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Haploide Pflanzen - Gewächshauslaborzentrum Dürnast

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Gewebekultur
Dr. Susanne Rühmann
Fachgebiet Obstbau
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat)
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat)
Knospen
Wurzeln
Antheren/Pollen /Samenanlage
Internodien
Sämling
Blätter
Samen
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
Oberflächen
sterilisiertes
Explantat
Natrium hypochlorit
oder/und Ethanol
autoclaviertes
(sterilisiertes)
Wasser
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium)
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium)
1.
Makro Nährstoffe (N, P, K, Mg, Ca)
2.
Mikro Nährstoffe (Spurenelemente)
3.
Vitamine, Aminosäuren
4.
Kohlehydrate (Zucker)
5.
Phytohormone
6.
Agar-agar; Gelrite (zur Verfestigung)
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium)
Agar Agar;
Gelrite
kochen
Nährlösung
+ Agar Agar
Nährlösung
In
Kulturröhrchen
abfüllen
Autoklavieren der Kulturgefäße (121°C für 20 min)
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium) unter sterilen Bedingungen
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium) unter sterilen Bedingungen
Filter
Glass-schub
Arbeitsfläche
Gewebekultur
Isoliertes Pflanzenmaterial (Explantat) wird Oberflächen-sterilisiert
und kultiviert außerhalb des intakten Pflanzenorganismus auf / in
sterilem Kulturmedium (Nährmedium) unter sterilen Bedingungen
kontrollierte
Bedingungen
www.bfhwsd.de/biotechn
ologische_arbeiten.htm
z.B.
16h Licht,
23 / 19°C
Wozu braucht man die Gewebekultur oder
pflanzliche Zellkultur?
• Eliminierung von Krankheiten (Pilze, Bakterien, Viren)
• Pflanzenvermehren mit hoher Vermehrungsrate
• Archivierung und Lagerung von Zuchtklonen oder wichtigen
Sorten
• Züchtung
• Produktion von Pflanzenstoffen (ätherische Öle, Secondäre
Pflanzenstoffe, Karotinoide, Anthocayne …)
• Wissenschaftliches Model System
Voraussetzungen: Totipotenz/Omnipotenz
von Pflanzenzellen
Totipotenz:
Fähigkeit von einer Zelle sich zu jeder beliebigen Zelle, Gewebe oder sogar zu einem
ganzen Organsmus zu regenerieren
– Menschen und Tiere => nur embrionale Zellen sind maximal totipotent bis zu
einer Zellteilungsphase von 4-8-Zellen
– Pflanzen => alle Pflanzenzellen sind totipotent?
(Hypothese: Gottlieb Haberland 1902)
Voraussetzungen: Totipotenz/Omnipotenz
von Pflanzenzellen
Totipotente Pflanzen Zellen:
• nicht-differenzierte Zellen
– meristematische Zellen in
• Knospen (vegetative / generative)
• Wurzeln
• Pollen / Samenanlagen
• Borken-Meristem
• Schlafende Knospen
Voraussetzungen: Totipotenz/Omnipotenz
von Pflanzenzellen
Totipotente Pflanzen Zellen:
• De-Differenzierung von Pflanzenzellen
=> Entwicklung von sekundärem Meristem
– Phloem Zellen (Daucus carota 1958 F.C. Steward)
– Mark Gewebe (Nicotiana 1962 A.C. Hildebrandt)
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei
Bäumen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei
Bäumen
Kallus: nicht differenzierter Pflanzen-Zell-Komplex (parenchymatisch) mit nicht
gerichtetem Wachstum. Die Bildung von Kallus wird verursacht durch:
–
Verwundung (Schnitt, Verwundung durch Insekten oder Fraß ,
Windbruch, …)
=> Kallus verschließt die Wunden (Narben-Gewebe)
–
Holzpflanzen (lignifizierte) Pflanzen: Kallus hautsächlich aus Kambium
–
Krautige Pflanzen: Kallus hauptsächlich aus dem Parenchym
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei Bäumen
• 1838/39: M.J. Schleiden und T. Schwann
– Zelltherorie (Hypothese): Zelle als Basismodule von allen lebenden Individuen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1756: Duhamel du Monceau
– Beschreibt die Bildung von Kallus und Wundheilung bei Bäumen
• 1838/39: M.J. Schleiden und T. Schwann
– Zelltherorie (Hypothese): Zelle als Basismodule von allen lebenden Individuen
• 1902: Gottlieb Haberlandt
– erste (nicht wirklich erfolgreich) praktische Versuche von Einzelzellen, die auf
einem synthetischen (künstlichen) Medium
kultiviert wurden [theoretisch möglich]
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1922: Kotte (D) bzw. Robbins (U.S.A.)
– Verwendung von meristematischen Zellen aus Wurzelspitzen (apex) und
Knospen
• Kotte: Wurzeln wachsen 2 Wochen, keine Subkultur
• Robbins: Subkulturen von Wurzelkulturen ; Initiation von Sprosswachstum aus
Knospen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
• 1935 Snow
– IAA (Indolessigsäure) stimuliert die Aktivität von Kambium
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
• 1935 Snow
– IAA (Indolessigsäure) stimuliert die Aktivität von Kambium
• 1939 White, Nobécourt, Gautheret (unabhängig)
– Möglichkeit einer unlimitierten Vermehrung von Pflanzenmaterial (Karotten)
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1924 Blumenthal und Meyer
– Entwicklung von Kallus aus Wurzel-Explantaten von Karotten (Daucus carota)
• 1935 Snow
– IAA (Indolessigsäure) stimuliert die Aktivität von Kambium
• 1939 White, Nobécourt, Gautheret (unabhängig)
– Möglichkeit einer unlimitierten Vermehrung von Pflanzenmaterial (Karotten)
• 1948 Caplin und Steward
– Nutzung von Kokusnussmilch für die Vermehrung von
in vitro Pflanzen
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1957 Skoog und Miller
– Isolation von Kinetin aus autoclaviertem Hefe-Extrakt
=> induziert in Kombination mit Auxin (IAA) die Vermehrung von Tabakzellen
of tobacco cells
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1957 Skoog und Miller
– Isolation von Kinetin aus autoclaviertem Hefe-Extrakt
=> induziert in Kombination mit Auxin (IAA) die Vermehrung von Tabakzellen
of tobacco cells
• 1962 Murashige und Skoog
– Entwicklung von in vitro Kultur-Medium; bis heute am häufigsten verwendet
(modifiziert)
Quelle: Gautheret 1985
Geschichte der Gewebekultur
• 1957 Skoog und Miller
– Isolation von Kinetin aus autoclaviertem Hefe-Extrakt
=> induziert in Kombination mit Auxin (IAA) die Vermehrung von Tabakzellen
of tobacco cells
• 1962 Murashige und Skoog
– Entwicklung von in vitro Kultur-Medium; bis heute am häufigsten verwendet
(modifiziert)
• 1966 Guha und Maheshwari
– Produktion von haploiden Pflanzen aus Datura innoxia Antheren
botany.csdl.tamu.edu
Datura sp. - Cultivated, from Floriculture
Quelle: Gautheret 1985
Pflanze
intaktes
Meristem
fig5.jpeg
aggie-horticulture.tamu.edu
442 × 368 - ... or fungal) are
physically selected as the explant
for tissue culture
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Knospe
Wurzel
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
www.excellup.com/.../tissuesnine.aspx
Quelle: Neumann 1995
Pflanze
intaktes
Meristem
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
technivit.pagespersoorange.fr/GBindex.ht
m
Intakte Pflanzen
www.thisnext.com/tag/
plants
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
Allium
canadense
www.plantbuzz.com/
allium/Culti/im_prop.
htm
Blatt, Brutknospe
meristematische
Kulture
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Kalanchoe
online-media.unimarburg.de/.../Verme
hrung.html
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
Brutknospe
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
www.dsmz.de/dsmz/main.php?content_id=65
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
www.cactus-art.biz/.../dictionary_callus.htm
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Bewurzelung
Pflanzen Explantat => Spross- und Wurzel-Regeneration
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
generalhorticulture.tamu.edu/YouthAdventurePr
.
www.sivb.org/edu_outreach.asp
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
..
herbalgalery.blogspot.com/2009/11/callus-is-a
Sprossbildung
Embryogenese
Bewurzelung
www.bfhwsd.de/biote
chnologische_arbeite
n.htm
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Intakte Pflanzen
Züchtung
Somatische Embryonen
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Mazeration von
frischen
Explantaten
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Züchtung
Mazeration:
Einweichen von Pflanzen-Material in
Flüssig-Medium (Nährlösung )
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Sprossbildung
www.nature.com/.../nprot.2010.144_F9.html
Bewurzelung
www.dsmz.de/dsmz/main.php?content_id=65
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Züchtung
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
www.nature.com/.../nprot.2010.144_F9.html
Embryogenese
Bewurzelung
..
herbalgalery.blogspot.com/2009/11/callus-is-a
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Intakte Pflanzen
Züchtung
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Embryogenese
Bewurzelung
FermenterKulturen
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Intakte Pflanzen
Züchtung
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Pflanze
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
wapedia.mobi/en/Bioreactors
FermenterKulturen
wapedia.mobi/en/Bioreactors
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
..
www.directindustry.com/prod/eppendorf/combine
www.biosciencetechnology.com/.../
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Zell-Suspension
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
Embryogenese
Bewurzelung
FermenterKulturen
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Intakte Pflanzen
Züchtung
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Pflanze
Enzymatische
Makeration
Zellmembran
Zellwand
Cytoplasma
Vacuole
Nucleolus
Nucleus
Chloroplasten
Mitochondrion
Pflanzen Zelle
Protoplasten
Pflanze
Enzymatische
Makeration
Protoplasten
Zellmembran
Zellwand
Enzyme
Cytoplasma
Vacuole
Nucleolus
Nucleus
+
Chloroplasten
Mitochondrion
Pflanzen Zelle
Protoplast
löst die Zellwand auf
Pflanze
A
B
Enzymatische
Makeration
www.freewebs.com/deebio111l/lab6.htm
Protoplasten
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
(auch bei nicht kreuzbaren Arten möglich)
Pflanze
Enzymatische
Makeration
www.freewebs.com/deebio111l/lab6.htm
Protoplasten
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
de.wikipedia.org/wiki/Protoplast
H.-U. KOOP, H.-G. SCHWEIGER, 1985
Pflanze
Enzymatische
Makeration
www.freewebs.com/deebio111l/lab6.htm
Protoplasten
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
www.sciencephoto.com/media/156406/enlarge
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Enzymatische
Makeration
Zell-Suspension
Embryogenese
Protoplasten
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
Bewurzelung
FermenterEmbryogenese
Kulturen
Intakte Pflanzen
Pflanzen Vermehrung
Quelle: Neumann 1995
Intakte Pflanzen
Züchtung
Intakte Pflanzen
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Mikrosporen Kultur
Pflanze
intaktes
Meristem
Explantat
meristematische
Kulture
Kallus
Bildung
Sprossbildung
Mazeration von
frischen
Explantaten
Enzymatische
Makeration
Zell-Suspension
Embryogenese
Antheren
Mikro-Sporen
Kultur
Protoplasten
Kallus
Bildung
Embryogenese
Fusion/Absorbtion
von fremd-DNA
Sprossbildung
Bewurzelung
Fermenter- Embryogenese
Kulturen
Bewurzelung
Intakte Pflanzen
Intakte Pflanzen
Intakte Pflanzen
Züchtung
Pflanzen Vermehrung
source: Neumann 1995
Intakte Pflanzen
Produktion von
Pflanzen-Substanzen
Antheren Kultur
Blüte
source: Heß 1992
Anthere
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
Antheren Kultur
source: Heß 1992
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
Antheren Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
haploider kallus
source: Heß 1992
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
Antheren Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
haploid callus
haploider
kallus
Differezierung des Kallus
source: Heß 1992
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
Antheren Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
haploider kallus
Differezierung des Kallus
source: Heß 1992
Haploide Pflanze
Pfeffer (Capsicum annuum)
Anther-Kultur und Regeneration von haploiden Pflanzen:
(a) Anthere am Anfang der Kultur.
(b) Anthere nach 6 Tagen Kultur.
(c, d) Embryonen entwickeln sich aus Antheren nach 30 days Kultur,
zeigen Wurzeln (c)
und Sprosse (d).
(e–g) Pflänzchen mit Kotyledonen
(e) und mit Blättern
(f, g) subkultiviert in Wachstumsmedium.
(h) 80-Tage-alte, regenerierte haploide Pflanzen aus Antheren (links)
und eine diploide Kontrolle im gleichen Alter (rechts).
Skalierung:
(a–d), 2.5 mm; in (e–h), 5 mm.
www.biolcell.org
Biology of the Cell (2006) 97, 709-722
Pollen Kultur
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
Antheren Kultur
Pollen Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
haploider kallus
Differezierung des Kallus
source: Heß 1992
Haploide Pflanze
Pollen Kultur
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Antheren Kultur
Pollen Kultur
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
haploider kallus
Differezierung des Kallus
source: Heß 1992
Haploide Pflanze
Pollen Kultur
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Antheren Kultur
Pollen Kultur
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
Pro-Embryo
haploider kallus
Differezierung des Kallus
source: Heß 1992
Haploide Pflanze
Pollen Kultur
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Antheren Kultur
Pollen Kultur
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
Pro-Embryo
haploider kallus
Embryo
source: Heß 1992
Embryo aus
Pollen
Differezierung des Kallus
Haploide Pflanze
Pollen Kultur
Antheren Kultur
Blüte
Anthere
isolierte Pollen Pollen-Vorstufe und Pollen
Antheren Kultur
Pollen Kultur
Kultur
Vielzellige Pollen-Kultur
haploide Embryonen Kallus aus Anthers
aus Anthers
Pro-Embryo
haploider kallus
Embryo
source: Heß 1992
Embryo aus
Pollen
Differezierung des Kallus
Haploide Pflanze
Haploide Pflanzen:
• In der Natur vorkommend:
• Bilden sich spontan bei:
• Tomaten, Baumwolle, Kaffee, Rüben, Bohnen, Flax, Kokusnuss, Perlhirse, Weizen,
• Methoden zur Iinduktion von haploiden Pflanzen:
1. interspezifische und intergenetische Hybridisierung
2. Bestrahlung und chemische Behandlung
3. Anther und Pollen Kultur
Wozu werden haploide Pflanzen benötigt?
•
Es gibt in der Züchtung viele Probleme:
•
Bei Genverschmelzungen (=> Offsprings from a cross)
=> hohe genetische Variabilität
•
(Mono-)Haploide Pflanzen besitzen nur ein Basis-Genome (x)
Vorteile von haploiden Pflanzen in der Züchtung?
•
rezessive Mutationen werden sichtbar
•
Kleinere Pflanzen (bei Zierpflanzen erwünscht)
•
Längere Blüte (bei Zierpflanzen erwünscht)
•
Kürzere Produktionszeit bis zur Reife
•
Direkte Entwicklung von homozygoten Individuen
•
Basis-Material für doppelt-haploide Pflanzen (Homodiploide)
Aber: in haploiden Pflanzen:
•
Meiose ist sehr ungleichmäßig
•
Bei der Metaphase I ist der Spindelapparat sehr unorganisiert. Bei der Anaphase I ist die
Verteilung der Chromosomen zu den entgegengesetzten Polen teilweise ungeordnet
•
Nachkommen von Doppel-Haploiden Pflanzen sind dagegen bei allen wichtigen Merkmalen
genetisch gleichmäßiger.
Diploid plants:
meiosis
plants (2n)
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
Diploid plants:
meiosis
meiosis
meiosis 2. div.
meiosis 1. div.
plants (2n)
gametes
Chromitin forming
div. = division
N=2
A: father
a: mother
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
pairing of
homologous
chromosome
N=1
Diploid plants:
meiosis
plants (2n)
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
Diploid plants:
Haploid plants:
X
meiosis
meiosis
no generative
multiplication possible
plants (n)
plants (2n)
wesleyliu12.blogspot.com/2011/05/blog-11-get-..
pollen culture
anther culture
cold treatment
flower
anther
isolated pollen pre-stage and pollen
anther culture
anther culture
heterozygotic diploid
plant
culture
multicellular pollen culture
Diploid plants? haploid embryons
(double haploid) from anthers
callus from
anthers
pro-embryos
haploid callus
embryos
source: Heß 1992
embryo form
pollen
haploid plant
differetiated callus
diploid plants
N=2
Replication
crossingover
haploid 4x
N=1
diploid plants
N=2
Replication
crossingover
haploid 4x
N=1
crossingover
haploid 4x
N=1
Double haploid plants
2xN=1
Replication
Benefits of double-haploid plants:
•
Conventional inbreeding procedures (di- or polyploid plants)
 six generations to achieve approximately complete homozygous plants
•
doubled haploidy
 one generations to achieve approximately complete homozygous plants (identical gen-sets)
•
•
Potential to produce cultivars earlier
•
more efficient screening for grain quality and disease resistance
Tetra-ploide plants => microspore culture
 Develop diploid plants (be important for breeding programs that involve diploid wild types)
•
Poly-ploide plants => microspore culture
 Reduction of chromosome set (important for breeding)
Doubled Haploids:
•
Methods of doubled haploid induction in plant species:
1. Production of haploid embryos by
•
Parthenogenesis (in vivo)
•
Pseudogamy (in vivo)
•
Chromosome elimination after wild crossing (in vivo)
•
gynogenesis (ovary and flower culture) and androgenesis (anther and microspore
culture) (in vitro)
2. chromosome-doubling produces doubled haploids
pollen culture
anther culture
cold treatment
flower
anther
isolated pollen pre-stage and pollen
anther culture
anther culture
heterozygotic diploid
plant
culture
multicellular pollen culture
double haploid
pro-embryos
haploid embryons
from anthers
callus from
anthers
Colchicin treatment
haploid callus
embryos
source: Heß 1992
embryo form
pollen
haploid plant
differetiated callus
Colchicin:
Property: toxic alcaloid
Occurence: seeds, flowers, Knolle,
leaves of Herbstzeitlose (Colchicum
autumnale)
Effect of Colchicin:
•
induce embryogenesis
•
doubled haploids
•
In situ and in vitro (seedlings, plamtlets)
•
Mode of action as mitose inhibitor
1. Disruption of mitotic cell division => inhibiting the formation of spindle fibers and
polar migration of chromosomes (colchicin ligates to microtubuli subunits)
(Metaphase)
2. No separation of doughter-chromatids caused by missing spindle fibers (Anaphase)
3. At cell division => 1 cell with nucleus 1 cell without nucleus (nonviable)
4. First cell doubeling of chromatides (Interphase) => polymerisation
problems:
•
Not all organs show doubling in the same degree
•
Zea maize => doubling chromosome number in the tassel or the ear, but often not in both,
which will make self-pollination impossible (Wan et al., 1989)
•
high mortality
•
abnormal plant development
Alternatives:
•
doubling before plantlet regeneration
•
colchicine treatment of embryogenic, microspore-derived haploid calli => stable doubled-
haploid maize plants at high frequency (Wan et al. (1989) and Wan and Widholm (1995))
•
colchicine together with a 7-days cold shock to cultured maize anthers => increase in
chromosome doubling in microsporederived plants (Saisingtong et al., 1996; AntoineMichard and Beckert, 1997).
•
pollen culture
anther culture
cold treatment
flower
anther
isolated pollen pre-stage and pollen
anther culture
anther culture
heterozygotic diploid
plant
culture
multicellular pollen culture
double haploid haploid embryons
from anthers
plant
pro-embryos
callus from
anthers
Colchicin treatment
haploid callus
embryos
source: Heß 1992
embryo form
pollen
haploid plant
differetiated callus
pepper (Capsicum annuum)
Anther culture and haploid plants regeneration:
(a) Anther at the onset of the culture.
(b) Anther after 6 days in culture.
(c, d) Embryos emerging from the anthers after 30 days in culture,
showing roots (c)
and shoots (d).
(e–g) Plantlets with cotyledons
(e) and with leaves
(f, g) subcultured in growing medium.
(h) 80-day-old regenerated haploid plant from anther culture (lefthand side) and a diploid control of the same age (right-hand side).
Scale bars in
(a–d), 2.5 mm; in (e–h), 5 mm.
www.biolcell.org
Biology of the Cell (2006) 97, 709-722
First stages of microspore-derived embryogenesis
Cellular organization (a–g, k–l) and starch cytochemistry (h–j).
Semi-thin sections observed under light microscopy.
(a) Vacuolated microspores contained in the anthers at the
time of setting the cultures;
(b) two-celled pro-embryos, showing similar cells and the
formation of a cell wall between them;
(c) multicellular pro-embryos surrounded by the exine (Ex);
(d) multicellular pro-embryos being released as the exine
breaks down (arrows);
(e–j) progression from multicellular pro-embryos to globular
embryos,
(e–g) observed under phase-contrast
(h–j)and bright-field microscopy after I2KI staining to reveal
starch.
(k) Heart-like microspore-derived embryo showing a
peripheral protodermis.
(l–m) High-magnification micrographs showing the
protodermis of microspore-derived (l) and zygotic (m)
embryos. Scale bars, 10 mm.
www.biolcell.org
Biology of the Cell (2006) 97, 709-722
ONTOGENETIC EVENTS IN ANDROGENESIS OF
BRAZILIAN BARLEY GENOTYPES
SILVA, A. L. S. da,1 MORAES-FERNANDES, M. I.2 and FERREIRA, A. G.3
www.scielo.br/scielo.php?pid=S0034-7108200000
...
(a): first mitotic division of a microspore (1250x)
(b): multicellular pollen grain after 12 days in culture, containing 12 cells, separated by cell wall (200x)
(c):globular pro-embryos liberated from inside the anthers after the rupture of the exine (200x)
(d) Longitudinal cut through an isolated embryo (100,8x)
(e) Petri dish with cultured anthers showing the induction of androgenetic structures which give rise to plantlets in the same
medium
(f) plantlets
Induction stage
Different stages in the development of the
unpollinated ovaries culture of durum wheat
and production of fertile doubled haploids
plant:
(a) Ovary after 2 weeks in induction
medium in the dark at 27°C
(b) Callus obtained after 6 weeks
of in vitro induction culture
Development stage
Regeneration stage
(c) Callus with green shoots obtained after
3 weeks in differentiation medium with a 16-h
photoperiod at 25°C
(d) Green plantlets regenerated after 4 weeks
in development medium with a 16-h
photoperiod
Gewebekultur, in vitro Kultur
Dr. Susanne Rühmann
Fachgebiet Obstbau
Pflanzliche Gewebekultur:
• Wachstum von Gewebe und/oder Zellen separiert vom Gesamtorganismus
(Embryos, Seitenknospen oder Wurzeln, Blätter, Kallus, Pflanzen-Zellen,
Protoplasten)
• Kultivierung auf synthetischem Nährmedium
• flüssig
• halbfest
• fest
• Pflanzen leben unter sterilen Bedingungen
• Pflanzen leben unter kontrollierten Umweltbedingungen (Licht, Temperatur, Luft, …)
Wein (Vitis vinifera)
Yaroslav Shevchenko TU-ForscherInnen
Stevia-Pflanzen
• Wird seid mehr als 20 Jahren verwendet
• Methode zur Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
• Methode zur Züchtung (Hybrid-Züchtung)
• Methode zur Lagerung und Archivierung von Pflanzen-Sorten (Genbank)
• Spezial Methoden ….
Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
Vorteile der Gewebekultur
Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
• Vermehrung in kurzer Zeit
• Viele Pflanzen mit gleicher Qualität (Massenvermehrung auf kleinem Raum
möglich)
• Pathogenfreie Pflanzen
• Einfach zu transportieren, auch über Landesgrenzen hinweg
Vorteile der Gewebekultur
Vermehrung von (wichtigem) Pflanzenmaterial
• Vermehrung in kurzer Zeit
• Viele Pflanzen mit gleicher Qualität (Massenvermehrung auf kleinem Raum
möglich)
• Pathogenfreie Pflanzen
• Einfach zu transportieren, auch über Landesgrenzen hinweg
Aber
Erstellung von Gewebekultureinrichtung braucht:
• Hohe Investitionskosten
• Erfahrungen im Umgang mit der Technik
• Platz zur Kultivierung
• Zeit zur Optimierung der Kulturbedingungen
Vermehrung und Züchtung
Vermehrung und Züchtung
Massenvermehrung
• In vitro Zellkulturen
 Regeneration von vielen Pflanzen mit identischem genetischen Material
• Knospen aus Blattachsel aus der Kartoffelnolle
 Innerhalb von 10 Monaten
 10.000 Knollen
Kombination von nicht (schlecht) kompatiblen Pflanzen
• Fusion von Pflanzenzellen [ohne Zellwand (Protoplasten)] von
unterschiedlichen Pflanzen
 Systematische Kombination von Genen (auch von Pflanzen, die sich unter
natürlichen Umständen nicht (nicht so einfach) kreuzbar sind
Herstellung von homozygoten Pflanzen ohne extensive Rückkreuzung
• Kultur von Pollen
 Herstellung von Pflanzen mit halber Ploidität
(diploide Pflanzen (haploide Pollen) => haploider Kallus)
 Regeneration zu diploiden Pflanzen (homozygot)
(haploider Kallus => haploide Pflanzen => diploide Pflanzen (Colchizin))
Erhaltung von Zuchtklonen
Herstellung von gesunden Pflanzen
 Erdbeeren, Kartoffeln, … => weisen viele Krankheiten auf (Viren, bodenbürtige
Pilze, Bakteriosen)
in der Industrie immer bedeutsamer
Firma (Gemany)
Obst und Gehölze
Baumschulen Oberdorla GmbH
•
•
•
Massenvermehrung
Virusfreiheit
Somatische Embryogenese
Reinhold Hummel GmbH+Co.KG
Erdbeerzüchtung,
Gewebekulturlabor,
Pflanzenproduktion
•
•
•
•
•
Beeren
Gehölze
Zierpflanzen
in vitro Vermehrung
in vitro Lagerung (Genbank)
www.hummel-invitro.de
Institut für Pflanzenkultur
•
•
•
•
Massenvermehrung
Methodenentwicklung
In vitro Selektion (Züchtung)
Gehölze
www.pflanzenkultur.de
Robert Mayer Gartenbau Gewebekulturen
• Massenvermehrung
• Zierpflanzen
• Beeren
www.RobertMayer.de
Piccoplant Mikrovermehrungen
GmbH
•
•
•
•
•
www.piccoplant.de
Rhododendron
Syringa (Flieder)
Bamboo (Bambus)
Graminaceous (Gräser)
Herbaceous perennial (Stauden)
und Gehölze
www.baumschulen-oberdorla.de
biotec@baumschulen-oberdorla.de
Firma (Gemany)
Zierpflanzen
Hubert Brandkamp Jungpflanzen
Gärtnerei
Homepage: www.brandkamp.de
fischer@brandkamp.de
•
•
•
•
•
Chrysanthemen
Beet- und Balkonpflanzeben
Mutterpflanzen
Massenvermehrung
Langzeitlagerung
Willi Endisch GbR
•
•
•
•
•
Pelargonien
Neuguinea-Impatiens
Meristem Vermehrung
in vitro cloning
in vitro pathogen screenig
Dr. Haas von Schmude
Gartenbaulabor
Orchidaceae
Fritz Hark Orchideen GmbH & Co. KG
Orchidaceae
www.hark-orchideen.de
Klemm und Sohn GmbH & Co. KG
Jungpflanzenbetriebe
•
•
•
•
a.stoever@selectaklemm.de
Robert Mayer Gartenbau Gewebekulturen
• Massenvermehrung
• Zierpflanzen
www.RobertMayer.de
Frank Silze Jungpflanzen
• Pelargonium
www.silze.de
Steri Plant GmbH
• Orchideen
• Anthurien
www.steri-plant.de
Petunia
Gerbera
in vitro Lagerung
Beet- und Balkonpflanzeben
www.geranien-endisch.de
pagel@geranien-endisch.de
Firma (Gemany)
Landwirtschaftliche Kulturen
Bioplant Biotechnologisches
Forschungslabor GmbH
Solanum tuberosum (Kartoffel)
Homepage: www.bioplant.de
GHG-Saaten GmbH
• Asparagus (Spargel)
• Massenvermehrung
info@aschersleben-saaten.de
Planta GmbH
• Landwirtschaftliche Kulturen
• Haploide Pflanzen
• In vitro Lagerung
www.kws.com
Saaten-Union Biotec GmbH
• Landwirtschaftliche Kulturen
• Antheren-/Mikrosporen Kulturen
• Haploide Pflanzen
www.saaten-union-biotec.com
Firma (Gemany)
Pharmacie
BioPlanta GmbH
Pharmazeutische Wirkstoffe
www.bioplanta-leipzig.de
Boehringer Ingelheim Pharma GmbH
& Co. KG
A Feinchemikalien PE
Phytochemikalien
Pharmazeutische Wirkstoffe
rothauer@ing.boehringeringelheim.com
Institut für Pflanzenkultur
•
•
•
•
Massenvermehrung
Methodenentwicklung
In vitro Selektion
Pharmaceutische Pflanzen
www.pflanzenkultur.de
PHARMAPLANT Forschungs- u.
Saatzucht GmbH
•
•
•
•
•
Massenvermehrung
Kallus / Embryogenese
Lagerung
Optimierung von Medien
Eliminierung von Pathogenen in
pharmaceutischen Pflanzen
www.pharmaplant.de
Firma (Gemany)
Wasserpflanzen
BioPlanta GmbH
Wasserpflanzen
www.bioplanta-leipzig.de
Grenzland Produktions- und Handels
GmbH Zweigstelle Rhede
• Anthurium
• Wasserpflanzen
grenzlandinvitro@t-online.de
Rainer Dietz
Wasserpflanzen
World Aquatic Ecosystem Sdn Bhd
Wasserpflanzen
Firma (international)
culture
country
BioTree
• Paulownia
Bulgaria (Sofia)
Sun Agrigenetics PVT. LTD.
• Tindora
• Lemon
• Ornamental plants: Cordyline; Ophiopogon; Gerbera;
Hosta; ornamental Banana; Rosa; Anthurium
India
A– One Biotech & Tissue Culture Pvt.
•
•
•
•
India
Sristi Agro Biotech Private
• Pinapple
India
Sri Balaji Biotech (Grand Naine B.; Red
B., Hill B.)
•
•
•
•
•
•
India
Cadila pharmaceuticals Limited
• teak
India
Aqua Princess Co
• Water plants
• Anubias barteri var nana
Thailand
Philodendron
Banana
Spathyphyllum
Syngonium
Sucrane
Cordyline australis
Cordyline terminalis
Limonium Caspia Hyb. (Blue Diamonnd)
Stevia rebaudiana
Vanilla
Banana
Cadila pharmaceuticals Limited
Bio green plant
Tissue culture project
IITA
Nusantara biotech enterprise
Sri Balaji Biotech (Grand Naine B.; Red B., Hill B.)
Agro-Genetic Technologies LTD (
Sristi Agro Biotech Pvt. Ltd. (India)
Thiruvensun bio botanica (India)
•
•
•
•
•
•
•
Bananas
Coffee
Tea
cassava
Yams
Ornamentals
forest trees
Uganda (Africa)
Clonal Solutions Australia Pty. LTD
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Acacia mangium hybrids
Australia
Banana
Cocoa
Coffee
E. grandis x E. camaldulensis
Indian Sandalwood (Santalum album)
Khaya (African Mahogany)
Pongamia (Millettia)
Teak
tropical plant tissue culture , moss plants, plant culture, orchids tissue
culture, teak plants, aquarium plant tissue culture
Shanghai (China)
Dazhong flower
plant tissue culture
Tropical plants, orchids, aquarium plants
Trade and Market:
• North America, Southeast Asia, Oceania, Eastern Asia, Western Europe
• Total annual sales volume: US $ 10 Million – US $ 50 Million
• Total Annual Purchase Volume:US $ 2.5 Million – US $ 5 Million
Universitäten (Germany)
Rhein. Friedr.-Wilh.Universität (Bonn)
Institut für
Nutzpflanzenwissenschaften
und Ressourcenschutz
(INRES), Bereich Pflanzen- und
Gartenbauwissenschaften
Meristemkultur
Leistungsprüfung
Pathogeneliminierung
53121 Bonn
www.uni-bonn.de
Technische Universität
München (TUM)
Wissenschaftszentrum
Weihenstephan
Gewächshauslaborzentrum
Dürnast
Mikrovermehrung
Somatische
Embryogenese
Transformation
85350 Freising
www.wzw.tum.de/ghl
Universität Freiburg
Pflanzenbiotechnologie / ZAB
Physcomitrella patens
Transformation
Massenvermehrung
Mutantenanalyse
Kryokonservierung
79104 Freiburg
www.plant-biotech.net/
Universität Hamburg
Biozentrum Klein Flottbek &
Botanischer Garten
Phalaenopsis
Gentiana
Temporary Immersion System
Somatische Embryogenese
Sproßvermehrung
22609 Hamburg
www.unihamburg.de/fachbereicheeinrichtungen/biologie/index.h
tml
Universität Hohenheim
Institut für Pflanzenzüchtung,
Saatgutforschung u.
Populationsgenetik
Transformation
Massenvermehrung
Apfel
Mais
Hopfen
70599 Stuttgart
http://www.unihohenheim.de/biotechnologie
Justus-Liebig-Universität
(Gießen)
Institut für Phytopathologie &
Angew. Zoologie (IPAZ)
Transgene Pflanzen
Impfmöhre/Hypoallergene
Möhren
Somatische Embryogenese
35392 Gießen
Homepage: www.unigiessen.de/ipaz
Universitäten /Hochschulen
(Germany)
Humboldt-Universität (Berlin)
Institut für Biologie
In vitro Kultur Zier-,
Forstpflanzen
Somatische Embryogenese
Protoplastentechniken
Gentransfer, Physiologie
Kryokonservierung
10115 Berlin
Inst.f.
Gartenbauwissenschaften AG
Vermehrungstechnologie/Bau
mschulwesen
Gehölzvermehrung
Rejuvenilisierung
Akklimatisation
Leistungsprüfung
14195 Berlin
www.agrar.huberlin.de/struktur/institute/np
tw/ugb
LFG gärtnerische
Pflanzensysteme
Kryokonservierung
Somatische Embryogenese
Haploidenkultur
Einfluß physikal. Faktoren
Mikrovermehrung
14195 Berlin
www.agrar.huberlin.de/struktur/institute/np
tw/gpfs
Fachhochschule Hannover
Fak. II, Abt.
Bioverfahrenstechnik,
FG Produktion NawaRo
Organogenese, Rhizogenese
Histol. + Cytogen.
Untersuchungen
30453 Hannover
www.fakultaet2.fhhannover.de
Fachhochschule Osnabrück
Fachgebiet Pflanzenzüchtung
und Saatguterzeugung
Hochschule Wismar
Fakultät für
Ingenieurwissenschaften
Fachgebiet
Biochemie/Biotechnologie
49090 Osnabrück
www.aw.fh-osnabrueck.de
Arbeitsgebiete
in vitro Kultivierung
Temporäre
Immersionssysteme
23952 Wismar
Fax: 03841-753 132
Leibniz-Institut
Gemüse- und Zierpflanzenbau
Großbeeren-Erfurt e.V.
Somatische Embryogenese
Physiologie, Histologie,
Cytogenetik
Genexpressionsanalysen
Qualität
Cyclamen
99189 Erfurt-Kühnhausen
www.igzev.de
Pflanzengenetik und
Kulturpflanzenforschung (IPK)
Kryokonservierung
In vitro Genbank
Meristemkultur
Allium / Gemüse
Heil- / Gewürzpflanzen
6466 Gatersleben
www.ipk-gatersleben.de
Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und
Zellkulturen
Kryokonservierung
Phytopharming
38124 Braunschweig
www.dsmz.de
Geschäftsstelle des ADIVK
c/o Institut für Pflanzenkultur
29465 Schnega
www.adivk.de
Bayer. Landesanstalt für
Landwirtschaft
Institut für Pflanzenbau und
Pflanzenzüchtung IPZ
Antherenkultur
Embryokultur
Protoplastenfusion
Gentransformation
Genomanalyse
85354 Freising
www.LfL.bayern.de
Johann Heinrich von ThünenInstitut (vTI)
Institut für Forstgenetik
Forstgehölze
Methodenprüfung
Versuchspflanzenanbau
Risikobeurteilung
15377 Waldsieversdorf
www.vti.bund.de/de/institute/
fg
Max-Planck-Institut
Züchtungsforschung
50829 Köln
Julius-Kühn-Institut (JKI)
Institut für gartenbauliche
Kulturen
Protoplastenfusion
Embryokultur
Gentransfer
In-vitro-Verklonung
Genomanalyse
6484 Quedlinburg
www.jki.bund.de
Institut für
Züchtungsforschung an
gartenbaulichen Kulturen und
Obst
Obstgehölze
Beerenobst
Gentransfer
Genomanalyse
Kryokonservierung
1326 Dresden
www.jki.bund.de
Institut für Resistenzforschung
und Stresstoleranz
In vitro Kultur
Solanum tuberosum
Physiol. Untersuchungen
18190 Sanitz, OT GroßLüsewitz
www.jki.bund.de
Institut für Pflanzenschutz in
Gartenbau und Forst
Staatliche Forschungsanstalt
für Gartenbau an der
Hochschule WeihenstephanTriesdorf
38104 Braunschweig
www.jki.bund.de
Massenvermehrung
Pathogeneliminierung
Embryo rescue
Somatische Embryogenese
Akklimatisierung
Institut für Gartenbau, Abt.
Pflanzenschutz
Nordwestdeutsche Forstliche
Versuchsanstalt (NW-FVA)
85354 Freising
Homepage: www.hswt.de
Abt. Waldgenressourcen
Forstgehölze
Mikrovermehrung
Rejuvenilisierung
Klonprüfung
Kryokonservierung
34346 Hann.Münden
Homepage: www.nw-fva.de
Forschungsanstalt Geisenheim
Fachgebiet Botanik
in vitro Kultur
Entwicklungsbiologie
Molekulargen. Diagn.
Resistenzzüchtung
Weinrebe
65366 Geisenheim
Homepage: www.fa-gm.de
Gottfried Wilhelm Leibniz
Universität Hannover
Abt. Baumschule
Etablierung
Bewurzelung
somatische Embryogenese
Transformation
Embryo rescue
30419 Hannover
Homepage: www.baum.unihannover.de
Abt. Zierpflanzenbau
Somatische Embryogenese
Protoplastentechniken
In-vitro-Kultur
Transformation
30419 Hannover
Homepage: www.zier.unihannover.de
Institut für Biologische
Produktionssysteme
Fachgebiet Biosystem- und
und Gartenbautechnik
Helmholtz-Zentrum für
Umweltforschung GmbH
UFZ
30419 Hannover
Homepage: www.bgt.unihannover.de
In vitro Kultur von Eichen
Ektomykorrhizasymbiosen
Genexpressionsanalysen
6120 Halle/Saale
Homepage: www.ufz.de
Entwicklung einer in vitro Kultur
Susanne Rühmann
Fachgebiet Obstbau
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Organ Kultur
Adulte
Pflanze
Kallus Kultur
Zell Kultur
Neue adulte
Pflanze
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Meristem Kultur
Organ Kultur
Spross-Kultur
Adulte
Pflanze
Kallus Kultur
Zell Kultur
Neue adulte
Pflanze
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Nur meristematisches Gewebe
wird verwendet (0,1 mm)
Meristem Kultur
Organ Kultur
Spross-Kultur
Adulte
Pflanze
Kallus Kultur
Zell Kultur
Explantat zur Kultivierung
beinhaltet
Blattknospenschuppen
(0,2 – 0,4 mm)
Neue adulte
Pflanze
Für Gewebekultur verwendete Meristeme:
www.nature.com/.../v4/n3/fig_tab/nrg1002_F1.html
Für Gewebekultur verwendete Meristeme:
Spross apical meristem
Blatt primorium
Blatt Primorium
www.nature.com/.../v4/n3/fig_tab/nrg1002_F1.html
Oberflächen
Sterilisation
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Embryo Kultur
Meristem Kultur
Organ Kultur
Spross-Kultur
Terminal
Knospe
Adulte
Pflanze
Kallus Kultur
Neue adulte
Pflanze
Seiten
Knospe
Zell Kultur
Spross
Sprosskultur
Oberflächen
Sterilisation
Pflanzliche Gewebekultur beinhaltet:
Wärme
behandlung
Terminal
Meristem
Embryo Kultur
Meristem Kultur
Organ Kultur
Spross-Kultur
Adulte
Pflanze
Kallus Kultur
Zell Kultur
Seiten
Meristem
Spross
Sprosskultur
Neue adulte
Pflanze
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