen Dosis von 5 mg/kg KG DZP
ebenfalls die Anfälle erfolgreich unterbrochen werden konnten.
4.1.6.3 Lokale medikamentöse Epilepsietherapie in Tiermodellen
Die Wirkung der lokalen medikamentösen Epilepsietherapie wurde bereits früher in
Tiermodellen nachgewiesen. Die folgende Tabelle 4-1 zeigt lokale Therapieversuche von
1997 bis 2014 an Ratten mit chemisch induzierten Anfällen. Die Experimente der lokalen
Therapie von Ludvig et al. (2009) [91] bei neokortikalen Acetylcholin-induzierten Anfällen
mit Muscimol, einem GABAA-Rezeptoragonisten, wurden außer an Ratten ebenfalls an
Totenkopfaffen durchgeführt.
Weitere lokale Therapieversuche an Ratten wurden nach Anfallsinduktion durch elektrisches
Kindling beschrieben [13, 127]. Diese und eine Reihe weitere sind nicht in Tabelle 4-1
aufgeführt, da sich die Dissertation insgesamt auf chemisch induzierte Epilepsiemodelle
konzentriert.
Diskussion
97
Tabelle 4-1: Lokale medikamentöse Epilepsietherapie in Tiermodellen
Literatur
1997-2014
Anfälle induziert
durch
Lokale Therapie mit
Therapieeffekt
Eder et al.
1997a [40]
Bicucullin auf den
Neokortex und im
Hippocampus
DZP-Perfusion
epidural und im
Hippocampus
Deutliche Reduktion der
Spikes/min
Eder et al.
1997b [41]
Kobalt im
Hippocampus +
Pilocarpin i.p.
DZP-Perfusion im
Hippocampus
Deutliche Reduktion des
Spikings und der
Anfallsfrequenz
Stein et al.
2000 [131]
Bicucullin epidural
DZP-Perfusion
epidural
Signifikante Abnahme der
Anfallsanzahl; Unterschied der
Anfallsdauer
Tamargo et al.
2002 [132]
CoCl2 auf den
Neokortex
Phenytoin-Polymere
im Neokortex
Signifikante Abnahme der
Anfallsaktivität
Nilsen et al.
2005 [106]
TeT im Neokortex
NBQX epidural
Reduktion der Anfallsaktivität
für <2 h
Nilsen et al.
2006 [105]
TeT im Neokortex
Carbenoxolon/
Meclofenamic acid
im Neokortex
Reduktion der Anfallsaktivität,
sowie der EEG-Amplitude für
<40 min nur durch
Meclofenamid acid; keine
Wirkung durch Carbenoxolon
Ludvig et al.
2006 [90]
Acetylcholin epidural
Pentobarbial epidural
Beendigung und Verhinderung
der Entstehung von Anfällen
John et al.
2007 [69]
Acetylcholin epidural
GABA (25 oder
50 mM) epidural
Abschwächung und
Beendigung von Anfälle, keine
Verhinderung ihrer Entstehung
Ludvig et al.
2009 [91]
Acetylcholin epidural
Muscimol epidural
Beendigung und Verhinderung
der Entstehung von Anfällen
Altenmüller et
al. 2013 [4]
TeT im und CoCl2 auf
dem Neokortex
VPA-Polymere
Überlebensvorteil
Halliday et al.
2013 [60]
TeT im Hippocampus
LevetiracetamPolymere über dem
Motorkortex
Signifikant kürzere Anfälle
und Trend zu selteneren und
schwächeren Anfällen
Rassner et al.
2014 [121]
TeT im und CoCl2 auf
dem Neokortex
VPA-Polymere
Abnahme von ETPs/h in der
zweiten Woche im Vergleich
zur ersten
Zu den in der Tabelle aufgeführten Studien ist hinzuzufügen, dass bei einem Vergleich von
fünf Pharmaka mit antiepileptischen Eigenschaften bei transmeningealer Gabe an Ratten
Muscimol die besten Ergebnisse bei fokalen, neokortikalen Epilepsien zeigte [6]. Zu
berücksichtigen ist, dass die in der Tabelle aufgeführten Experimente − bis auf die von
Tamargo et al. (2002) [132], Altenmüller et al. (2013) [4], und Halliday et al. (2013) [60]
vorgenommenen − nur akute Therapieversuche präsentieren und damit keine Aussage über
die langfristige Auswirkungen an einem chronischen Modell erlauben. Dies kann nicht durch
Diskussion
98
einzelne Injektionen über dem oder in den Fokus überprüft werden, sondern muss durch
Polymer- oder Pumpen-gesteuerte Pharmakafreisetzung erfolgen.
Auf der Grundlage der Ergebnisse von Eder et al. (1997a/b) [40, 41] mit DZP wäre auch
interessant zu testen, wie sich die lokale DZP-Applikation auf einen TeT-induzierten
neokortikalen Fokus auswirken würde. Dies gilt es in weiteren Versuchen zu erforschen.
Trotz dem in dieser Arbeit beschriebenen negativen Ergebnis der akuten, lokalen VPAPerfusion im fokalen Status epilepticus, nehmen wir aufgrund der in Altenmüllter et al.
(2013) [4] beschriebenen Ergebnisse der signifikant längeren Überlebensdauer und in Rassner
et al. (2014) [121] bewiesenen Reduktion der ETPs/h durch VPA im Vergleich der ersten zur
zweiten Woche post OP an, dass bei länger andauernder, gesteuerten lokalen VPAApplikation direkt auf den neokortikalen Fokus ein besserer Effekt erzielt werden kann, die
eher geringe Wirkung nach systemischer Applikation erhöht wird und keine oder nur geringe
systemische Nebenwirkungen auftreten. Interessante Ergebnisse zur intracerebralen VPATherapie lieferten auch Serralta et al. (2006) [127]. Sie zeigten, dass sowohl akute, als auch
kontinuierliche VPA-Injektionen in den Seitenventrikel generalisierte und auch fokale Anfälle
unterdrücken konnten, jedoch bei akuten VPA-Injektionen bedeutsame Nebenwirkungen
auftraten, während diese bei der kontinuierlichen VPA-Injektion nicht zu sehen waren.
Allerdings wurden hier Anfälle durch elektrisches Amygdala-Kindling ausgelöst und VPA
nicht direkt lokal auf den epileptischen Fokus injiziert. Trotzdem konnte auch hier gezeigt
werden, dass intracerebral verabreichtes VPA die epileptische Aktivität reduzierte, keine
systemisch hohen Wirkspiegel auftraten, somit nicht lebertoxisch oder teratogen wirkte und
bei kontinuierlicher Infusion Nebenwirkungen verhindert werden konnten [127].
Bei
den
hier
beschriebenen
Versuchstieren
konnten
keine
weiteren
lokalen
Therapieversuche durchgeführt werden, da das Tiermodell noch keine konstanten Ergebnisse
mit ausreichend langen anhaltenden epileptischen Anfällen lieferte. Um den lokalen Effekt
von VPA, anderen AEDs und antikonvulsiv wirksamen Substanzen, wie z.B. Adenosin [13,
39, 82, 134], auf die epileptische Aktivität nachzuweisen, sollen die in Altenmüller et al.
(2013) [4] und Rassner et al. (2014) [121] begonnen Therapieversuche fortgeführt werden,
wenn das Ziel des chronischen Fokus über mindestens einen Monat erreicht ist.
Die Therapie mit PCaL-Polymeren dient zum einen der Erforschung der Auswirkung
einer fokalen Therapie bei chronischer neokortikaler Epilepsie, wie sie beispielsweise für
Anfälle bei kortikalen Dysplasien und vaskulären Malformationen benötigt wird. Zum
anderen kann damit auch die Wirkung der AED auf die Epileptogenese untersucht werden,
wenn die Polymere direkt nach epileptogener Induktion aufgebracht werden.
Diskussion
99
4.2 Lokale subdurale Valproatapplikation bei pharmakoresistenten fokalen
neokortikalen Epilepsien: intraoperative Pilotstudie
Mit den Ergebnissen der beiden Patienten der intraoperativen Pilotstudie am Menschen,
konnte nachgewiesen werden, dass lokal verabreichtes VPA bei Epilepsiepatienten die lokale
epileptische Aktivität im Neokortex reduziert. Beide Patienten erzielten hoch signifikante
Ergebnisse. Bei dem ersten Patienten wurde ein hoch signifikanter Anstieg der Dauer der
SUPs nach VPA-Therapie gefunden. Dies kann eine Zunahme der Unterdrückung
epileptischer Aktivität durch VPA bedeuten. Bei Patient Nr. 2 konnte eine signifikante
Abnahme der ETPs/min nach VPA gezeigt werden bis hin, dass nach Anfluten von VPA die
Anzahl der ETPs/min sogar auf null sank. Dies konnte mit der präzisen Auszählung jeder
Minute nachgewiesen werden. Somit ist die akute Wirkung einer lokalen Epilepsietherapie
offenkundig. Die Ergebnisse wurden von zwei unabhängigen, verblindeten Auswertern mit
großer Übereinstimmung erzielt.
Betrachtet man die Mittelwerte der 20 min-Blöcke des zweiten Patienten, wurde nach
NaCl-Einwirkzeit ebenfalls ein hochsignifikanter Unterschied zu der Baseline-Ableitung
beobachtet. Wodurch diese Abnahme der epileptischen Aktivität resultiert ist unklar und
wiederholt sich bei den Ergebnissen des ersten Patienten nicht. Möglicherweise spielt die
operative Freilegung des Gehirns eine Rolle. Auch ist ein Einfluss auf die epileptische
Aktivität durch Abkühlung infolge des freiliegenden feuchten NaCl-Tupfers denkbar (der
Tupfer wurde mit 37°C warmer NaCl-Lösung getränkt). Eine gekühlte NaCl-Lösung wird
beispielweise intra-operativ genutzt, um Anfälle zu unterbrechen [21]. Ebenso ist, trotz des
Verzichts auf Propofol, auch ein Narkoseeffekt eventuell relevant, woraus mit Dauer der OP
eine Abnahme der ETPs/min resultierte. Chui et al. (2013) [21] zählten verschiedene
Anästhetika auf, die zur Zu- oder Abnahme des interiktalen Spiking führten. Herrick et al.
(2002) [66] zeigte ein Abnahme der Spike-Frequenz durch Remifentanyl, auch wenn diese
nicht signifikant war. Vergleicht man die Mittelwerte von je fünf Minuten innerhalb der
20 Minuten Blöcke, konnte keine lineare Abnahme mit der Zeit gefunden werden. Wodurch
die Abnahme der epileptischen Aktivität nach NaCl-Applikation auftrat, ist bisher nicht
vollständig geklärt. Eine Wiederholung des Effektes konnte mit den Ergebnissen des 1.
Patienten nicht gezeigt werden. Zum vollständigen Ausschluss einer weiteren Wirkung durch
andere Faktoren ist der Einschluss weiterer Patienten wichtig.
Die hochsignifikanten Unterschiede der Mittelwerte zwischen der Baseline-Ableitung und
der Ableitung nach lokaler VPA-Applikation sowie die hochsignifikanten Unterschiede
Diskussion
100
zwischen den Mittelwerten nach NaCl-Gabe zu denen nach VPA-Therapie bestätigten
zweifellos, dass lokal verabreichtes VPA die epileptische Aktivität reduziert.
Madhavan et al. (2008) [93] zeigte bereits bei drei Patienten, dass intraoperativ subdural
verabreichtes Lidocain die lokale interiktale epileptische Aktivität im Neokortex reduzieren
kann. Lidocain ist jedoch kein typisches in der Epilepsietherapie verwendetes Medikament,
im Gegensatz zu dem von uns verwendeten VPA. In dieser Studie wurde außerdem keine
Kontrolle zum Vergleich durchgeführt [93]. Im Weiteren ist keine Studie zur lokalen
Pharmakotherapie bei Epilepsiepatienten bekannt.
Unter anderem aufgrund der hier beschriebenen positiven Ergebnisse der beiden Patienten
sowie der Ergebnisse von Madhavan et al. (2008) [93], sollte die lokale medikamentöse
Epilepsietherapie weiter entwickelt und klinisch etabliert werden.
4.3 Histologie
Die histologischen Schnitte zeigten alle gemeinsam mehr oder weniger große ipsilaterale
Läsionen. Es zeigte sich zwar eine Tendenz zu kleineren Läsionen bei Gruppe II im Vergleich
zu I, insgesamt konnte jedoch zwischen der Behandlung TeT/CoCl2 gegenüber TeT alleine
kein signifikanter Größenunterschied der Läsionen beim Vergleich aller drei Messungen der
zwei verschiedenen Schnitte jeder Ratte gefunden werden. Unsere Annahme, dass die
Läsionen vor allem durch CoCl2 verursacht wurden, konnten bisher noch nicht bestätigt
werden.
In der Literatur werden nach Kobalt-Applikation in Form von Pulver, Draht oder
Gelatine-Stiften die Entstehung großer ipsilateraler Nekrosen beschrieben [19, 34, 35, 48].
Fischer et al. (1967) [48] berichteten, dass um ein Kobalt-Gelatine-Stäbchen drei
konzentrische Zonen entstanden sind:
Zone 1: eine Koagulationsnekrose
Zone 2: ein Ödem und eine glio-mesenchymale Narbe
Zone 3: eine Übergangszone mit unterschiedlich stark geschädigten Ganglienzellen
Elektronenmikroskopisch fand Fischer (1968) [47] viele Neurone ohne umgebenden Schutz
von Gliazellen isoliert in Plasmaseen liegend. „Diese […] teilweise Deafferentation der
kortikalen Nervenzellen scheint für die Pathogenese dieser experimentellen Epilepsie von
Interesse“, schrieb er 1986 [47].
Innerhalb der in dieser Arbeit beschriebenen Behandlungsgruppen zeigten sich große
Unterschiede: Bei Gruppe I waren Differenzen zwischen Tier 4 und 5, die eines frühen,
plötzlichen Todes verstarben und nicht perfundiert werden konnten und Tier 6 und 7, die
Diskussion
101
beide länger als zwei Monate überlebten und schließlich perfundiert wurden, deutlich. Tier 6
und 7 hatten im Vergleich zu den kurzlebenden, nicht perfundierten Tieren deutlich kleinere
Läsionen. Es stellt sich die Frage, ob ein längeres Überleben durch Regeneration zur
Verkleinerung der Läsionen führt und in wie weit die Perfusion die Schnitte beeinflusste.
Auch innerhalb von Gruppe II waren deutliche Unterschiede zu erkennen, insgesamt
zeigte sich eine Tendenz zu kleineren Läsionen im Gegensatz zu Versuchsgruppe I. Es konnte
keine Beziehung zwischen einem längeren Überleben, wie bei Ratte 11, und kleineren
Läsionen gezeigt werden. Dieses Tier 11 wies sogar im Vergleich eine größere Läsion auf.
Möglicherweise wurde diese größere Läsion, im Vergleich zu den Läsionen der anderen TeTTiere durch die lokale VPA-Applikation während des Therapieversuches beeinflusst. Von
Ratte 12, dem einzigen per se überlebenden Tier von Gruppe II, existiert leider keine
Histologie, da das Gehirn für andere Versuchszwecke verwendet wurde.
Bemerkenswert ist, dass Gruppe II Läsionen aufweist, obwohl in der Literatur keine oder
nur minimale Läsionen durch TeT beschrieben werden [72, 89, 97]. Es stellt sich somit die
Frage:
„Kann eine TeT-Injektion
alleine
zur Nekrose führen?
Oder liegt
der
Nekroseentstehung ein Operationstrauma zugrunde?“ Denkbar ist eine durch die Hitze beim
Fräsen trotz Kühlung mit NaCl entstandene Läsion. Alternativ könnte die Läsion auch durch
das mehrfache Einführen der Injektionsnadel entstanden sein. Kessler und Markowitch (1983)
[72] zeigten ein kleines geschädigtes Areal im Bereich der platzierten Injektionskanüle
oberhalb des Hippocampus. Um dies herauszufinden ist die OP von Kontrolltieren
erforderlich, wie diejenigen der Versuchsgruppe IV, ohne nachfolgende TeT-Injektionen.
Ratte A hatte nach Injektion von 125.2 ng TeT ähnlich große Läsionen wie Tier 8 und 9. Tier
B konnte aufgrund einer intraoperativ zu tiefen Bohrung nicht verwertet werden.
Es konnte keine Korrelation zwischen der TeT-Gesamtdosis und der Größe der Läsion
gefunden werden. Des Weiteren zeigte die Histologie, dass die Größe der Läsion nicht mit
dem Ausmaß der epileptischen Aktivität korreliert, insoweit man bei den verschiedenen
Behandlungsschemata und Anfallsmustern eine Aussage treffen kann. Diese Feststellung ist
plausibel, wenn man davon ausgeht, dass die epileptische Aktivität am Rande einer Läsion
entsteht und eine Nekrose an sich keine Anfälle auslöst.
Ratte 6 zeigte höchstwahrscheinlich anlagebedingt einen Hydrocephalus internus, der nur
bei diesem Tier beobachtet wurde. Ein OP-bedingt erhöhter Hirndruck ist unwahrscheinlich,
da dies, wenn überhaupt wohl einen Hydrocephalus externus verursachen würde und
wahrscheinlich nicht nur bei einem Tier aufgetreten wäre. Die Läsion dieser Ratte war eher
klein, wie bei Tier 7, 8 und 9.
Diskussion
102
Eine minimale Läsion auf der kontralateralen Seite, wie sie auf der Abb. 3-29 im
Ergebnisteil bei Kontrollratte A zu sehen ist, zeigt uns möglicherweise ein Korrelat für
Anfälle mit einem zusätzlichen Fokus außerhalb des induzierten Fokus. Die Entstehung der
entsprechenden Läsion ist unklar; sie kann möglicherweise durch die Halteschrauben, die
Elektroden oder kleinere operationsbedingte Blutungen verursacht worden sein. Eine durch
TeT induzierte kontralaterale Läsion ist unwahrscheinlich. Mainardi et al. (2012) [94] zeigten
eine regionale spezifische Wirkung von TeT, wobei diese weder in der kontralateralen
Hemisphäre, noch in anderen Regionen aufzufinden war.
4.4 Vergleich der automatischen Auswertung mit der visuellen
Um die zukünftige Auswertung massenhaft anfallender ECoG-Daten bei 24h-Ableitungen der
Tiere zu erleichtern, wurden in dieser Arbeit die visuell ausgewerteten Ergebnisse mit denen
des automatischen Auswertprogramms aus Erlangen verglichen. Es zeigte sich eine hohe
Korrelation der Daten mit einer Sensitivität von 91-95 % für längere Anfälle mit repetitiven
Spike-Wave-Muster. Übersehene Anfälle, waren in der Regel nur wenige Sekunden,
durchschnittlich
12 s,
lang
und
häufig
durch
kleine
Amplitudendifferenzen
zur
Hintergrundaktivität gekennzeichnet. Bei Anfällen vom BSM-Typ und ETPs zeigte sich
hingegen nur eine Sensitivität von 48-69 %.
Das Programm wurde nicht dazu benutzt, eine Anzahl von Anfällen pro Zeitintervall zu
berechnen, wie es durch verschiedene Algorithmen möglich ist [56]. Die integrierte Power der
Analyse wurde visuell beurteilt und demgemäß verdächtige ECoG-Daten gesichtet.
Zusammenfassend kann man sagen, dass das halbautomatisierte Programm eine gute
Unterstützung zum Screening der EEG-Dateien beim kombinierten TeT/CoCl2-Ansatz sein
kann, indem dadurch die Auswertung hochgradig beschleunigt wird. Dabei muss bedacht
werden, dass kürzere und gleichzeitig niedrigamplitudige Anfälle möglicherweise übersehen
werden. Um die genaue Elektrophysiologie und Semiologie der Anfälle auszuwerten, muss
weiterhin das EEG hinzugezogen und visuell ausgewertet werden. Dies ist problemlos
möglich, da man ins EEG bzw. ECoG „springen“ kann. Zur Auswertung der interiktalen
Aktivität und Zählung einzelner ETPs muss die Auswertung weiterhin visuell erfolgen. Für
das alleinige TeT-Modell müsste das Programm zur Erfassung von BSM weiter angepasst
werden.
Bei der Untersuchung der Sensitivität der automatisierten EEG-Auswertung im Hinblick
auf die Erleichterung der visuellen EEG-Auswertung müssen folgende Faktoren bei der
Interpretation der Ergebnisse beachtet werden: Da sowohl die visuelle als auch die
Diskussion
103
halbautomatisierte Auswertung im Abstand von 12 Monaten von mir persönlich durchgeführt
wurden, war dadurch keine vollständige Verblindung gewährleistet. Das kann zu selektiven
Befundungsfehlern, einem so genannten Informationsbias, geführt haben. Um die
Aussagekraft der Sensitivität zu erhöhen, ist die Auswertung der Daten des automatisierten
Programmes durch eine verblindete Person erforderlich.
Eine Studie an menschlichen extrakortikalen EEGs zeigte bei komplett automatisierter
Datenanalyse mittels Anfallsdetektionsalgorithmus ebenfalls eine gute Sensitivität bis zu
90.9 % je nach Montage, wie in der Publikation von Hopfengärtner et al. (2007) [67]
dargestellt. Somit scheinen die Ergebnisse nicht in großem Maße durch „meinen“
Informationsbias beeinflusst worden zu sein. Im Gegensatz zu der genannten Studie wurde
bei uns in der bipolaren Montage eine gute Sensitivität festgestellt, während Hopfengärtner et
al. (2007) [67] eine gute Sensitivität in der Referenzmontage mit schlechteren Ergebnissen in
der bipolaren Montage eruierte.
Auch wenn es wichtig ist, sowohl bei Patienten als auch im Tiermodell jeden Anfall zu
erfassen, um eine richtige Diagnose zu stellen und die Epileptogenese genau beurteilen zu
können, kann man sich das Programm aus Erlangen halbautomatisch zur Hilfe nehmen. Durch
ein schnelleres Screening wird die Möglichkeit gegeben, sich zeitnah eine Vorstellung über
die Epileptogenese jedes Tieres zu machen. Dies ist z.B. wichtig, um zum richtigen Zeitpunkt
Toxin beim chemischen Kindling-Modell nach zu injizieren, oder therapeutisch eingreifen zu
können. Bei TeT/CoCl2-Modell kann es jedenfalls zu erheblicher Zeitersparnis führen.
Die vollautomatisierte Anfallserkennung wurde in der vorliegenden Arbeit nicht evaluiert.
Hierzu lieferte C. Wilde (2013) in seiner Masterarbeit interessante Ergebnisse [141]. Er
verglich sechs Methoden zur Anfallserkennung anhand der hier aufgeführten Daten und zeigte
folgendes: „Keine der untersuchten Methoden war in der Lage, alle vorhandenen Anfälle mit
einigermaßen hoher Genauigkeit zu erkennen. Der „nonlinear energy operator“ erzielte die
besten Ergebnisse mit einer durchschnittlichen Richtig-Positiv-Rate von mehr als 90 % und
einer mittleren Falsch-Positiv-Rate von 4-7 Falsch-Positiven pro Stunde, während die
Berechnung im Durchschnitt drei Sekunden benötigte“ [141]. Die vollautomatisierte
Anfallserkennung bleibt also bis dato eine anspruchsvolle, noch nicht befriedigend gelöste
Aufgabe. Da es bisher aufgrund der intra- und interindividuellen Unterschiede der Anfälle
kein Programm gibt, welches tatsächlich alle detektiert, kann meines Erachtens nicht komplett
auf eine visuelle EEG-Auswertung verzichtet werden.
Zusammenfassung
104
5. Zusammenfassung
Da auch heute noch circa ein Drittel der an Epilepsie erkrankten Patienten trotz neuer AED
pharmakoresistent sind, ist die Entwicklung neuer Methoden, wie beispielsweise der lokalen
medikamentösen Therapie, wichtig. Um die Wirksamkeit solcher Methoden zu überprüfen,
wird ein repräsentatives Tiermodell benötigt.
Ziel dieser experimentellen Arbeit war die Weiterentwicklung eines fokalen neokortikalen
Epilepsiemodells mit TeT/CoCl2, mit TeT alleine inklusive mehrfacher TeT-Nachinjektionen
im Sinne eines chemischen Kindlings, oder mit einem Kobaltdraht und die Evaluation des
Operationstraumas anhand von Kontrolltieren. Hierzu wurden insgesamt zwölf Ratten mit
(oder ohne) den unterschiedlichen epileptogenen Substanzen operiert, stereotaktisch acht
Elektroden implantiert und diese anschließend durch Video-ECoG-Monitoring überwacht um
die Epileptogenese zu überprüfen. Im TeT/CoCl2-Modell konnten wir durch Dosisreduktion
und verbesserten Ableitebedingungen zwei überlebende Ratten mit spontan reproduzierbaren
Anfällen bis maximal Tag 12 präsentieren. Im reinen TeT-Modell mit chemischen Kindling
und der Neuheit eines Schlauches der zur Nachinjektion eine Kanüle passieren ließ, konnten
wir nach Dosistitrierung eine Ratte mit anhaltender epileptischen Aktivität für mindestens 25
Tage vorzeigen. Eines der beiden Kontrolltiere ließ erkennen, dass epileptische Anfälle mit
Spike-Wave-Muster außerhalb des Fokus in den ersten Tagen nach der OP durch ein Operationstrauma bedingt sein können. Die histologischen Auswertungen anhand von Schnitten mit
Nissl-Färbung hinsichtlich der pro-epileptischen Faktoren ergaben keine signifikanten
Ergebnisse. Zum jetzigen Zeitpunkt ist ein repräsentatives chronisches Tiermodell für die
fokale neokortikale Epilepsie beim Menschen noch nicht erreicht. Die Ergebnisse des TeTModells mit TeT-Nachinjektionen sind vielversprechend und sollten fortgesetzt werden.
Die Beurteilung des automatisierten Programmes von Hopfengärtner et al. (2007) [67] zur
Auswertung von Video-EEG-Dateien bezüglich der Sensitivität für die Anfallsdetektion
ergaben eine hohe Sensitivität von 94-98 % für längere Anfälle mit repetitiven Spike-WaveMuster, jedoch eine geringere Sensitivität von 52-74 % für Anfälle mit BSM. Das
halbautomatische Detektionsprogramm kann bevorzugt im TeT/CoCl2-Modell für ein
schnelleres Screening genutzt werden, wobei es im reinen TeT-Modell für die zuverlässige
Erkennung von BSM noch weiter angepasst werden muss.
Die zeitgleich begonnene intraoperative Pilotstudie an Patienten zur Beurteilung einer
lokalen Epilepsietherapie mit VPA ergab für beide ausgewerteten Patienten hoch signifikante
Ergebnisse und somit einen durchschlagenden Erfolg. Diese neue Therapiemethode der
lokalen Behandlung mit AED sollte weiterverfolgt werden.
Abbildungsverzeichnis
105
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1-1: Strukturformel Valproat ................................................................................ 4
Abb. 1-2: Strukturformel Diazepam .............................................................................. 5
Abb. 2-1: Elektrodenanordnung ................................................................................. 15
Abb. 2-2: CoCl2-Plättchen Herstellung ........................................................................ 17
Abb. 2-3: Elektroden ................................................................................................ 18
Abb. 2-4: Steckerleiste ............................................................................................. 19
Abb. 2-5: OP-Feld mit neokortikalem Fokus ................................................................ 22
Abb. 2-6: TeT-Injektion ............................................................................................ 23
Abb. 2-7: Implantierter Schlauch mit Mandrin ............................................................. 24
Abb. 2-8: TeT-Nachinjektion ..................................................................................... 25
Abb. 2-9: Darstellung der Definition des Fokus und der VPA-Applikationsfläche ............. 37
Abb. 2-10: Intraoperative Bilder................................................................................. 38
Abb. 2-11: ECoG-Beispiel Patient Nr. 1 mit BSM ........................................................ 39
Abb. 2-12: ECoG-Beispiel Patient Nr. 2 mit ETPs ........................................................ 39
Abb. 3-1: Anfallsentwicklung Ratte 4 ......................................................................... 42
Abb. 3-2: ECoG Ratte 4 ............................................................................................ 43
Abb. 3-3: ECoG Ratte 5 ............................................................................................ 44
Abb. 3-4: Anfallsentwicklung Ratte 6 ......................................................................... 46
Abb. 3-5: ECoG Ratte 6 ............................................................................................ 47
Abb. 3-6: Anfallsentwicklung Ratte 7 ......................................................................... 48
Abb. 3-7: ECoG Ratte 7 ............................................................................................ 49
Abb. 3-8: Anfallsentwicklung Ratte 8 ......................................................................... 51
Abb. 3-9: ECoG Ratte 8 ............................................................................................ 52
Abb. 3-10: Anfallsentwicklung Ratte 9 ....................................................................... 53
Abb. 3-11: ECoG Ratte 9 .......................................................................................... 54
Abb. 3-12: Länger andauernde Anfälle/h Ratte 10 ........................................................ 55
Abb. 3-13: Anfallsentwicklung Ratte 10 der ersten Tage ................................................ 56
Abb. 3-14: ECoG Ratte 10 ........................................................................................ 57
Abbildungsverzeichnis
106
Abb. 3-15: Längere Anfälle mit Spike-Wave-Muster/h Ratte 11 ..................................... 58
Abb. 3-16: Epilepsietypische Potentiale/h Ratte 11 ....................................................... 59
Abb. 3-17: ECoG Ratte 11 – Längere Anfälle .............................................................. 61
Abb. 3-18: ECoG Ratte 11 – Therapieversuche ............................................................ 62
Abb. 3-19: Epileptische Aktivität Ratte 12 ................................................................... 63
Abb. 3-20: ECoG Ratte 12 ........................................................................................ 64
Abb. 3-21: Epileptogenese nach TeT-Injektion ............................................................. 65
Abb. 3-22: Anfallsentwicklung Ratte 13 ...................................................................... 67
Abb. 3-23: ECoG Ratte 13 ........................................................................................ 67
Abb. 3-24: Epileptogenese der Kontrolltiere ................................................................ 68
Abb. 3-25: ECoG Ratte A ......................................................................................... 69
Abb. 3-26: Histologische Darstellung Gruppe I 2.52 mm vor dem Bregma ....................... 71
Abb. 3-27: Histologische Darstellung Gruppe II + III 2.52 mm vor dem Bregma. .............. 72
Abb. 3-28: Histologische Schnitte Gruppe I auf der Höhe der größten Läsion ................... 73
Abb. 3-29: Histologische Darstellung Gruppe II + III auf Höhe der größten Läsion ........... 74
Abb. 3-30: Statistische Auswertung der histologischen Messungen ................................. 75
Abb. 3-31: Integrierte Power im 15 min-Fenster mit Spike-Wave-Anfällen ...................... 77
Abb. 3-32: Integrierte Power im 15 min Fenster mit BSM-Anfällen ................................ 78
Abb. 3-33: Integrierte Power im 15 min Fenster mit ETPs ............................................. 78
Abb. 3-34: Sensitivität der halbautomatisierten Anfallsdetektion für Anfälle mit Spike-WaveMustern hinsichtlich der visuellen Detektion, die als 100 % angenommen wurde.79
Abb. 3-35: Sensitivität der halbautomatisierten Anfallsdetektion für Anfälle mit BSM + ETP
im Vergleich hinsichtlich der visuellen Detektion, die als 100 % angenommen
wurde. ................................................................................................... 79
Abb. 3-36: Statistische Auswertung der Anzahl der SUPs/min des Patienten Nr.1 ............. 80
Abb. 3-37: Statistische Auswertung der Dauer der SUPs [s] des Patienten Nr.1 ................. 81
Abb. 3-38: Statistische Auswertung der ETPs/min des 2.Patienten .................................. 82
Abb. 3-39: Entwicklung der intraoperativen epileptischen Aktivität – Patient 2 ................. 83
Abb. 4-1: Epileptische EEG-Muster im Vergleich......................................................... 87
Tabellenverzeichnis
107
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1-1: Klassifikation der Epilepsien ..................................................................... 1
Tabelle 1-2: Ergebnisse der ersten Versuche des neokortikalen TeT-Epilepsiemodells ....... 10
Tabelle 2-1: Allgemeine Materialien für die Operation .................................................. 16
Tabelle 2-2: Materialien für CoCl2-Plättchens .............................................................. 17
Tabelle 2-3: Materialien für Elektroden ....................................................................... 18
Tabelle 2-4: Materialien für 12-Pin-Steckerleiste .......................................................... 18
Tabelle 2-5: Materialien für Tetanus Toxin .................................................................. 19
Tabelle 2-6: Materialien für Operationseinleitung und Narkose ....................................... 19
Tabelle 2-7: Materialien für Tetanus Toxin-Injektion .................................................... 22
Tabelle 2-8: TeT-Injektionsschema ............................................................................ 24
Tabelle 2-9: Materialien für Kobaltdraht-Behandlung.................................................... 25
Tabelle 2-10: Analgetikum ........................................................................................ 26
Tabelle 2-11: Substanzen für den Therapieversuch........................................................ 27
Tabelle 2-12: Materialien für Video-ECoG-Aufnahmen................................................. 27
Tabelle 2-13: Software für ECoG-Datenanalyse ........................................................... 28
Tabelle 2-14: Substanzen für Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ............................... 30
Tabelle 2-15: Zusammensetzung der Lösungen für die Herstellung von PB 0.4 M ............. 30
Tabelle 2-16: Substanzen zur Herstellung von 4 % Paraformaldehyd ............................... 30
Tabelle 2-17: Materialien für den Perfusionsvorgang .................................................... 31
Tabelle: 2-18: Materialien zur Herstellung von Vibratomschnitten .................................. 32
Tabelle 2-19: Materialien für Nissl-Färbung ................................................................ 32
Tabelle 2-20: Geräte und Software für die lichtbildmikroskopischen Untersuchungen und
statistische Auswertung ........................................................................ 33
Tabelle 2-21: Materialien für intraoperative Pilotstudie ................................................. 36
Tabelle 3-1: Rattenübersicht ...................................................................................... 40
Tabelle 3-2: Steckfehler ............................................................................................ 42
Tabelle 4-1: Lokale medikamentöse Epilepsietherapie in Tiermodellen ............................ 97
Literaturverzeichnis
108
Literaturverzeichnis
[1]
Adrian E, Matthews B (2010) The Berger rhythm: potential changes from the occipital
lobes in man. Brain; 133(1):3-6.
[2]
Akdogan I, Adiguzel E, Yilmaz I, Ozdemir MB, Sahiner M, Tufan AC (2008)
Penicillin-induced epilepsy model in rats: Dose-dependant effect on hippocampal
volume and neuron number. Brain Res Bull; 77(4):172-177.
[3]
Akman T, Erken H, Acar G, Bolat E, Kizilay Z, Acar F, Genc O (2011) Effects of the
hippocampal deep brain stimulation on cortical epileptic discharges in penicillin –
induced epilepsy model in rats. Turk Neurosurg; 21(1):1-5.
[4]
Altenmüller DM, Hebel JM, Rassner MP, Volz S, Freiman TM, Feuerstein TJ, Zentner
J (2013) Locally applied valproate enhances survival in rats after neocortical treatment
with tetanus toxin and cobalt chloride. BioMed Research International; 3:1-9.
[5]
Annegers JF, Hauser WA, Elveback LW (1979) Remission of seizures and relapse in
patients with epilepsy. Epilepsia; 20(6):729-737.
[6]
Baptiste SL, Tang HM, Kuzniecky RI, Devinsky O, French JA, Ludvig N (2010)
Comparison of the antiepileptic properties of transmeningeally delivered muscimol,
lidocaine, midazolam, pentobarbital and GABA in rats. Neurosci Lett; 469(3):421-424.
[7]
Benke T, Swann J (2004) The tetanus toxin model of chronic epilepsy. Adv Exp Med
Biol.; 548:226-238.
[8]
Bennewitz M, Saltzman WM (2009) Nanotechnology for delivery of drugs to the brain
for epilepsy. Neurotherapeutics; 6(2):323-336.
[9]
Berg AT, Berkovic SF, Brodie MJ, Buchhalter J, Cross JH, van Emde Boas W; Engel J;
French J; Glauser TA; Mathern GW; Moshé SL; Nordli D; Plouin P; Scheffer IE (2010)
Revised terminology and concepts for organization of seizures and epilepsies: Report of
the ILAE Commission on Classification and Terminology, 2005-2009. Epilepsia;
51(4):676-685.
[10] Bergey GK, Bigalke H, Nelson PG (1987) Differential effects of tetanus toxin on
inhibitory and excitatory synaptic transmission in mammalion spinal cord neurons in
culture: a presynaptic locus of action for tetanus toxin. J Neurophysiol; 57(1):121-131.
[11] Block F, Dafotakis M (2013) Medikamentös induzierte epileptische Anfälle. Fortschr
Neurol Psychiatr; 01:28-34.
[12] Blümcke I, Hamer H (2012) Neuropathologie und Ätiologie fokaler Epilepsien.
Nervenarzt; 2:181-186.
[13] Boison D, Scheurer L, Tseng JL, Aebischer P, Mohler H (1999) Seizure suppression in
kindled rats by intraventricular grafting of an adenosine releasing synthetic polymer.
Exp Neurol; 160(1):164-174.
[14] Bone B, Fogarasi A, Schulz R, Gyimesi C, Kalmar Z, Kovacs N, Ebner A, Janszky J
(2012) Secondarily generalized seizures in temporal lobe epilepsy. Epilepsia;
53(5):817-824.
[15] Brener K, Amitai Y, Jefferys JG, Gutnick MJ (1991) Chronic epileptic foci in
neocortex: in vivo and in vitro effects of tetanus toxin. Eur J Neurosci; 3(1):47-54.
[16] Brodie MJ (2010) Antiepileptic drug therapy the story so far. Seizure; 19(10):650-655.
Literaturverzeichnis
109
[17] Carrea R, Lanari,A (1962) Chronic effect of tetanus toxin applied locally to the cerebral
cortex of the dog. Science; 137(3527):342-343.
[18] Cascino G (2002) Video-EEG monitoring in adults. Epilepsia; 43(3): 80-93.
[19] Chang JH, Yang X, Zempel JM, Rothman SM (2004) The unilateral cobalt wire model
of neocortical epilepsy: a method of producing subacute focal seizures in rodents.
Epilepsy Res; 61(1-3):153-160.
[20] Chen WB, Gao R, Su YY, Zhao JW, Zhang YZ, Wang L, Ren Y, Fan CQ (2011)
Valproate versus diazepam for generalized convulsive status epilepticus: a pilot study.
Eur J Neurol; 18(12):1391-1396.
[21] Chui J, Manninen P, Valiante T, Venkatraghavan L (2013) The anesthetic
considerations of intraoperative electrocorticography during epilepsy surgery. Anesth
Analg; 117(2):479-486.
[22] Cockerell OC, Johnson AL, Sander, JWAS, Hart YN, Shorvon SD (1995) Remission of
epilepsy: results from the National General Practice Study of Epilepsy. Lancet;
346(8968):140-144.
[23] Cockerell OC, Johnson AL, Sander JWAS, Shorvon SD (1997) Prognosis of epilepsy: a
review and further analysis of the first nine years of the british national general practice
study of epilepsy, a prospective population-based study. Epilepsia; 38(1):31-46.
[24] Colasanti BK, Craig CR (1992) Reduction of seizure frequency by clonazepam during
cobalt experimental epilepsy. Brain Res Bull; 28(2):329-331.
[25] Colasanti BK, Hartman ER, Craig CR (1974) Electrocorticogram and behavioral
correlates during the development of chronic cobalt experimental epilepsy in the rat.
Epilepsia; 15(3):361-73.
[26] Craig C, Paulinet C, Colasanti BK (1976) Effects of diphenylhydantoin and
trimethadione on seizure activity during cobalt experimental epilepsy in the rat.
Neuropharmacology; 15(8):485-489.
[27] Craig CR, Colasanti BK (1992) Reduction of frequency of seizures by carbamazepine
during cobalt experimental epilepsy in the rat. Pharmacol Biochem Behav; 41(4):813816.
[28] D’Ambrosio R, Fairbanks J, Fender J, Born D, Doyle DL, Miller J (2004) Posttraumatic epilepsy following fluid percussion injury in the rat. Brain; 127(2):304-314.
[29] D’Ambrosio R, Maris D, Grady M, Winn H, Janigro D (1999) Impaired K+ homeostasis
and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J
Neurosci; 19(18):8152-8162.
[30] D'Ambrosio R, Perucca E (2004) Epilepsy after head injury. Curr Opin Neurol;
17(6):731-735.
[31] Davoudi M, Shojaei A, Palizvan MR, Javan M, Mirnajafi-Zadeh J (2013) Comparison
between standard protocol and a novel window protocol for induction of
pentylenetetrazol kindled seizures in the rat. Epilepsy Res; 106(1-2):54-63.
[32] Del-Bel EA, Oliveira PR, Oliveira JA, Mishra PK, Jobe PC, Garcia-Cairasco N (1997)
Anticonvulsant and proconvulsant roles of nitric oxide in experimental epilepsy models.
Braz J Med Biol Res; 30(8):971-979.
[33] Devinsky O (2011) Sudden, unexpected death in epilepsy. N Engl J Med;
365(19):1801-1811.
Literaturverzeichnis
110
[34] Dow RC, McQueen JK, Townsend HR (1972) The production and detection of
epileptogenic lesions in rat cerebral cortex. Epilepsia; 13(3):459-465.
[35] Dow RS, Fernandes-Gaurdiola A, Manni E (1962) The production of cobalt
experimental epilepsy in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol;
14:399-407.
[36] Duijn H, Beckmann MK (1975) Dipropylacetic acid (Depakine®) in experimental
epilepsy in the alert cat. Epilepsia; 16(1):83-90.
[37] Dunoyer C, Ragheb J, Resnick T, Alvarez L, Jayakar P, Altman N, Wolf A, Duchowny
M (2012) The use of stereotactic radiosurgery to treat intractable childhood partial
epilepsy. Epilepsia; 43(3):292-300.
[38] Dunwiddie TV (1999) Adenosine and suppression of seizures. Adv Neurol; 79:10011010.
[39] Dunwiddie TV, Masino SA (2001) The role and regulation of adenosine in the central
nervous system. Annu Rev Neuosci; 24:31-55.
[40] Eder HG, Jones DB, Fisher RS (1997a) Local perfusion of diazepam attenuates
interictal and ictal events in the bicuculline model of epilepsy in rats. Epilepsia;
38(5):516-521.
[41] Eder HG, Stein A, Fisher RS (1997b) Interictal an ictal activity in the rat
cobalt/pilocarpine model of epilepsy decreased by local perfusion of diazepam. Epilepsy
Res; 29(1) :17-24.
[42] Elger C (2012) Erster epileptischer Anfall und Epilepsien im Erwachsenenalter –
Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie 2012. Deutsche Gesellschaft
für Neurologie.
[43] Empson RM, Amitai Y, Jefferys JG, Gutnick MJ (1993) Injection of tetanus toxin into
the neocortex elicits persistent epileptiform activity but only transient impairment of
GABA release. Neuroscience; 57(2):235-239.
[44] Erdal E, Bartels F, Binscheck T, Erdmann G, Frevert J, Kistner A, Weller U, Wever J,
Bigalke H (1995) Processing of tetanus and botulinum A neurotoxins in isolated
chromaffin cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol; 351(1):67-78.
[45] Esclapez M, Trottier S (1989) Changes in GABA-immunoreactive cell density during
motor focal epilepsy induced by cobalt in the rat. Exp Brain Res; 76(2):369-385.
[46] Feuerstein TJ (2013). Antikonvulsiva, Konvulsiva – Pharmakotherapie der Epilepsien.
In: Allgemeine und spezielle Pharmakologie & Toxikologie; Eds. K. Aktories, U.
Förstermann, F. Hofmann, K. Starke, 11. Auflage, Elsevier, München, pp 269-279.
[47] Fischer J (1968) Elektronenmikroskopische Befunde bei der epileptogenen
Kobaltnekrose im Rattengehirn. Experientia; 24(2):162.
[48] Fischer J, Holubar J, Malik V (1967) A new method of producing epileptogenic cortical
foci in rats. Physiol Bohemoslov; 16(3):272-277.
[49] Fischer W, Kittner H, Regenthal R, Russo E, De Sarro G (2004) Effects of piracetam
alone and in combination with antiepileptic drugs in rodent seizure models. J Neural
Transm; 111(9):1121-1139.
[50] Fisher RS, Boas W, Blume W, Elger C, Genton P, Lee P, Engel JJ (2005) Epileptic
seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against
Literaturverzeichnis
111
Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia; 46(4):470472.
[51] French JA (2007) Refractory Epilepsy: Clinical Overview. Epilepsia; 48(1):3–7.
[52] Gerber U, Gähwiler BH (1991) Cobalt blocks postsynaptic responses induced by
neurotransmitters in the hippocampus in vitro. Neurosci Lett; 134(1):53–56.
[53] Glien M, Brandt C, Potschka H, Löscher W (2002). Effects of the novel antiepileptic
drug levetiracetam on spontaneous recurrent seizures in the rat pilocarpine model of
temporal lobe epilepsy. Epilepsia; 43(4):350-357.
[54] Goddard GV, McIntyre DC, Leech CK (1969) A permanent change in brain function
resulting from daily electrical stimulation. Exp Neurol; 25(3):295-330.
[55] Gotman J (1982) Automatic recognition of epileptic seizures in the EEG.
Electroencephalogr Clin Neurophysiol; 54(5):530-540.
[56] Greim V (2010). Validierung und Optimierung eines Algorithmus zur Detektion
epileptischer Anfälle im Oberflächen-EEG. Promotion. Erlangen-Nürnberg.
[57] Habig WH, Bigalke H, Bergey GK, Neale EA, Hardegree MC, Nelson PG (1986)
Tetanus toxin in dissociated spinal cord cultures: long-term characterization of form and
action. J Neurochem; 47(3):930-937.
[58] Hacke W (2010) Epilepsien. In Neurologie: 13. Auflage, Springer-Medizin-Verlag,
Heidelberg, Kapitel 14, pp 363-392.
[59] Hagemann G, Hoeller M, Bruehl C, Lutzenburg M, Witte OW (1999) Effects of tetanus
toxin on functional inhibition after injection in separate cortical areas in rat. Brain Res;
818(1):127-134.
[60] Halliday AJ, Campbell TE, Nelson TS, McLean KJ, Wallace GG, Cook MJ (2013)
Levetiracetam-loaded biodegradable polymer implants in the tetanus toxin model of
temporal lobe epilepsy in rats. J Clin Neurosci; 20(1):148-152.
[61] Hartmann MM, Furbass F, Perko H, Skupch A, Lackmayer K, Baumgartner C, Kluge T
(2011) EpiScan: Online seizure detection for epilepsy monitoring units. Conf Proc IEEE
Eng Med Biol Soc; 2011:6096–6099.
[62] Hauser WA, Annegers JF, Kurland LT (1993) Incidence of epilepsy and unprovoked
seizures in Rochester, Minnesota: 1935-1984. Epilepsia;
34(3):453-458.
[63] Hawkins CA, Mellanby JH (1987) Limbic epilepsy induced by tetanus toxin: a
longitudinal electroencephalographic study. Epilepsia; 28(4):431-444.
[64] He J, Hsiang H-L, Wu C, Mylvagnanam S, Carlen PL, Zhang L (2009) Cellular
mechanisms of cobalt-induced hippocampal epileptiform discharges. Epilepsia; 50(1):
99-115.
[65] Herreros J, Miralles FX, Solsona C, Bizzini B, Blasi J, Marsal J (1995) Tetanus toxin
inhibits spontaneous quantal release and cleaves VAMP/synaptobrevin. Brain Res;
699(2):165-170.
[66] Herrick IA, Craen RA, Blume WT, Novick T, Gelb AW (2002) Sedative doses of
remifentanil have minimal effect on ECoG spike activity during awake epilepsy
surgery. J Neurosurg Anesthesiol; 14(1):55-58.
Literaturverzeichnis
112
[67] Hopfengärtner R, Kerling F, Bauer V, Stefan H (2007) An efficient, robust and fast
method for the offline detection of epileptic seizures in long-term scalp EEG recordings.
Clin Neurophysiol; 118(11):2332-2343.
[68] Jefferys JGR, Evans BJ, Hughes SA, Williams SF (1992) Neuropathology of the
chronic epileptic syndrome induced by intrahippocampal tetanus toxin in rat:
preservation of pyramidal cells and incidence of dark cells. Neuropathol Appl
Neurobiol; 18(1):53-70.
[69] John JE, Baptiste SL, Sheffield LG, Gizycki H von, Kuzniecky RI, Devinsky O, Ludvig
N (2007). Transmeningeal delivery of GABA to control neocortical seizures in rats.
Epilepsy Res; 75(1):10-17.
[70] Kammerer ME (2011). Präsynaptische Wirkungen verschiedener Antiepileptika im
Neokortex der Ratte und des Menschen sowie Untersuchungen an Implantaten zur
lokalen Epilepsietherapie. Dissertation, Freiburg.
[71] Kammerer M, Rassner MP, Freiman TM, Feuerstein TJ (2011) Effects of antiepileptic
drugs on GABA release from rat and human neocortical synaptosomes. Naunyn
Schmiedebergs Arch Pharmacol; 384(1):47-57.
[72] Kessler J, Markowitsch HJ (1983) Different neuropathological effects of
intrahippocampal injections of kainic acid and tetanus toxin. Experientia; 39(8):922924.
[73] Korff CM, Scheffer IE (2013) Epilepsy classification: a cycle of evolution and
revolution. Curr Opin Neurol; 26(2):163-167.
[74] Kravljanac R, Djuric M, Jovic N, Djordjevic M, Zamurovic D, Pekmezovic T (2013)
Etiology, clinical features and outcome of epilepsia partialis continua in cohort of 51
children. Epilepsy Res; 104(1-2):112–117.
[75] Kugler J (1991). Electroencephalography 60 years later. Recenti Prog Med; 82(3):163165.
[76] Kuzniecky R, Murro A, King D, Morawetz R, Smith J, Powers R; Yaghmai F; Faught
E, Gallagher B, Snead OC (1993) Magnetic resonance imaging in childhood intractable
partial epilepsies: pathologic correlations. Neurology; 43(4):681-687.
[77] Kwan P; Brodie MJ (2000) Early identification of refractory epilepsy. N Engl J Med;
342(5):314-319.
[78] Kwan P; Arzimanoglou A; Berg AT; Brodie MJ ; Hauser WA; Mathern G; Moshe SL;
Perucca E; Wiebe S; French J (2010) Definition of drug resistant epilepsy: consensus
proposal by the ad hoc Task Force of the ILAE Commission on Therapeutic Strategies.
Epilepsia; 51(6):1069-1077.
[79] Kwan P, Schachter SC, Brodie MJ (2011) Drug-resistant epilepsy. N Engl J Med;
365(5):919-926.
[80] Lawn ND, Bamlet WR, Radhakrishnan K, O'Brien PC, So EL (2004) Injuries due to
seizures in persons with epilepsy: a population-based study. Neurology; 63(9):15651570.
[81] Lazarowski A, Czornyj L, Lubienieki F, Girardi E, Vazquez S, D'Giano C (2007) ABC
transporters during epilepsy and mechanisms underlying multidrug resistance in
refractory epilepsy. Epilepsia; 48(5):140-149.
Literaturverzeichnis
113
[82] Lee KS, Schubert P, Heinemann U (1984) The anticonvulsive action of adenosine: a
postsynaptic, dentritic action by a possible endogenous anticonvulsant. Brain Res;
321(1):160-164.
[83] Liang F, Jones EG (1997) Differential and time-dependent changes in gene expression
for type II calcium/calmodulin-dependent protein kinase, 67 kDa glutamic acid
decarboxylase, and glutamate receptor subunits in tetanus toxin-induced focal epilepsy.
J Neurosci; 17(6): 2168-2180.
[84] Liang F, Le LD, Jones ED (1998) Reciprocal up- and down-regulation of BDNF mRNA
in tetanus toxin-induced epileptic focus and inhibitory surround in cerebral cortex.
Cereb Cortex; 8(6):481-491.
[85] Löscher W (2007) Drug transporters in the epileptic brain. Epilepsia; 48(1):8-13.
[86] Löscher W (2011) Critical review of current animal models of seizures and epilepsy
used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure; 20(5):359368.
[87] Löscher W, Rundfeldt C, Hönack D (1993) Pharmacological characterization of
phenytoin-resistant amygdalakindled rats, a new model of drug-resistant partial
epilepsy. Epilepsy Res; 15(3):207-219.
[88] Löscher W, Schmidt D (2002) New horizons in the development of antiepileptic drugs.
Epilepsy Res; 50(1-2):3-16.
[89] Louis ED, Williamson PD, Darcey TM (1990) Chronic focal epilepsy induced by
microinjection of tetanus toxin into the cat motor cortex. Electroencephalogr Clin
Neurophysiol; 75(6):548-557.
[90] Ludvig N, Kuzniecky RI, Baptiste SL, John JE, Gizycki H, Doyle WK, Devinsky O
(2006) Epidural pentobarbital delivery can prevent locally induced neocortical seizures
in rats: the prospect of transmeningeal pharmacotherapy for intractable focal epilepsy.
Epilepsia; 47(11):1792-1802.
[91] Ludvig N, Baptiste SL, Tang HM, Medveczky G, von Gizycki H, Charchaflieh J,
Devinsky O, Kuzniecky RI (2009) Localized transmeningeal muscimol prevents
neocortical seizures in rats and nonhuman primates: therapeutic implications. Epilepsia;
11(4):678-693.
[92] Lüllmann-Rauch R (2009) Taschenlehrbuch Histologie: 3. Auflage, Stuttgart, New
York, NY: Thieme. S.600.
[93] Madhavan D, Mirowski P, Ludvig N, Carlson C, Doyle W, Devinsky O, Kuzniecky R
(2008) Effects of subdural application of lidocaine in patients with focal epilepsy.
Epilepsy Res; 78(2-3):235-239.
[94] Mainardi M, Pietrasanta M, Vannini E, Rossetto O, Caleo M (2012) Tetanus
neurotoxin-induced epilepsy in mouse visual cortex. Epilepsia; 53(7):132-136.
[95] Maschio M (2012) Brain tumor-related epilepsy. Curr Neuropharmacol; 10(2):124-133.
[96] McCagh J, Fisk JE, Baker GA (2009) Epilepsy, psychosocial and cognitive functioning.
Epilepsy Res; 86(1):1-14.
[97] Mellanby J, George G, Robinson A, Thompson P (1977) Epileptiform syndrome in rats
produced by injecting tetanus toxin into the hippocampus. J Neurol Neurosurg
Psychiatry; 40(4):404-414.
Literaturverzeichnis
114
[98] Mishra M, Singh R, Sharma D (2010) Antiepileptic action of exogenous
dehydroepiandrosterone in iron-induced epilepsy in rat brain. Epilepsy Behav;
19(3):264-271.
[99] Mohanraj R, Norrie J, Stephen LJ, Kelly K, Hitiris N, Brodie MJ (2006) Mortality in
adults with newly diagnosed and chronic epilepsy: a retrospective comparative study.
Lancet Neurol; 5(6):481-487.
[100] Morace R, Gennaro G, Picardi A, Quarato PP, Sparano A, Mascia A, Meldolesi GN,
Grammaldo LG, De Risi M, Esposito V (2012) Surgery after intracranial investigation
with subdural electrodes in patients with drug-resistant focal epilepsy: outcome and
complications. Neurosurg Rev; 35(4):519-526.
[101] Morales D, Marklund N, Lebold D, Thompson H, Pitkanen A, Maxwell WL, Longhi L,
Laurer H, Maegele M, Neugebauer E, Graham DI, Stocchetti N; Mc Intosh TK (2005)
Experimental models of traumatic brain injury: Do we really need to build a better
mousetrap? Neuroscience; 136(4):971-989.
[102] Morotti A, Cilloni D, Messa F, Arruga F, Defilippi I, Carturan S, Catalano R, Rosso V,
Chiarenza A,Pilatrino C, Guerrasio A, Taulli R, Bracco E, Pautasso M, Baraban D,
Gottardi E, Saglio G (2006) Valproate enhances imatinib-induced growth arrest and
apoptosis in chronic myeloid leukemia cells. Cancer; 106(5):1188-1196.
[103] Nanau RM, Neuman MG (2013) Adverse drug reactions induced by valproic acid. Clin
Biochem; 46(15):1323-1338.
[104] Nevalainen O, Raitanen J, Ansakorpi H, Artama M, Isojärvi J, Auvinen A (2013) Longterm mortality risk by cause of death in newly diagnosed patients with epilepsy in
Finland: a nationwide register-based study. Eur J Epidemiol; 28(12):981-990.
[105] Nilsen KE, Kelso AR, Cock HR (2006) Antiepileptic effect of gap-junction blockers in
a rat model of refractory focal cortical epilepsy. Epilepsia; 47(7):1169-1175.
[106] Nilsen KE, Walker MC, Cock HR (2005) Characterization of the tetanus toxin model of
refractory focal neocortical epilepsy in the rat. Epilepsia; 46(2):179-187
[107] Noebels JL, Avoli M, Rogawski M, Olsen R, Delgado-Escueta AV (2010) “Jasper’s
Basic Mechanisms of the Epilepsies” Workshop. Epilepsia; 51(5):1-5.
[108] O'Donoghue MF, Sander JW (1997) The mortality associated with epilepsy, with
particular reference to sudden unexpected death: a review. Epilepsia;
28(11):15-19.
[109] Oguni H (2011) Treatment of benign focal epilepsies in children: When and how should
be treated? Brain Dev; 33(3):207-212.
[110] Oldendorf WH (1974) Lipid solubility and drug penetration of the blood brain barrier.
Exp Biol Med; 147(3):813-816.
[111] Pack AM (2012) Falls and fractures in patients with epilepsy: Is there an increased risk?
If so, why? Neurology; 79(2):119-120.
[112] Pandian J, Thomas S, Santoshkumar B, Radhakrishnan K, Sarma P, Joseph S,
Kesavadas C (2002) Epilepsia partialis continua – a clinical and electroencephalography
study. Seizure; 11(7):437-441.
[113] Pardridge WM (2012) Drug transport across the blood-brain barrier. J Cereb Blood
Flow Metab; 32(11):1959-1972.
Literaturverzeichnis
115
[114] Paxinos G, Watson C (2007) The rat brain in stereotaxic coordinates, 6.Auflage;
Amsterdam, Boston: Elsevier.
[115] Pfäfflin M, (2011) Epidemiologie der Epilepsien – Informationsblatt der Deutschen
Gesellschaft für Epileptologie; 028.
[116] Phabphal K, Limapichat K, Sathirapanya P, Setthawatcharawanich S, Geater A (2012)
Clinical characteristics, etiology and long-term outcome of epilepsia partialis continua
in adult patients in Thailand. Epilepsy Res; 100(1-2):179-187.
[117] Picot M, Baldy-Moulinier M, Daurs J, Dujols P, Crespel A (2008) The prevalence of
epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: A population-based study in a
Western European country. Epilepsia; 49(7):1230-1238.
[118] Racine RJ (1972) Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor
seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol; 32(3):281-294.
[119] Rakhade S, Shah AK, Agarwal R, Yao B, Asano E, Loeb JA (2007) Activity-dependent
gene expression correlates with interictal spiking in human neocortical epilepsy.
Epilepsia; 48(5):86-95.
[120] Rashid S, Lee I, Anderson AE, Hrachovy RA, Swann JW (1999) Insights into the
tetanus toxin model of early-onset epilepsy from long-term video monitoring during
anticonvulsant therapy. Brain Res Dev Brain Res; 118(1-2):221-225.
[121] Rassner MP, Hebel JM, Altenmüller DM, Volz S, Herrmann L, Feuerstein TJ, Freiman
TM (2014): Reduction of epileptiform activity through local valproate-implants in a rat
neocortical epilepsy model.
Zur Veröffentlichung eingereicht.
[122] Regesta G, Tanganelli P (1999) Clinical aspects and biological bases of drug-resistant
epilepsies. Epilepsy Res; 34(2-3):109-122.
[123] Régis J, Bartolomei F, Rey M, Genton PDC, Semah F, Gastaut JL, Chauvel P, Peragut
JC (1999) Gamma knife surgery for mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia;
40(11):1551-1556.
[124] Rejdak K, Papuc E, Dropko P, Stelmasiak Z (2008) Acute stroke-elicited epilepsia
partialis continua responsive to intravenous sodium valproate. Neurologia i
Neurochirurgia Polska; 42(2):157-160.
[125] Schiavo G, Benfenati F, Poulain B, Rossetto O, Polverino de Laureto P, DasGupta BR,
Montecucco C (1992) Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter
release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature;
359(6398):832-835.
[126] Schmidt D, Stavem K (2009) Long-term seizure outcome of surgery versus no surgery
for drug-resistant partial epilepsy: a review of controlled studies. Epilepsia; 50(6):13011309.
[127] Serralta A, Barcia JA, Ortiz P, Durán C, Hernández ME, Alós M (2006) Effect of
intracerebroventricular continuous infusion of valproic acid versus single i.p. and i.c.v.
injections in the amygdale kindling epilepsy model. Epilepsy Res;
70(1):15-26.
[128] Staley K, Hellier J, Dudek F (2005) Do interictal spikes drive epileptogenesis?
Neuroscientist; 11(4):272-276.
[129] Stavem K, Bjørnaes H, Langmoen IA (2008) Long-term seizures and quality of life
after epilepsy surgery compared with matched controls. Neurosurgery; 62(2):326-334.
Literaturverzeichnis
116
[130] Stefan H, Feuerstein TJ (2007) Novel anticonvulsant drugs. Pharmacol Ther;
113(1):165-183.
[131] Stein AG, Eder HG, Blum DE, Drachev A, Fisher R (2000) An automated drug delivery
system for focal epilepsy. Epilepsy Res; 39(2):103-114.
[132] Tamargo RJ, Rosell LA, Kossoff EH, Tyler BM, Ewend MG, Aryanpur JJ (2002) The
intracerebral administration of phenytoin using controlled-release polymers reduces
experimental seizures in rats. Epilepsy Res; 48(3):145-155.
[133] Téllez-Zenteno JF, Ronquillo LH, Moien-Afshari F, Wiebe S (2010) Surgical outcomes
in lesional and non-lesional epilepsy: a systematic review and meta-analysis. Epilepsy
Res; 89(2-3):310-318.
[134] Van Dycke A, Raedt R, Dauwe I, Sante T, Wyckhuys T, Meurs A, Vonck K, Wadman
W, Boon P (2010) Continuous local intrahippocampal delivery of adenosine reduces
seizure frequency in rats with spontaneous seizures. Epilepsia; 51(9):1721-1728.
[135] Vein AA, van Emde Boas W (2010). Kozhevnikov epilepsy: The disease and its
eponym. Epilepsia; 52(2):212-218.
[136] Vreugdenhil M, Hack SP, Draguhn A, Jefferys JG (2002) Tetanus toxin induced longterm changes in excitation and inhibition in the rat hippocampal CA1 area.
Neuroscience; 114(4):983-994.
[137] Walker MC, Tong X, Brown S, Shorvon S, Patsalos PN (1998) Comparison of singleand repeated-dose pharmacokinetics of diazepam. Epilepsia;
39(3):283-289.
[138] Walton NY, Treiman DM (1988) Experimental secondarily generalized convulsive
status epilepticus induced by D,L-homocysteine thiolactone. Epilepsy Res; 2(2):79-86.
[139] Walton NY, Treiman DM (1992) Valproic acid treatment of experimental status
epilepticus. Epilepsy Res; 12(3):199-205.
[140] WHO. World Health Organization (2012) Epilepsy: epidemiology, aetiology and
prognosis. WHO Factsheet N°999.
[141] Wilde C (2013) Automatic seizure detection in rats using ECoG: a comparison of
methods: Automatische Anfallsdetektion bei Ratten mithilfe von ECoG: Ein
Methodenvergleich. Masterarbeit, Lübeck.
[142] Williamson LC, Fitzgerald SC, Neale EA (1992) Differential effects of tetanus toxin on
inhibitory and excitatory neurotransmitter release from mammalian spinal cord cells in
culture. J Neurochem; 59(6):2148-2157.
[143] Willmore LJ, Sypert GW, Munson JB (1978) Recurrent seizures induced by cortical
iron injection: A model of posttraumatic epilepsy. Ann Neurol;
4(4):329-336.
[144] Wykes RC, Heeroma JS, Mantoan L, Zheng K, MacDonald DC, Deisseroth K Hashemi
KS, Walker MC, Schorge S, Kullmann DM (2013) Optogenetic and potassium channel
gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Sci Transl Med;
4(161):161ra152.
[145] Yang TM, Lin WC, Chang WN, Ho JT, Wang HC, Tsai NW, Shih YT, Lu CH (2009)
Predictors and outcome of seizures after spontaneous intracerebral hemorrhage. J
Neurosurg; 111(1):87–93.
Literaturverzeichnis
[146] Zifkin B, Avanzini G (2009) Clinical neurophysiology with special reference to the
electroencephalogram. Epilepsia; 50(3):30-38.
117
Veröffentlichungen und Kongressbeiträge
118
Veröffentlichungen und Kongressbeiträge
Altenmüller, D.M.; Hebel, J.M.; Rassner, M.P.; Volz, S.; Freiman, T.M.; Feuerstein,
T.J.; Zentner, J. (2013): Locally Applied Valproate Enhances Survival in Rats after
Neocortical Treatment with Tetanus Toxin and Cobalt Chloride. In: BioMed Research
International.
Wilde, C.; Volz, S.; Feuerstein, T.J.; Hofmann, U.G., (2013): Automatic Seizure
Detection in Rats using ECoG: A Comparison of Methods. Posterbeitrag auf dem 86.
Kongress der deutschen Gesellschaft für Neurologie.
Rassner, M.P.; Hebel, J.M.; Altenmüller, D.M.; Volz, S.; Herrmann, L.; Feuerstein,
T.J.; Freiman, T.M. (2014): Reduction of epileptiform activity through local valproateimplants in a rat neocortical epilepsy model.
zur Veröffentlichung eingereicht.
Danksagung
119
Danksagung
Zu allererst bedanke ich mich bei meinem Doktorvater, Prof. Dr. T. J. Feuerstein, für die
Überlassung des Promotionsthemas, die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die gute,
stetige Betreuung. Mit seinem Forschergeist, seinen Fachkenntnissen, seiner Beratung und
seinen motivierenden Sprüchen hat er mich zu jederzeit unterstützt.
Bei Herrn Prof. Dr. W. A. Lagrèze bedanke ich mich für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.
Ein großer Dank geht an Dr. D. M. Altenmüller für die Einarbeitung und kontinuierliche
hochwertige Betreuung der ECoG-Auswertung.
Bei meinem Kollegen J. Hebel danke ich für die hervorragende Weitergabe des Projektes,
die Einarbeitung, die Motivation und den beständigen Austausch. Ein Dank geht ebenfalls an
M. Rassner für die gute Zusammenarbeit, die Unterstützung und Anregungen.
Des Weiteren bedanke ich mich für die Zusammenarbeit bei Dr. R. Hopfengärtner, aus der
Uniklinik Erlangen sowie der großzügigen Bereitstellung seines Programmes in der Uniklinik
Freiburg.
Ein weiterer Dank gilt C. Wilde der Universität zu Lübeck für sein Interesse an der
automatischen EEG-Auswertung, unseren Daten und der unkomplizierten Zusammenarbeit.
Außerdem möchte ich mich ganz besonders bei Frau Prof. Dr. C. Haas und ihrer
Arbeitsgruppe, sowie K. Somerlik-Fuchs und S. Lubojansky für die Unterstützung, die
Mitbenutzung ihrer Arbeitsmaterialien, sowie die guten gemeinsamen wöchentlichen
Forschungsseminare bedanken.
Prof. Dr. T. Steinberg der Abteilung für Orale Biotechnologie der Universitätsklinikum
Freiburg danke ich für die Herstellung der Hydrogel-Polymere.
Ein großes Dankeschön gilt besonders meiner Familie, meinen Freunden und meinem
Freund, die mich jederzeit zuhörend gestärkt und in allen Lebenslagen unterstützt haben.
Insbesondere danke ich meinen Eltern für die großzügige Unterstützung während des
gesamten Studiums und der Ermöglichung eines Forschungssemesters. Ausdrücklich danke
ich auch U. Völkl für die kontinuierliche Rechtschreib- und Grammatikkorrektur.
Lebenslauf
120
Lebenslauf
Die Seite 120 (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Sie ist deshalb nicht Bestandteil der
Online-Veröffentlichung.
Anhang
121
Anhang
Protokoll der Nissl-Färbung
U
Kurz Schwenken in Essigwasser, (H2O bidest mit 1-2 Tropfen Essigsäure)
20 min in 0.1 % Cresyl-Violett Farbe
Kurz Schwenken in Essigwasser
1 min in 70 % Ethanol
1 min in 90 % Ethanol
1 min in 100 % Ethanol
5 min in Xylol I
5 min in Xylol II
Eindeckeln in Hypermont
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