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Integrative Analyse des cyanobakteriellen Stoffwechsels - edoc

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Integrative Analyse des
cyanobakteriellen Stoffwechsels
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor
rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
M.Sc. Henning Knoop
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Stefan Hecht, Ph.D.
Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Lockau
2. Prof. Dr. Martin Hagemann
3. Dr. Ralf Steuer
Tag der mündlichen Prüfung: 16. Oktober 2014
Zusammenfassung
yanobakterien sind einzellige, phototrophe Mikroorganismen, die in unterschiedlichsten Umgebungen und Ökosystemen vorkommen. Aufgrund ihrer
Fähigkeit, Sonnenenergie und atmosphärisches Kohlenstoffdioxid für das Zellwachstum zu nutzen, stellen Cyanobakterien einen idealen Modellorganismus für ein
besseres Verständnis der oxygenen Photosynthese und des phototrophen Stoffwechsels dar. Sie werden auch zunehmend als potenzieller Wirtsorganismus für die Synthese von wertvollen Chemikalien und verschiedenen Biokraftstoffen wahrgenommen.
Um diese Vorteile in vollem Umfang zu nutzen, bietet die genomskalige Rekonstruktion von Mikroorganismen ein weitgehendes Verständnis und eine Wissensbasis über
die metabolischen Umwandlungen, die während des phototrophen Wachstums stattfinden.
C
Im Verlauf dieser Arbeit wurde eine detaillierte Rekonstruktion und Analyse des metabolischen Netzwerkes der einzelligen Cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803
und Synechococcus elongatus PCC 7942 erstellt, miteinander verglichen und Gemeinsamkeiten und Unterschiede diskutiert. Die Rekonstruktionen basieren dabei auf unterschiedlichen Datenquellen, mehreren neueren Rekonstruktionen des cyanobakteriellen Stoffwechsels und einer ausführlichen manuellen Kuration. Darüber hinaus
wurden beim Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 unklare Reaktionsschritte
experimentell validiert und die funktionellen Konsequenzen von unbekannten oder
abweichenden Stoffwechseltopologien untersucht. Dabei umfasst das Modell neuartige Ergebnisse in Bezug auf den cyanobakteriellen TCA-Zyklus, einen angeblich vorhandenen Glyoxylatzyklus und die Rolle der Photorespiration beim Zellwachstum, die
mithilfe der Flussbilanzanalyse (Flux Balance Analysis) (FBA) systematisch auch in
Bezug auf den täglichen Hell-Dunkel-Zyklus des cyanobakteriellen Stoffwechsels gewonnen wurden. Zudem helfen die aus der genomskaligen Rekonstruktion der beiden
Organismen gewonnenen Erkenntnisse, Unstimmigkeiten in der derzeitigen Annotation auszumachen.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit liegt im Zugewinn des allgemeinen Verständnisses über die genomische Diversität innerhalb unterschiedlicher Cyanobakterienstämme und speziell innerhalb des cyanobakteriellen Stoffwechsels. Dazu wurden
die Genome mehrerer phototropher Cyanobaktierenstämme untereinander verglichen,
indem paarweise Vergleiche zwischen den einzelnen Proteinsequenzen durchgeführt
und diese dementsprechend zu Clustern von vermutlich orthologen Genen (CLOG)
gruppiert wurden. Mithilfe dieser Cluster konnte zwischen Kern-, gemeinsamen und
einzigartigen Gene unterschieden werden und es wurde gezeigt, dass die Mehrzahl
der Gene nur jeweils in einem einzigen cyanobakteriellen Genom auftreten. Im Gegensatz dazu sind Gene mit einer metabolischen Funktion innerhalb des Kern-Genoms,
welches alle analysierten Stämme gemeinsam haben, stark überrepräsentiert. Eine
genauere Betrachtung der metabolischen Diversität innerhalb des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels zeigt, dass Teile des metabolischen Netzwerkes sehr stark konserviert, aber auch andere Stoffwechselwege stark fragmentiert sind.
Zum Abschluss dieser Arbeit wurde unter Zuhilfenahme der Flussbilanzanalyse
die Synthese von neun unterschiedlichen Biokraftstoffen in Cyanobakterien, beziehungsweise am speziellen Beispiel von Synechocystis sp. PCC 6803, analysiert. Dabei wurden die Synthesen der Biokraftstoffe charakterisiert und das Zusammenspiel
zwischen der Biokraftstoffsynthese und dem Zellwachstum genauer untersucht. Abschließend wird unter Verwendung der Variabilitätsanalyse beschrieben, wie Schlüsselreaktionen beziehungsweise potenzielle Zielgene für eine genetische Manipulation
identifiziert werden können.
Vorwort
iese Arbeit widmet sich der systematischen Beschreibung und Analyse des cyanobakteriellen Stoffwechsels. Der Fokus liegt dabei auf der Rekonstruktion
und Analyse genomskaliger metabolischer Netzwerke von phototrophen Mikroorganismen. Die Rekonstruktion genomskaliger metabolischer Netzwerke eröffnet
die Möglichkeit einer systematischen Sammlung des Wissens über den Stoffwechsel
des jeweiligen Organismus und ist ein guter Ausgangspunkt, um weitere Diskussionen anzuregen, zum Beispiel in Form von experimentellen Messungen, um dieses Wissen zu vermehren und zu verfeinern.
D
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit ist der Vergleich verschiedener Cyanobakterienstämme untereinander. Dieser ermöglicht ein besseres Verständnis über das Phylum
der Cyanobakterien und speziell auch über den phototrophen Stoffwechsel, um zum
Beispiel diese Wissensgrundlage später auf höher entwickelte Organismen übertragen zu können. Die Thesen und Behauptungen, die in dieser Arbeit aufgestellt werden,
sollen dazu anregen, durch experimentelle Messungen verifiziert zu werden und neue
Perspektiven auf den Stoffwechsel zu erschaffen. Der Leser wird zu diesem Zweck
durch sechs Kapitel geleitet, die aufeinander aufbauen.
Das erste Kapitel dieser Arbeit gibt eine kurze Einleitung zu den Cyanobakterien,
speziell zu den zwei Stämmen Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) und Synechococcus elongatus PCC 7942 (Synechococcus), von denen jeweils im Verlauf der
Arbeit ein genomskaliges metabolisches Netzwerk rekonstruiert wurde. Überdies werden kurz 14 weitere Cyanobakterienstämme vorgestellt, die für eine Vergleichsanalyse
auf Ebene des Genoms und speziell des Stoffwechsel untersucht wurden. Zudem wird
ein Überblick über metabolische Netzwerke im Allgemeinen gegeben inklusive deren
Rekonstruktion und Modellierung. Abschließend erhält der Leser noch eine kurze Einführung zu Biokraftstoffen und wie insbesondere Cyanobaktieren als Biokraftstoffproduzenten eingesetzt werden könnten.
Im zweiten Kapitel wird genauer auf die Rekonstruktion des genomskaligen metabolischen Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803 und dessen Analyse mithilfe
der Flussbilanzanalyse eingegangen. Hierbei steht vor allem die Untersuchung des
phototrophen Stoffwechsels, aber auch der Übergang vom Wachstum in Abwesenheit
von Licht zum phototrophen Wachstum im Vordergrund.
Das dritte Kapitel behandelt einen Vergleich von 16 verschiedenen Cyanobakterienstämmen auf Ebene des Genoms. Hierfür werden die einzelnen Gene der jeweiligen
Organismen in verschiedene Cluster (CLOGs) aufgeteilt, wobei zwischen Kern-Genen,
gemeinsamen und einzigartigen Genen unterschieden wird. Anschließend wird besonders der Anteil der metabolischen Cluster im Detail untersucht.
Im darauffolgenden vierten Kapitel wird die Analyse eines genomskaligen metabolischen Modells von Synechococcus elongatus PCC 7942 beschrieben, dessen Rekonstruktion durch die vorangegangene Vergleichsanalyse aus dem dritten Kapitel
erleichtert wurde. Speziell werden dabei die Unterschiede zum vorher untersuchten
metabolischen Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 herausgearbeitet und dessen
Auswirkungen analysiert.
Das fünfte Kapitel bezieht sich auf eine praktische Anwendung der Flussbilanzanalyse metabolischer Netzwerke, in diesem spezifischen Fall der Synthese von Biokraftstoffen mithilfe von Cyanobakterien. Zu diesem Zweck werden die Synthesen von
neun unterschiedlichen Biokraftstoffen im metabolischen Netzwerk von Synechocystis
sp. PCC 6803 analysiert und diskutiert.
Im sechsten und letzten Kapitel dieser Arbeit wird abschließend noch ein zusammenfassendes Fazit über die gesamte Arbeit gezogen und dem Leser ein kurzer Ausblick auf weitere Anwendungen und Projekte gegeben.
Als kurze Information sei angemerkt, dass für die gesamte Thematik dieser Arbeit
viele Fachtermini aus dem Englischen stammen. In dieser Arbeit wurde es so gehandhabt, dass wenn eine sinnvolle deutsche Übersetzung des Fachterms existiert, diese
genutzt wird, falls aber kein äquivalentes Wort im deutschen Sprachgebrauch existiert, der englische Fachbegriff übernommen wurde. Zudem sind die Beschriftungen
einiger Abbildungen ebenfalls in englischer Sprache gegeben, da diese direkt aus der
Fachliteratur stammen.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Cyanobakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1. Synechocystis sp. PCC 6803 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.2. Synechococcus elongatus PCC 7942 . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.3. Weitere Cyanobakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2. Systembiologie und metabolische Netzwerke . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1. Rekonstruktion metabolischer Netzwerke . . . . . . . . . . . .
1.2.2. Modellierung von genomskaligen metabolischen Netzwerken
1.3. Biokraftstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1. Cyanobakterien als Biokraftstoffproduzenten . . . . . . . . . .
1.4. Zielstellung dieser Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
2.1. Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.1. Computergestützte Modellierung von metabolischen Netzwerken
2.1.2. Flussbilanzanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.3. Rekonstruktion metabolischer Netzwerke . . . . . . . . . . . . . .
2.1.4. Rekonstruktion des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis
sp. PCC 6803 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.5. Annahmen für das metabolischen Netzwerk von Synechocystis sp.
PCC 6803 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.6. Die Synthese von Glycin und Serin . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.7. Formale Eigenschaften des metabolischen Netzwerkmodells . . .
2.1.8. Kriterien für die Modellierung des metabolischen Netzwerkes . .
2.1.9. Die Biomassezielfunktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.10. Zeitaufgelöste Flussbilanzanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2.2. Ergebnisse und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 . . .
2.2.2. Vereinbarkeit bestehender Rekonstruktionen . . . . . . . . . . . .
2.2.3. Flussbilanzanalyse des Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803
2.2.4. Optimale Flussverteilung für das phototrophe Wachstum . . . . .
2.2.5. Die Oxygenase-Reaktion von RuBisCO und die Photorespiration
2.2.6. Optimale Flussverteilung bei Abwesenheit von Licht . . . . . . .
2.2.7. Übergang von der Nutzung von Speicherstoffen hin zum phototrophen Wachstum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.8. Der cyanobakterielle Glyoxylat-Shunt . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.9. Der TCA-Zyklus der Cyanobakterien . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.10. Der zyklische Fluss durch den TCA-Zyklus in der optimalen Flussverteilung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.11. Zeitliche Koordination des phototrophen Stoffwechsels . . . . . .
2.3. Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
3.1. Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.1. Auswahl der Cyanobakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.2. Cluster von vermutlich orthologen Genen (CLOG) . . . . . . . . .
3.1.3. Anreicherung der GO-Annotation . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.4. Phylogenetische Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.5. Zuweisung von metabolischen Funktionen zu den CLOGs . . . .
3.2. Ergebnisse und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1. Genomanalyse und Cluster von vermutlich orthologen Genen . .
3.2.2. Das cyanobakterielle Kern- und Pan-Genom . . . . . . . . . . . .
3.2.3. Phylogenetische Übereinstimmungen zwischen den 16 Cyanobakterienstämmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.4. Das metabolische Netzwerk der Cyanobakterien ist stark konserviert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.5. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels . . . . . . . .
3.2.6. Der Stoffwechsel von unterschiedlichen Speicherstoffen bei Cyanobakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.7. Die Diversität des Zentralstoffwechsels unter den Cyanobakterien
3.3. Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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4. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
4.1. Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.1. Rekonstruktion des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus elongatus PCC 7942 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.2. Flussbilanzanalyse des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus elongatus PCC 7942 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2. Ergebnisse und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
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4.2.2. Der Zentralstoffwechsel von Synechococcus elongatus PCC 7942
im Vergleich zu Synechocystis sp. PCC 6803 . . . . . . . . . . . . . 93
4.2.3. Flussbilanzanalyse des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus elongatus PCC 7942 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.4. Verifizierung des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus
elongatus PCC 7942 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
4.3. Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
5.1. Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1. Integration von Biokraftstoffsynthesen in das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.2. Parameter und Berechnung der stöchiometrischen Eigenschaften
für die Biokraftstoffsynthesen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.3. Trade-off und Variabilitätsanalyse der Biokraftstoffsynthesen . .
5.1.4. Synergetische Effekte der Biokraftstoffsynthesen . . . . . . . . .
5.2. Ergebnisse und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1. Stöchiometrische Modellierung von verschiedenen Biokraftstoffsynthesen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2. Trade-off zwischen Wachstum und Biokraftstoffsynthese . . . . .
5.2.3. Synergetische Effekte bei der Biokraftstoffsynthese . . . . . . . .
5.2.4. Variabilitätsanalyse zur Identifikation von Schlüsselreaktionen
bei der Biokraftstoffsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3. Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
105
107
6. Resümee und Ausblick
123
A. Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
127
.
Literaturverzeichnis
135
.
Danksagung
151
107
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110
110
112
112
113
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117
121
Abbildungsverzeichnis
1.1. Elektronenmikroskopische Aufnahme von Synechocystis sp. PCC 6803 .
1.2. Elektronenmikroskopische Aufnahme von Synechococcus elongatus PCC
7942 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
2.1. Grundlagen der Constraint-basierten Modellierung . . . . . . . . . . . .
2.2. Schematischer Ablauf einer Netzwerkrekonstruktion . . . . . . . . . . .
2.3. Überblick über die Attribute des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4. Optimale Flussverteilung für Synechocystis sp. PCC 6803 unter phototrophen Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5. Die maximale Wachstumsrate in Abhängigkeit zur Lichtintensität und
HCO3− -Aufnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.6. Die Photorespiration und der Glyoxylat-Stoffwechsel . . . . . . . . . . .
2.7. Optimale Flussverteilung für Synechocystis sp. PCC 6803 bei Abwesenheit von Licht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.8. Übergang von der Nutzung von Speicherstoffen hin zum phototrophen
Wachstum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.9. Experimentelle Überprüfung des Glyoxylat-Shunts . . . . . . . . . . . .
2.10.Alternative Möglichkeiten des TCA-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.11.Auswirkungen des TCA-Zyklus auf das optimale Wachstum . . . . . . .
2.12.Phasensortierte Expressionsprofile von metabolischen Genen in Synechocystis sp. PCC 6803 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.13.Zeitabhängige Biomassezielfunktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.14.Zeitlicher Verlauf des metabolischen Flusses einiger ausgewählter Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3.1. Anzahl der Gene pro CLOG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3.2. Verteilung der CLOGs innerhalb der 16 untersuchten Cyanobakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3. Das cyanobakterielle Kern- und Pan-Genom . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4. Phylogenetische Analyse der 16 untersuchten Cyanobakterienstämme .
3.5. Verteilung von metabolischen CLOGs innerhalb der cyanobakteriellen
Genome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6. Vergleich von metabolischen und nicht metabolischen CLOGs . . . . . .
3.7. Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels . . . . . . . . . . . . . . .
3.8. Stoffwechseldiagramm des cyanobakteriellen Zentralstoffwechsels . . .
4.1. Unterschiede auf Ebene des TCA-Zyklus zwischen Synechocystis sp. PCC
6803 und Synechococcus elongatus PCC 7942 . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2. Alternativer Stoffwechselweg zur Glutamat-Dehydrogenase in Synechococcus elongatus PCC 7942 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3. Optimale Flussverteilung für Synechococcus elongatus PCC 7942 unter
phototrophen Bedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.4. Optimale Flussverteilung für Synechococcus elongatus PCC 7942 bei Abwesenheit von Licht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
Synthesereaktionen der Biokraftstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Trade-off zwischen Wachstum und Biokraftstoffsynthese . . . . . . . . .
Analyse des Synergieeffekts der unterschiedlichen Biokraftstoffe . . . .
Variabilitätsanalyse von Reaktionen mit einer abfallenden Flussaktivität für die Synthese von Ethylen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.5. Variabilitätsanalyse des EFE, der PEPC und der SDH für die Synthese
von Ethylen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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118
119
A.1. Stoffwechselkarte des Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803 . . . 134
Abkürzungen
2PGL
2OGDC
6PGD
6PGL
Aca11017
ACEP
ACO
AGP
CLOG
CoA
CphA
CphB
CS
Cyn51142
Cyn8801
CT
BOF
BHR
DW
DCMU
E4P
EFE
ENO
ETK
F6P
FBP
2-Phosphoglycolat
2-Oxoglutarat-Decarboxylase (EC 4.1.1.71)
6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.44)
6-Phosphogluconolactonase (EC 3.1.1.31)
Acaryochloris marina MBIC 11017
Acetylphosphat
Aconitase (EC 4.2.1.3)
ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (EC 2.7.7.27)
Cluster von vermutlich orthologen Genen (Cluster of Likely
Ortholog Genes)
Coenzym A
Cyanophycin-Synthetase (EC 6.3.2.29/30)
Cyanophycinase (EC 3.4.15.6)
Citrat-Synthase (EC 2.3.3.1)
Cyanothece ATCC 51142
Cyanothece PCC 8801
circadiane Zeit (circadian time)
Biomassezielfunktion (Biomass Objective Function)
bidirektionale Trefferrate (Bidirectional Hit Rate)
Trockengewicht (Dry Weight)
3-(3,4-Dichlorphenyl)-1,1-Dimethylharnstoff
Erythrose-4-Phosphat
Ethylen-bildendes Enzym (EC 1.14.11.34)
Enolase (EC 4.2.1.11)
Elektronentransportkette
Fructose-6-Phosphat
Fructose-1,6-Bisphosphatase (EC 3.1.3.11)
vii
FBA
FBPA
FH
LP
GABA
GAP
GAPDH
GBE
GDH
Glo7421
GLS
GP
GPD
GPI
GS
ICD
ICL
ME
MDH
MQO
MS
Mic843
Nos7120
ODE
OGDH
OOR
OPP
PEP
PDH
PG3
PEPC
PEPK
PFK
PGK
PGM
PhaA
PhaB
PhaC
PhaE
PHB
PKL
Flussbilanzanalyse (Flux Balance Analysis)
Fructose-1,6-Bisphosphat-Aldolase (EC 4.1.213)
Fumarat-Hydratase (EC 4.2.1.2)
Linearen Programmierung
γ-Aminobutyrat
Glyceraldehyd-3-Phosphat
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.12/59)
1,4-α-Glucan-verzweigendes Enzym (Glycogen Branching Enzyme)
(EC 2.4.1.18)
Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.4)
Gloeobacter violaceus PCC 7421
Glutamat-Synthase (EC 1.4.1.14)
Glykogen-Phosphorylase (EC 2.4.1.1)
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49)
Glucose-6-Phosphat-Isomerase (EC 5.3.1.9)
Glykogen-Synthase (EC 2.4.1.21)
Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.41/2)
Isocitratlyase (EC 4.1.3.1)
Malatenzym (EC 1.1.1.38)
Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37)
Malat:Chinon-Oxidoreduktase (EC 1.1.5.4)
Malat-Synthase (EC 2.3.3.9)
Microcystis aeruginosa NIES-843
Nostoc sp. PCC 7120
gewöhnliche Differentialgleichung (Ordinary Differential Equation)
2-Oxoglutarat-Dehydrogenase
2-Oxoglutarat-Oxidoreduktase
oxidativer Pentosephosphatweg
Phosphoenolpyruvat
Pyruvatdehydrogenase
Glycerat-3-Phosphat
PEP-Carboxylase (EC 4.1.1.31)
PEP-Carboxykinase (EC 4.1.1.49)
Phosphofructokinase (EC 2.7.1.11)
Phosphoglyceratkinase (EC 2.7.2.3)
Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.1)
Polyhydroxyalkanoat-spezifische β-Ketothiolase/Acetyl-CoA
Acetyltransferase (EC 2.3.1.9)
PHA-spezifische Acetoacetyl-CoA-Reduktase (EC 1.1.1.36)
Poly-(3-Hydroxyalkanoat)-Synthase-Komponente C (EC 2.3.1.-)
Poly-(3-Hydroxyalkanoat)-Synthase-Komponente E (EC 2.3.1.-)
Poly-β-Hydroxybutyrat
Phosphoketolase (EC 4.1.2.22)
PPS
PRK
ProMED4
Pro9211
Pro9215
PS
PYK
RPI
RPE
RuBisCO
RuBP
SBP
SDH
SNA
SSADH
STK
SycJA23
Syc7002
Syc7803
Syc7942
Syn6803
Synechococcus
Synechocystis
TALDO
TCA-Zyklus
ThermoBP1
TKT
TPI
Trich101
X5P
PEP-Synthase (EC 2.7.9.2)
Phosphoribulokinase (EC 2.7.1.19)
Prochlorococcus marinus MED4
Prochlorococcus marinus MIT 9211
Prochlorococcus marinus MIT 9215
Photosystem
Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40)
Ribose-5-Phosphat-Isomerase (EC 5.3.1.6)
Ribulose-5-Phosphat-3-Epimerase (EC 5.1.3.1)
Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/-Oxygenase (EC 4.1.1.39)
Ribulose-1,5-Bisphosphat
Fructose-1,6-Bisphosphatase/ Sedoheptulose-1,7-Bisphosphatase
(EC 3.1.3.37)
Succinat-Dehydrogenase (EC 1.3.99.1)
stöchiometrische Netzwerkanalyse
Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.16)
Succinat-Thiokinase (EC 6.2.1.5)
Synechococcus sp. JA-2-3B’a(2-13)
Synechococcus sp. PCC 7002
Synechococcus sp. WH7803
Synechococcus elongatus PCC 7942
Synechocystis sp. PCC 6803
Synechococcus elongatus PCC 7942
Synechocystis sp. PCC 6803
Transaldolase (EC 2.2.1.2)
Tricarbonsäurezyklus (Tricarboxylic Acid Cycle)
Thermosynechococcus elongatus BP-1
Transketolase (EC 2.2.1.1)
Triosephosphat-Isomerase (EC 5.1.3.1)
Trichodesmium erythraeum IMS101
Xylose-5-Phosphat
KAPITEL
1
Einleitung
1
Kapitel 1. Einleitung
1.1. Cyanobakterien
ie Cyanobakterien, welche noch bis zum Jahr 1974 auch als Blaualgen bezeichnet wurden, gehören zu den gramnegativen Bakterien. Sie stellen die einzige
Gruppe der bisher bekannten Prokaryoten dar, die die Fähigkeit zur oxygenen Photosynthese besitzen und somit in der Lage sind, elementaren Sauerstoff (O2 )
zu produzieren [1]. Mithilfe der Photosynthese erzeugen die Cyanobakterien ATP und
das Reduktionsäquivalent NADPH, welches sie benutzen, um verschiedene Nährstoffe zu assimilieren und Kohlenstoffdioxid aus der Atmosphäre über den Calvin-BensonZyklus zu fixieren. Deswegen spielten Cyanobakterien auch bei der Entwicklung der
heutigen Biosphäre vor ca. 3,5 Milliarden Jahren eine entscheidende Rolle [2]. Die
damals reduzierte Atmosphäre wurde im Laufe der Zeit mit Sauerstoff angereichert,
wodurch eine Basis für eine aerobe Lebensweise auf der Erde geschaffen wurde. Diese ermöglichte die Entstehung einer Vielzahl von Lebewesen und Arten auf der Erde.
Auch heute noch tragen die Cyanobakterien einen großen Anteil zur globalen CO2 Assimilierung und der Regenerierung von Sauerstoff und Stickstoff bei. Sie werden
zudem als die Vorläufer der Plastiden in Pflanzen und Algen (Endosymbiontentheorie) angesehen [3]. Die Morphologie von Cyanobakterien reicht von einzelligen, kokkoiden Organismen bis hin zu mehrzelligen, filamentösen Zellverbindungen. Auf Grund
dieser hohen Diversität besitzen Cyanobakterien die Fähigkeit, die unterschiedlichsten Ökosysteme zu besiedeln [4]. Darunter fallen Süß- und Salzwasserhabitate, aber
auch heiße Quellen oder sogar vorübergehend feuchte Felsen in der Wüste bis hin zu
Polarregionen [5].
In letzter Zeit gewinnt auch die Nutzung von Cyanobakterien für wirtschaftliche
Zwecke mehr und mehr an Aufmerksamkeit. Dazu gehören die pharmazeutische Wirkstoffforschung sowie die Produktion von Naturstoffen [6, 7]. Insbesondere besitzen sie
durch ihre Fähigkeit der direkten Umwandlung von atmosphärischem CO2 zu Biomasse und organischen Verbindungen mithilfe von Sonnenlicht ein erhebliches Potenzial
als neuartige und erneuerbare Quelle für die Erzeugung von Bioenergie beziehungsweise Biokraftstoffen [8–11]. Außerdem sind Cyanobakterien und Mikroalgen, soweit
bekannt, die einzigen Organismen, welche in der Lage sind, sowohl oxygene Photosynthese als auch Wasserstoffproduktion zu betreiben. Die Produktion von H2 durch
phototrophe Mikroorganismen spielt neben der Produktion von Biokraftstoffen (siehe
Kapitel 5) eine wichtige Rolle bei der Suche nach alternativen Prozessen zur Erzeugung von erneuerbaren Energien.
D
1.1.1. Synechocystis sp. PCC 6803
Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) (Abbildung 1.1) ist ein einzelliges, nicht
stickstofffixierendes Cyanobakterium. Unter den verschiedenen Cyanobakterienstämmen ist Synechocystis einer der am besten studierten Modellorganismen. Der Stamm
wurde zuerst aus einem Süßwassersee in Kalifornien isoliert und wurde 1968 in die
Pasteur Culture Collection (PCC) übernommen [12]. Sein Genom wurde bereits 1996
als erster photosynthetischer Organismus vollständig sequenziert [13]. Es hat eine
2
1.1. Cyanobakterien
Größe von insgesamt 3,96 Mb und setzt sich aus einem zirkulären Chromosom mit
3,57 Mb und sieben Plasmiden mit insgesamt 390 kb zusammen.
Durch die frühe Sequenzierung existiert mittlerweile eine umfangreiche Sammlung
von genomischen, biochemischen und physiologischen Daten für Synechocystis, welche es zu einem optimalen Modellorganismus für Analysen
photosynthetischer Prozesse macht. Auch seine
natürliche Kompetenz [15] extrazelluläre DNA
aufzunehmen und in sein Genom zu integrieren,
machen das Bakterium leicht empfänglich für
genetische Modifikationen. Synechocystis wächst
phototroph, einige Stämme sind aber auch in der
Lage heterotroph, unter der Zugabe von Glukose,
zu wachsen [16, 17]. Diese Charakteristika maAbbildung 1.1.: Elektronenmikroskopische
chen Synechocystis zu einem idealen AusgangsAufnahme einer sich teilenden Synechocyspunkt, um mithilfe einer systemischen Analyse tis sp. PCC 6803-Zelle (Maßstab: 200 nm)
Einblicke in den phototrophen Stoffwechsel zu er- (Abbildung aus Kerfeld et al. (2005) [14]).
halten, um dessen Eigenschaften zu beschreiben.
1.1.2. Synechococcus elongatus PCC 7942
Synechococcus elongatus PCC 7942 (Synechococcus) (früher als Anacystis nidulans bezeichnet; Abbildung 1.2) gehört zu der Gruppe der Süßwasser-Cyanobakterien und besitzt ein obligat photoautotrophes Wachstum [18–20]. Bis heute wurden zwei Stämme
der Gattung Synechococcus elongatus sequenziert, (PCC 6301 und PCC 7492) [21, 22].
Die Genomgröße von Synechococcus umfasst hierbei ca. 2,7 Mb zuzüglich eines Plasmides mit 46 kb. In Bezug auf genetische Manipulationen konnte für Synechococcus als
erstes Cyanobakterium überhaupt gezeigt werden, dass eine Transformation rein durch externe
Zugabe von externer DNA möglich ist [24].
Ferner wird Synechococcus als „einfachster“
Modellorganismus für Studien der circadianen
Uhr in Prokaryoten angesehen [25]. Es konnte gezeigt werden, dass viele Gene in Synechococcus
einen circadianen Expressionsrhythmus besitzen
[26]. Durch groß angelegte Inaktivierungsexperimente konnten auch die entsprechenden Genloci,
welche für das circadiane Verhalten und die circaAbbildung 1.2.: Elektronenmikroskopische
dianen Rhythmen der Genexpression wesentlich Aufnahme von Synechococcus elongatus
sind, identifiziert werden [27]. Es stellte sich her- PCC 7942. Die Carboxysomen der Zelaus, dass die circadianen Rhythmen der Genex- le sind durch Pfeile hervorgehoben (Maßpression durch die drei Uhrgene kaiA, kaiB, und stab: 500 nm) (Abbildung aus Rae et al.
(2012) [23]).
kaiC reguliert werden [26]. In der Literatur sind
auch schon zahlreiche Modelle zu finden, die die-
3
Kapitel 1. Einleitung
sen Prozess beschreiben [28–30]. Synechococcus wächst autotroph relativ schnell, besitzt die Fähigkeit zu natürlicher Kompetenz und lässt sich einfach kultivieren, weshalb es für biotechnologische Anwendungen als ein idealer Kandidat gut geeignet ist.
Unter anderem wurden Studien zur Produktion von kurzkettigen Alkoholen, wie Ethanol und Isobutanol, mit Synechococcus veröffentlicht [8, 9].
1.1.3. Weitere Cyanobakterienstämme
Neben Synechocystis und Synechococcus sind noch weitere Stämme von Cyanobakterien aufgrund ihrer hohen Vielfältigkeit von großem wissenschaftlichen Interesse.
Für eine Analyse der Diversität auf der Genomebene (siehe Kapitel 3) wurde eine Auswahl von 16 Stämmen (inklusive Synechocystis und Synechococcus), die gattungsübergreifend Organismen von allen bekannten Umgebungen integriert, für diese Arbeit
getroffen. Dabei wurde darauf Wert gelegt, die Stämme so auszuwählen, dass sie die
bekannte genomische und metabolische Vielfalt des cyanobakteriellen Phylums repräsentieren. Darunter fallen einige Süßwasserstämme sowie marine und stickstofffixierende, also auch zwei thermophile Stämme, welche ursprünglich aus heißen Quellen
isoliert wurden. Neben Synechocystis und Synechococcus gehören zu den 16 analysierten Stämmen:
Acaryochloris marina MBIC 11017 (Aca11017)
Aca11017 gehört zu den marinen Cyanobakterien und ist bisher der einzig bekannte Mikroorganismus, der hauptsächlich Chlorophyll d als photosynthetisches Pigment
verwendet [31].
Cyanothece ATCC 51142 (Cyn51142)
Cyn51142 ist ein einzelliges, stickstofffixerendes, marines Cyanobakterium und war
der erste Organismus der Gattung Cyanothece, welcher sequenziert wurde [32].
Cyanothece PCC 8801 (Cyn8801)
Cyn8801 ist ein weiteres Cyanobakterium der Gattung Cyanothece und somit auch einzellig und stickstofffixierend. Jedoch wurde dieser Stamm aus einer Süßwasserquelle
isoliert.
Gloeobacter violaceus PCC 7421 (Glo7421)
Glo7421 ist ein einzelliges, stäbchenförmiges Süßwassercyanobakterium, welches Kolonien bildet, die von einem klebrigen Beutel umhüllt sind. Es wurde als erstes an
Kalkfelsen in den Schweizer Alpen isoliert [33].
Microcystis aeruginosa NIES-843 (Mic843)
Mic843 ist ein kolonienbildendes Cyanobakterium, welches im Süßwasser lebt. Es produziert schädliche Toxine, die freigesetzt werden und für Menschen und Tiere gesundheitsschädigend sind [34].
4
1.1. Cyanobakterien
Nostoc sp. PCC 7120 (Nos7120)
Nos7120, auch bekannt unter Anabaena sp. PCC 7120, ist ein filamentebildendes Süßwassercyanobakterium und gilt als Modellorganismus für die Bildung von Heterocysten und deren zugehörige Genregulation [35].
Prochlorococcus marinus MED4 (ProMED4), Prochlorococcus marinus MIT 9211
(Pro9211) und Prochlorococcus marinus MIT 9215 (Pro9215)
ProMED4, Pro9211 und Pro9215 sind drei Stämme der Gattung Prochlorococcus, welche zu den einzelligen, marinen Cyanobakterien gehören. Prochlorococcus zählt zu
den kleinsten bis jetzt bekannten photosynthetisch-aktiven Mikroorganismen und ist
in hohen Konzentrationen in weiten Bereichen der Ozeane beheimatet [36].
Synechococcus sp. JA-2-3B’a(2-13) (SycJA23)
SycJA23 ist ein einzelliges, thermophiles Cyanobakterium, welches in der Lage ist,
Stickstoff zu fixieren. Es wurde aus cyanobakteriellen Matten in heißen Quellen des
Octopus Springs im Yellowstone Nationalpark in den USA isoliert. In diesem Habitat
herrschen typischerweise Temperaturen von 50 – 70 Grad Celsius [37].
Synechococcus sp. PCC 7002 (Syc7002)
Syc7002 ist ein einzelliges Cyanobakterium, welches ursprünglich zuerst an der Küste
von Puerto Rico isoliert wurde. Es ist sehr lichttolerant und gehört zu den am schnellsten wachsenden Cyanobakterien [38].
Synechococcus sp. WH7803 (Syc7803)
Syc7803 ist ein einzelliges, marines Cyanobakterium, welches zur Gattung Synechococcus gehört. Synechococcus ist über eine große Spanne von unterschiedlichen Breitengraden weltweit in Küstenbereichen oder Flussmündungen verbreitet [39].
Thermosynechococcus elongatus BP-1 (ThermoBP1)
ThermoBP1 ist ein thermophiles, stäbchenförmiges und einzelliges Süßwassercyanobakterium, welches in heißen Quellen zu finden ist. Es gilt als Modellorganismus für
Untersuchungen des Photosyntheseapparates z.B. durch Kristallisation der photosynthetischen Proteine [40].
Trichodesmium erythraeum IMS101 (Trich101)
Trich101 ist ein filamentöses, marines und stickstofffixierendes Cyanobakterium. Es
ist in nährstoffarmen, tropischen und subtropischen Ozeanbereichen zu finden. Es
wird angenommen, dass diese Cyanobakterien bis zu 40 % der gesamten Stickstofffixierung in den Ozeanen verrichten [41].
5
Kapitel 1. Einleitung
1.2. Systembiologie und metabolische Netzwerke
„Der Forschungsansatz der Systembiologie zielt darauf ab, zu einem umfassenden quantitativen Verständnis der dynamischen Interaktionen zwischen den Bausteinen und Komponenten eines biologischen Systems zu gelangen, um das Verhalten des Systems als Ganzes zu verstehen und Vorhersagen zu ermöglichen. Zur Erreichung dieses Ziels werden mathematische
Konzepte auf biologische Systeme angewandt. Von zentraler Bedeutung ist
hierbei ein iterativer Prozess zwischen Laborexperiment und Modellierung
im Computer.“1
Schon in der ersten Hälfte des vergangenen Jahrhunderts gab es biologische Teilgebiete (zum Beispiel in der Ökologie), in welchen Systemanalysen beziehungsweise integrative Studien durchgeführt worden sind. Der Begriff der „Systembiologie“ im Kontext der modernen Biologie wurde zuerst Ende der 1990er Jahre eingeführt [42, 43].
Der Hauptgrund hierfür war die Einführung der funktionalen Genomik, welche den
Zugang zu einer großen Anzahl an hochqualitativen Daten ermöglichte. Hinzu kam
noch die technische Weiterentwicklung von Computern, welche die Auswertung dieser Datenmengen überhaupt in angemessener Zeit ermöglichten und vereinfachten.
Dies hatte zur Folge, dass nun komplexere und realistischere Modelle zu biologischen
Fragestellungen möglich waren. Zu dieser Zeit wurden auch in der Gruppe von Tomita [44] die ersten Ansätze für ein quantitatives Modell des gesamten Metabolismus
einer einzelnen Zelle entwickelt.
Allgemein stellt die Rekonstruktion von Modellen einen fundamentalen Schritt bei
systembiologischen Analysen dar. Dabei werden alle am Prozess beteiligten biologischen Komponenten, die Wechselwirkungen, Reaktionen und Interaktionen zwischen
ihnen sowie, falls vorhanden, Werte für Konzentration oder Lokalisierung mit einbezogen. Die Gesamtheit aller Komponenten inklusive ihrer Beziehungen untereinander
bilden ein Netzwerk. Im Falle eines metabolischen Netzwerkes wäre zum Beispiel
jeder Metabolit eine Komponente des Netzwerkes und eine Reaktion wandelt einen
Metaboliten zu einem oder mehreren anderen Metaboliten beziehungsweise Produkten um.
Für die Rekonstruktion eines Netzwerkes kann jegliche mögliche Information aus
der Literatur über Genomsequenzinformationen bis hin zu experimentell erworbenen
Daten verwendet werden [45]. Somit hat die Netzwerkrekonstruktion eine zentrale Bedeutung für die späteren Analysen des Systems, denn die Ergebnisse, die ein Modell
liefert, hängen stark von der Qualität der Eingangsdaten ab. Fehlerhafte Eingangsdaten mit daraus folgenden Fehlern in der Rekonstruktion, können zu Fehlinterpretationen und falschen Schlussfolgerungen führen [46, 47].
Die Rekonstruktion von qualitativ hochwertigen genomskaligen metabolischen Modellen beziehungsweise Netzwerken [48] stellt somit eine elementare Grundlage für
die Forschung im Bereich der Systembiologie dar.
1 (BMBF
6
Bekanntmachung 2007, http://www.bmbf.de/foerderungen/10604.php)
1.2. Systembiologie und metabolische Netzwerke
1.2.1. Rekonstruktion metabolischer Netzwerke
Die Rekonstruktion eines metabolischen Netzwerkes besteht aus einer Ansammlung
von metabolischen Reaktionen und deren zugehörigen Spezies beziehungsweise Substraten, die in einen funktionalen Zusammenhang gesetzt werden. Diese ermöglicht
die Verwendung von mathematischen Simulationen, um unterschiedliche Szenarien
von Stoffwechselflussverteilungen darzustellen und wenn möglich, zusätzliche Vorhersagen zu treffen.
Für die Reaktionen werden lediglich die Reaktionsrichtung, also die thermodynamischen Eigenschaften und die exakte Stöchiometrie der Substrate und Produkte benötigt. Die größte Herausforderung liegt jedoch darin, die Gesamtheit aller Reaktionen
eines Organismus zu sammeln und zu erfassen. Diesbezüglich kann man auf zwei
Arten von Informationsquellen zurückgreifen: Einmal auf gemessene Daten aus der
Literatur beziehungsweise aus Datenbanken. Im Laufe der letzten Jahrzehnte ist es
Wissenschaftlern gelungen, biochemische Reaktionen immer besser zu charakterisieren. Verschiedene Parameter wie die genaue Stöchiometrie der einzelnen Cofaktoren
oder die molekulare Aktivität wurden gemessen und definiert und spezielle Bindungsmechanismen und Reaktionsabläufe entschlüsselt [49]. Dies geschah speziell für enzymatische Reaktionen im Stoffwechsel verschiedenster Organismen. Diese Informationen sind in großen Online-Datenbanken gesammelt, wie zum Beispiel BRENDA [50],
KEGG [51] oder BioCyc [52].
Eine weitere Möglichkeit der Datenakquise besteht darin, auf Daten zurückzugreifen, die direkt aus der Genomsequenz eines Organismus abgeleitet werden können
[53, 54]. Dabei werden unter Zuhilfenahme von unterschiedlichen Werkzeugen, wie
dem BLAST- [55] oder dem CLustalW-Algorithmus [56], Enzyme über eine Sequenzähnlichkeit zu anderen Organismen identifiziert und annotiert. Zum Beispiel werden
bei neu sequenzierten Organismen unterschiedliche Suchalgorithmen verwendet, um
Sequenzen zu finden, die eine hohe Ähnlichkeit zu bereits bekannten Enzymen besitzen. Hierbei wird die Vereinfachung oder Verallgemeinerung getroffen, dass eine hohe
Ähnlichkeit auf Sequenzebene eine gleiche oder ähnliche enzymatische Funktion impliziert.
Obwohl bei diesem Schritt ein automatisierter Ablauf durch unterschiedliche Methoden leicht möglich wäre, sind die daraus resultierenden Netzwerkrekonstruktionen schnell fehlerbehaftet und lückenhaft. Deshalb ist eine anschließende manuelle
Kuration, also eine Überprüfung und wenn möglich Vervollständigung der einzelnen
Stoffwechselwege, ein essentieller Schritt der Rekonstruktion von metabolischen Netzwerken. Dies ist eine sehr schwierige und zeitaufwändige Aufgabe, die eine Zeitspanne
von mehreren Monaten bis zu einigen Jahren umfassen kann [48].
Es sollte hier angemerkt werden, dass es oft sinnvoll ist, zusätzliche Hilfsreaktionen zum metabolischen Netzwerk hinzuzufügen, die auch Hilfsspezies, also keine konkreten biochemischen Verbindungen, verwenden. Ein Beispiel dafür ist die Biomassereaktion [57]. Falls das stöchiometrische Verhältnis von jedem Bestandteil der Biomasse bekannt ist, kann die Biomassereaktion als eine Reaktion definiert werden, welche
eine externe Hilfsspezies, in den meisten Fällen die Biomasse, produziert und dabei je-
7
Kapitel 1. Einleitung
de notwendige Einzelkomponente der Biomasse im entsprechenden Verhältnis konsumiert. Die Biomassereaktion wird bei metabolischen Netzwerken oft als Zielfunktion
definiert, um zum Beispiel bei einer Flussbilanzanalyse (Flux Balance Analysis) (FBA)
das Zellwachstum zu modellieren [58].
1.2.2. Modellierung von genomskaligen metabolischen Netzwerken
Regulatorische und metabolische Netzwerke sind die beiden wichtigsten Systeme in
der heutigen Systembiologie [59]. Das Zusammenspiel dieser beiden Systeme ist von
großer Bedeutung [60]. Dennoch wird bei der Modellierung von metabolischen Netzwerken die Regulation von Reaktionen meist außen vorgelassen. Der Grund hierfür
liegt darin, dass genomskalige metabolische Netzwerke sehr viel leichter rekonstruiert
und analysiert werden können als genomskalige Genregulationsnetzwerke. Dennoch
haben sich auch genomskalige metabolische Netzwerke ohne Vorhandensein der Regulationsebene in der Praxis bewährt. Es konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagen
für intrazelluläre Flüsse und Wachstumsraten solcher Netzwerke auch für verschiedene Organismen mit gemessenen Raten und Werten gut übereinstimmen [61, 62].
Gewöhnlich werden bei metabolischen Netzwerken das Verhalten und die Dynamik
eines Systems mithilfe von gewöhnlichen Differentialgleichungen (ODE) beschrieben.
Die hierbei erstellten ODE-Modelle sind deterministische Modelle, das heißt, wenn
der Zustand des Systems zu einem bestimmten Zeitpunkt bekannt ist, ist es auch
möglich, das Verhalten des Systems zu jedem anderen Zeitpunkt zu bestimmen [63].
Für die Analyse von genomskaligen Netzwerken sind ODEs aus zweierlei Hinsicht
nicht geeignet [49]. Erstens sind für genomskalige metabolische Netzwerke die Mechanismen und Parameter für eine beträchtliche Anzahl von Reaktionen unbekannt.
Zweitens werden die Reaktionsmechanismen und Parameter in der Regel durch Analysen bestimmt, wobei einzelne Enzyme isoliert werden, also in vitro. Das heißt, auch
wenn solche Daten für eine jede Reaktion zur Verfügung stehen, gibt es keine Garantie, dass die Enzyme beziehungsweise Reaktionen auch tatsächlich so in der Zelle, also
in vivo, ablaufen.
Die stöchiometrische Netzwerkanalyse und die Constraint-basierte Modellierung
Ein anderer Ansatz für die Modellierung solcher großen Netzwerke ist die Constraintbasierte Modellierung beziehungsweise die stöchiometrische Netzwerkanalyse. Dabei
werden statt detaillierter Kinetiken und Parameter aller einzelnen biochemischen Reaktionen ausschließlich die physikalischen und chemischen Randbedingungen für das
Verhalten eines Systems festgelegt. So kann zum Beispiel herausgefunden werden,
welche Szenarien in einem Modell möglich sind, aber zeitlich aufgelöste beziehungsweise dynamische Vorhersagen des Systemverhaltens in kurzen Zeitabständen sind
nicht möglich [64]. Kurz gesagt, gibt es einen Trade-off zwischen dem Informationsgehalt der Ergebnisse und der Menge an Informationen, die man in ein Modell integriert.
Die stöchiometrische Netzwerkanalyse (SNA) wurde 1988 von Clarke entwickelt [65]
und bezieht sich auf die Stöchiometrie eines Systems, da diese im Gegensatz zu den
8
1.2. Systembiologie und metabolische Netzwerke
kinetischen Eigenschaften meistens bekannt ist. Sie bietet sich besonders für die mathematische Analyse metabolischer Netzwerke an. Die SNA ist ein mathematischer
Ansatz, welcher numerisch leicht lösbar ist und eine hohe Voraussagekraft für die
Untersuchung der Eigenschaften von größeren metabolischen Netzwerken besitzt. Zusammen mit einer auf Constraints-basierten Modellierung liegt der Vorteil der SNA
darin, dass sie nur auf wenigen, aber konkreten Gesetzmäßigkeiten und Annahmen
basiert, von denen die meisten für prokaryotische metabolische Netzwerke unter vielen physiologischen Bedingungen gelten.
Bei der Constraint-basierten Modellierung sind vorweg Informationen oder Annahmen über die einzelnen Mechanismen und Parameter einer Reaktion nicht erforderlich. Wenn jedoch solche Informationen verfügbar sind, wie zum Beispiel dass ein bestimmter intrazellulärer Fluss experimentell gemessen wurde, können diese Informationen als zusätzliche Einschränkung in das Modell integriert werden [49, 66].
Wie im Vorfeld schon erwähnt, besteht ein metabolisches Netzwerk aus zwei Elementen: den Spezies beziehungsweise Metaboliten und den Reaktionen. Hierbei bestimmt eine Reaktion, welche Metaboliten bei welchem Verhältnis miteinander zu
einem oder mehreren anderen Metaboliten reagieren. Eine Systembegrenzung, welche zum Beispiel die Zellmembran darstellt, trennt die internen Metaboliten, welche
im Innern des Systems sind und im Rechenmodell berücksichtigt werden, von den extrazellulären Metaboliten, die sich oft außerhalb des Rechenmodells befinden und als
externe Metaboliten definiert werden. Reaktionen, die in das System führen oder es
verlassen, werden als Austauschflüsse deklariert. Metaboliten, die im Netzwerk verbraucht werden, werden keine Austauschflüsse zugewiesen. Den internen Reaktionen
sowie auch den Austauschflüssen können feste Raten oder Grenzwerte zugewiesen
werden.
9
Kapitel 1. Einleitung
1.3. Biokraftstoffe
it dem anhaltenden Wachstum der Weltbevölkerung und der fortschreitenden
Industrialisierung steigt parallel der weltweite Verbrauch von Kraftstoffen.
Die Entwicklung von Technologien zur langfristigen und nachhaltigen Produktion von erneuerbaren Kraftstoffen auf globaler und lokaler Ebene ist ein bedeutendes Anliegen der heutigen Zeit und auch in Zukunft [67]. Da es unvermeidlich
ist, dass fossile Brennstoffe in naher oder ferner Zukunft aufgebraucht sind, ist es eine Herausforderung für die Wissenschaft, alternative Produktionsmöglichkeiten aus
erneuerbaren Energien zu entwickeln. Für die Erzeugung von Strom existieren bereits einige CO2 -freie Produktionssysteme, wie zum Beispiel Photovoltaik, Windenergie, Erdwärme und Wellen- und Wasserkraftwerke. Jedoch für die Produktion von
Kraftstoffen, welche aktuell 70 % des gesamten Energieverbrauchs darstellen [68],
ist es noch nicht möglich, in diesem Ausmaß Kraftstoffe in einer nachhaltigen Art und
Weise zu erzeugen.
M
Fossile Brennstoffe dienen nicht nur als Kraftstoff, sondern auch zur Herstellung
von Chemikalien, die für das moderne tägliche Leben benötigt werden. Dies führt zu
zahlreichen Problemen, unter anderem zu einem alarmierenden Grad an Verschmutzung unseres Ökosystems [69]. Um uns aus dieser Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen zu lösen, ist die Entwicklung nachhaltiger industrieller Verfahren zur Synthese von Kraftstoffen und Chemikalien aus Bioressourcen erforderlich [70–72]. Mehrere
neue Technologien wurden entwickelt, um das anhaltende Problem der Verschmutzung der Erdatmosphäre und des daraus resultierenden Treibhauseffektes einzudämmen. Hierbei geht es vor allem darum, die Nutzung von fossilen Brennstoffen einzuschränken und durch die Produktion flüssiger Biokraftstoffe der ersten Generation
wie Fettsäureester (Biodiesel) [73], Alkane [74] und höhere Alkohole aus erneuerbaren Quellen [75–77] zu kompensieren. Die meisten dieser Prozesse der Biokraftstoffproduktion haben einen großen Nachteil: sie basieren auf der Nutzung von Mikroorganismen, die unterschiedliche Kohlenstoffquellen, hergestellt aus Landpflanzen, verstoffwechseln. Für die Kohlenstoffquellen dienen vor allem höhere Pflanzen wie Mais,
Zuckerrohr, Soja oder Ölpalmen als Grundlage [78, 79].
Damit steht die Biokraftstoffproduktion jedoch im Wettbewerb mit der landwirtschaftlichen Nutzung von Flächen für Nahrungspflanzen und führt somit zu erhöhten Lebensmittelkosten [80, 81]. Zudem führt die Herstellung von Biokraftstoffen
aus Landpflanzen (wie zum Beispiel Zuckerrohr) zu großen ökologischen Kosten im
Vergleich zur Nutzung von fossilen Brennstoffen. Hier sind vor allem die Abholzung
von Regenwäldern, welche durch die Brandrodung eine große Menge an Emissionen
von Treibhausgasen und beträchtliche Schäden am Ökosystem verursachen, zu nennen [81]. In neuester Zeit gilt in der Wissenschaft deswegen das Interesse besonders
der Nutzung von aquatischen photobiologischen Mikroorganismen, wie Cyanobakterien oder auch Grünalgen, die als biotechnologische Nutzorganismen für die Umwandlung von Sonnenenergie, H2 O und CO2 in Kohlenwasserstoffkraftstoffe [82] oder deren
Vorstufen [83] genutzt werden können.
10
1.3. Biokraftstoffe
1.3.1. Cyanobakterien als Biokraftstoffproduzenten
Die direkte Umwandlung von Sonnenenergie in einen flüssigen Kraftstoff durch photosynthetische Mikroorganismen ist eine attraktive Alternative zu fossilen Brennstoffen. Besonders hervorzuheben ist diesbezüglich die Verwendung von Cyanobakterien
als Produzenten, da sie mehrere Vorteile besitzen: Das Genom vieler Stämme steht
bereits vollständig sequenziert zur Verfügung und es existieren Werkzeuge, die eine
genetische Manipulation leicht machen beziehungsweise sie von sich aus natürlich
transformierbar sind [24, 84–87]. Sie sind in der Lage, oxygene Photosynthese unter
Verwendung von Wasser als Elektronendonor zu betreiben und können bis zu 10 %
der Sonnenenergie in Biomasse konvertieren. Damit sind sie in ihrer Leistung Pflanzen und Algen überlegen. Im Vergleich erreichen herkömmliche Pflanzen wie Mais
oder Zuckerrohr nur eine Rate von ca. 1 % und Algen bis zu 5 % [88]. Insbesondere
besitzen Cyanobakterien eine höhere Wachstumsrate im Vergleich zu Pflanzen (Biomasseproduktion) und können durch ihre natürliche Vielfalt an einer Vielzahl von
Standorten zu einer hohen Dichte wachsen, die per se nicht für die Landwirtschaft
genutzt werden können. Somit wird der Konflikt zwischen der Nutzung von Ackerflächen für Nahrungsmittel oder zur Herstellung von Biokraftstoffen gelöst. Zudem ist
es möglich, die Biokraftstoffe in der Nähe des Kraftstoffverbrauchs zu produzieren
und so die Transportkosten zu reduzieren. Des weiteren haben aquatische Systeme
gegenüber Landpflanzen den Vorteil, dass diese nicht auf das Vorhandensein von Süßwasser beschränkt sind [89], sondern auch eine Vielzahl anderer Wasserquellen, wie
Salz-, Brack-, Meer- und Abwasser [90] nutzen können und nur einfache Nährstoffanforderungen besitzen (vor allem Wasser, Sonnenlicht und CO2 ) [87].
In der Literatur wurden bereits mehrere Beispiele von aquatischen Systemen zur
direkten Umwandlung von Kohlenstoffdioxid, Wasser und Sonnenlicht in potenzielle
Energieträger beschrieben. Darunter fallen zum Beispiel Ethylen [91], Isopren [10],
Ethanol [9] und Butanol [82]. Für die Produktion solcher Biokraftstoffe ist es wichtig
sicherzustellen, dass eine gute Verträglichkeit zwischen dem Stamm und dem biotechnologischen Endprodukt herrscht. Der gesamte Umwandlungsprozess innerhalb des
Produktionsstamms wird stark durch seine metabolischen Kapazitäten limitiert. Insbesondere gilt dies für die Verfügbarkeit von Vorläufermetaboliten und Cofaktoren,
aber auch die Toleranzgrenze bezüglich der Toxizität für chemische Zwischenstufen
oder des spezifischen Endproduktes können die Produktion einschränken [92]. Andere Faktoren, die auch berücksichtigt werden müssen, sind zum Beispiel das Verfahren
zur physischen Trennung des gewünschten chemischen Endprodukts von dem Produktionssystem und die Eignung, Verteilung und Nutzung des Kraftstoffes in den bestehenden Infrastrukturen.
11
Kapitel 1. Einleitung
1.4. Zielstellung dieser Arbeit
as Ziel dieser Arbeit ist eine Beschreibung und Analyse des cyanobakteriellen
Stoffwechsels mit dem Fokus speziell auf den Stoffwechsel von Synechocystis
sp. PCC 6803. Zu diesem Zweck soll zunächst ein metabolisches Netzwerk von
Synechocystis sp. PCC 6803 rekonstruiert werden, welches mit der Zeit erweitert und
verfeinert wird, um eine möglichst getreue Abbildung des Stoffwechsel zu gewähren.
Dieses Modell soll zum einen als umfassende Wissenssammlung über den Stoffwechsel und die metabolischen Enzyme dienen und zum anderen unter Verwendung der
Flussbilanzanalyse eingehend untersucht werden.
Ein wesentlicher Fokus der Betrachtungen soll dabei auf der Analyse des phototrophen Wachstums bei Anwesenheit von Licht gegenüber dem Stoffwechsel bei Abwesenheit von Licht, der auf der Nutzung von Speicherstoffen beruht, liegen. Die Ergebnisse und Erkenntnisse, die aus dieser systematischen Analyse gewonnen werden,
können dazu verwendet werden, um unklare oder noch nicht klar definierte Stellen
im metabolischen Netzwerk hervorzuheben und diese zum Beispiel durch neue experimentelle Ansätze zu entschlüsseln. Die neuen Ergebnisse aus solchen Experimenten
können wiederum dazu beitragen, das existierende Modell zu validieren und zu verbessern, dabei helfen neue Hypothesen zu formulieren oder durch Abgleich mit dem
Netzwerk zu weiteren Diskussionen anzuregen. Zudem soll mithilfe der Flussbilanzanalyse das genomskalige metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
für eine Anwendung aus dem Bereich des Metabolic Engineering genutzt werden. Zu
diesem Zweck soll das metabolische Modell um zusätzliche Synthesereaktionen für
verschiedene Biokraftstoffe aus der Literatur erweitert und deren Biosynthesen innerhalb des Netzwerkes eingehend analysiert werden. Neben dem Vergleich der metabolischen Anforderungen und der maximalen theoretischen Energiegewinne der jeweiligen Kraftstoffe untereinander, sollen weiterhin Methoden angewendet werden, die es
erlauben mögliche Ziele für eine genetische Manipulation zu identifizieren, die eine
effektivere Produktsynthese in vivo ermöglichen könnten.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit soll der Vergleich mit dem Stoffwechsel anderer
Cyanobakterienstämmen sein. Hierbei soll speziell die Diversität innerhalb des Zentralstoffwechsels und der Speicherstoffe, die für den Stoffwechsel bei Abwesenheit von
Licht benötigt werden, im Vordergrund stehen. Da Cyanobakterien die einzigen bekannten Prokaryoten darstellen, die eine oxygene Photosynthese betreiben, können
die Ergebnisse und Erkenntnisse aus dem Vergleich mehrerer Cyanobakterienstämme
dazu beitragen, ein besseres Verständnis für den phototrophen Stoffwechsel an sich
zu erlangen, aber auch über dessen Entwicklung innerhalb dieses Phylums. Darüber
hinaus soll für diese Arbeit die Rekonstruktion eines zweiten metabolischen Netzwerkes eines weiteren Cyanobakterienstammes erfolgen. Das Ziel ist es, dieses wiederum
mithilfe der Flussbilanzanalyse zu charakterisieren und zu untersuchen. Dabei soll
vor allem der Schwerpunkt auf dem Vergleich zum vorher rekonstruierten metabolischen Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 liegen, insbesondere auf Basis der
Netzwerktopologie und der Analyse des metabolischen Potenzials.
D
12
KAPITEL
2
Das metabolische Netzwerk von
Synechocystis sp. PCC 6803
Dieses Kapitel basiert auf den Veröffentlichungen:
[93] H. Knoop, Y. Zilliges, W. Lockau und R. Steuer (2010). The Metabolic Network
of Synechocystis sp. PCC 6803: Systemic Properties of Autotrophic Growth. Plant Physiol., 154(1):410–422
[94] H. Knoop, M. Gründel, Y. Zilliges, R. Lehmann, S. Hoffmann et al. (2013). Flux Balance Analysis of Cyanobacterial Metabolism: The Metabolic Network of Synechocystis
sp. PCC 6803. PLoS Comput Biol, 9(6):e1003081
13
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Vorwort
as folgende Kapitel behandelt die Rekonstruktion und Analyse des genomskaligen metabolischen Netzwerkes des Cyanobakteriums Synechocystis sp.
PCC 6803. Es werden Details zum Rekonstruktionsprozess des metabolischen
Netzwerkes gegeben und die generellen Eigenheiten und Charakteristika des Stoffwechsels von Synechocystis sp. PCC 6803 beschrieben. Unter Zuhilfenahme der Flussbilanzanalyse wird der cyanobakterielle Stoffwechsel unter phototrophen Bedigungen
und unter Abwesenheit von Licht genauer untersucht. Zu diesem Zweck wird auch die
Modellierung eines kompletten Tagesablaufes vorgestellt und das Verhalten einzelner
Stoffwechselreaktionen betrachtet, um nähere Schlüsse über die zeitliche Koordination des Stoffwechsels zu ziehen.
Insbesondere behandelt dieses Kapitel die Analyse der Einflüsse von verschiedenen
Netzwerktopologien auf die optimale Flussverteilung innerhalb des metabolischen
Netzwerkes. Speziell werden die Auswirkungen eines Glyoxylat-Shunts im metabolischen Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 beschrieben und zusammen mit
vorgestellten experimentellen Ansätzen und Daten, gemessen von Marianne Gründel
und Yvonne Zilliges, eingehend untersucht und diskutiert.
D
14
2.1. Material und Methoden
2.1. Material und Methoden
2.1.1. Computergestützte Modellierung von metabolischen Netzwerken
Im Allgemeinen können Konzentrationsveränderungen der verschiedenen Spezies in
einem strukturierten metabolischen Netzwerk über die Zeit als System von Differenzialfunktionen beschrieben werden. Für ein metabolisches Netzwerk N, mit m internen
Spezies und n Reaktionen, ist die stöchiometrische Matrix S des Systems eine (m × n)Matrix, wobei ein Element Sij der stöchiometrische Koeffizient der Spezies i in der
Reaktion j ist. Die Spalten von S werden mit S1 ,..., Sn bezeichnet. Der Fluss durch
die i-te Reaktion wird als vi definiert. Wenn der Vektor c˙ als Änderung der Metabolitkonzentrationen jeder möglichen Flussverteilung deklariert wird, erhält man für jede
beliebige Flussverteilung v die Gleichung [95]:
S · v = c˙
2.1.2. Flussbilanzanalyse
Im Metabolismus eines Organismus laufen Reaktionen normalerweise schnell ab und
ebenso verhält es sich auch mit den an den Reaktionen beteiligten Spezies, die schnell
umgesetzt werden, im Vergleich zu beispielsweise regulatorischen Schritten. Bei einer
Flussbilanzanalyse (Flux Balance Analysis) eines metabolischen Netzwerkes wird davon ausgegangen, dass über längere Sicht gesehen, die Metabolitkonzentrationen der
internen Spezies und die Reaktionsraten konstant bleiben, dass heißt es existieren
keine Netto-Veränderungen der Konzentrationen. Man geht von einer Massenbilanz
(Mass Balance) aus beziehungsweise genauer von einem Fliessgleichgewicht (Steady
State) [96]. Dies bedeutet für jede stationäre Flussverteilung v0 gilt c˙ = 0 (Steady
State-Annahme). Somit erhält man:
S · v0 = 0
Externe Spezies, wie zum Beispiel extrazelluläre Nährstoffe wie Glucose oder Stoffe, die innerhalb der Zelle akkumulieren dürfen, werden bei der Massenbilanz ausgeschlossen. Das homogene System von linearen Gleichungen fordert, dass die Produktion, also die Summe aller positiven Flüsse und der Verbrauch, also die Summe aller
negativen Flüsse, einer Spezies über einen gewissen Zeitraum sich aufheben und somit gleich sein müssen. Auf der Ebene des Netzwerkes schränkt die Massenbilanz den
Raum der zulässigen Flüsse ein, so dass nur bestimmte Kombinationen von Flusswerten vio möglich sind. Die triviale Lösung mit v0 = 0 würde ein thermodynamisches
Gleichgewicht mit null Freiheitsgraden widerspiegeln und wäre bei der Analyse des
metabolischen Netzwerkes einer Zelle nicht von Interesse.
Aus der Linearen Algebra ist bekannt, dass alle möglichen Lösungen dieser Gleichung im sogenannten Nullraum K von S liegen [97]. Die Dimension des Nullraums
dim(K ), welche der Anzahl aller linear unabhängigen Lösungen entspricht, ist gleich
n − Rang(S). Der Nullraum K bildet einen konvexen, vielflächigen Kegel (siehe Abbildung 2.1). Die Ränder des Kegels sind durch die sogenannten Extreme Pathways [98]
15
2.1. Material und Methoden
Stöchiometrische und Reversibilitätseinschränkungen bezeichnet Palsson als nicht
veränderbare (non adjustable) Nebenbedingungen [64], in der Hinsicht, dass sie die
intrinsischen Eigenschaften des Systems darstellen. Zu diesen Nebenbedingungen gehören auch die von Beart et al. eingeführten thermodynamischen Nebenbedingungen [99]. Andere Nebenbedingungen, die in der Regel variabel sein können, werden
von Palsson als einstellbar (adjustable) bezeichnet [64]. Zum Beispiel können diese Bedingungen so gesetzt werden, dass sie bestimmten Umgebungsbedingungen oder biochemischen Bedingungen entsprechen. Hierzu zählen unter anderem regulatorische
Rahmenbedingungen [60] oder Metabolitkonzentrationen, die als Nebenbedingungen
fungieren [100]. Zusammen mit den nicht verstellbaren Nebenbedingungen können
diese die Vorhersage der stöchiometrischen Netzwerkanalyse präzisieren und zuverlässiger machen.
Normalerweise reicht die Einschränkung der Massenbilanz selber nicht aus, um
zu einer bestimmten Flussverteilung zu führen. Für die FBA wird deshalb noch angenommen, dass die Zellen über die Zeit ihren Stoffwechsel so entwickelt haben, dass
die internen Flüsse der Zelle eine oder mehrere Optimalitätskriterien erfüllen. Das
bedeutet, dass für die FBA eine Zielfunktion definiert wird, welche eine Anzahl an
möglichen Lösungen im Flussraum identifiziert. Für einzellige Organismen wie Cyanobakterien ist das häufigste Optimalitätskriterium die Maximierung der Biomasse.
Da in den meisten Fällen das Netzwerk so rekonstruiert wurde, dass Wachstum und
Reproduktion simuliert werden, wird demnach hierfür die Biomassezielfunktion (Biomass Objective Function) (BOF) gewählt [58]. Es wird angenommen, dass die metabolischen internen Flüsse so verteilt sind, dass sie eine maximale Ausbeute der Synthese
aller metabolischen Komponenten, die für das Zellwachstum benötigt werden, im richtigen Verhältnis ermöglichen.
BOF[v0 ] −→ maximal
Somit ist die resultierende Lösung eine Flussverteilung v0 , welche die BOF maximiert und die Steady State-Bedingung und alle vorher festgelegten Nebenbedingungen berücksichtigt. Eine alternative Flusslösung, welche energetisch ungünstiger
sein würde, aber eine schnellere Umwandlung der einzelnen Metaboliten ermöglichen
könnte, würde von der FBA nicht gefunden werden [101]. Es konnte schon mehrfach
gezeigt werden, dass experimentelle Wachstumsraten von Bakterien für eine Vielzahl
von unterschiedlichen Substraten erfolgreich durch eine FBA vorhergesagt werden
können [61, 102].
Die Lösung der FBA, also die gesuchte optimale Flussverteilung, wird durch das
Lösen der linearen Gleichungen mittels der Linearen Programmierung (LP) gefunden [103]. Ein lineares Programm wird durch eine lineare Zielfunktion und eine Menge von linearen Nebenbedingungen definiert. Dabei kann die Zielfunktion ein Fluss
durch eine bestimmte Reaktion oder eine Linearkombination der Flüsse durch die Reaktionen sein. Sind die Nebenbedingungen gut definiert und mit Bedacht gesetzt, ist
das Lineare Programm lösbar und eine optimale Lösung wird unter Verwendung einer
LP-Solver-Software geliefert.
17
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Anwendungen der Flussbilanzanalyse
Wie beschrieben, kann die FBA die effektivsten und effizientesten Flussverteilungen
eines metabolischen Netzwerkes identifizieren, die eine bestimmte Zielfunktion maximieren. Um diese zu berechnen sind unterschiedliche Algorithmen und Software-Tools
frei verfügbar.
Im Laufe dieser Arbeit wurden für die meisten Optimierungsanalysen die COBRAToolbox (COnstraint-Based Reconstruction and Analysis) in der Version 2.0.5 (http://
opencobra.sourceforge.net/openCOBRA/Welcome.html) [104, 105] sowohl als auch der
CellNetAnalyzer in der Version 2012.1 (http://www.mpi-magdeburg.mpg.de/projects/
cna/cna.html) [106] und die FASIMU-Software [107] verwendet.
Die CORBA-Toolbox ist für die quantitative Vorhersage von zellulären Vorgängen
konzipiert worden und bedarf zudem, wie der CellNetAnalyzer, einer MATLAB-Umgebung. Außerdem benötigen beide Toolboxen für die Lineare Optimierungsanalyse, um
die LP zu lösen, eine separate Installation einer unterstützten LP-Solver-Software.
Für diese Arbeit wurden diese Toolboxen in der Umgebung von MATLAB 7.12.634
genutzt, einschließlich der MATLAB-Optimierungs-Toolbox und dem Gurobi Optimizer [108] als lineare LP-Solver-Software. Unter Verwendung der COBRA-Toolbox ist
es möglich, eine FBA durchzuführen. Die FBA sucht im Lösungsraum alle Flussverteilungen einer spezifischen Lösung, welche eine vorher definierte Zielfunktion maximieren. Die Schwierigkeit dabei besteht darin, eine geeignete Zielfunktion, wie Maximierung von Biomasse oder Maximierung einer Produktbildungsrate, zu finden [98]. Die
stöchiometrischen, metabolischen Netzwerke, die mithilfe der COBRA-Toolbox analysiert werden sollen, müssen vorher manuell oder mit einem anderen systembiologischen Netzwerkmodellierungsprogramm, wie zum Beispiel dem CellNetAnalyzer erstellt und leicht modifiziert werden. Die entsprechenden SBML-Datein der Netzwerke
von Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus elongatus PCC 7942 sind auf der
Webseite der elektronischen Version der Veröffentlichung Knoop et al. (2013) [94] beziehungsweise im elektronischen Anhang dieser Arbeit verfügbar.
Unter Verwendung der Flussbilanzanalyse können mittels der COBRA-Toolbox verschiedene selbst- oder vordefinierte Funktionen angewendet werden, um ein gegebenes metabolisches Netzwerk zu untersuchen. Dazu gehören unter anderem:
• Simulieren eines maximalen Wachstums (Optimal Growth):
Um das mögliche Maximum der Wachstumsrate zu berechnen, wird als Zielfunktion die Biomassesynthese definiert und über Lineare Optimierung die optimale
Flussverteilung berechnet. Hierbei können auch die Flussverteilungen für unterschiedliche Wachstumsbedingungen ermittelt werden.
• Robustheitsanalyse:
Die Robustheitsanalyse erlaubt die Berechnung, wie ein vorher definiertes Ziel
(definiert durch die Zielfunktion, zum Beispiel die Wachstumsrate) sich verändert, wenn der Fluss durch eine bestimme Reaktion in der Reaktionsrate variiert.
Somit kann beispielsweise der Effekt von einer abnehmenden Expressionsrate
18
2.1. Material und Methoden
eines bestimmten Enzyms beziehungsweise des Gens auf die Wachstumsrate untersucht werden.
• Simulieren von Gen-Knockout-Phänotypen:
Die Auswirkungen eines Gen-Knockouts auf die Zellwachstumsrate kann auch
durch die Lineare Optimierung vorhergesagt werden. Hierfür werden die obere und untere Grenze der Reaktionsrate des Enzyms, dessen Gen ausgeschaltet
werden soll, auf Null gesetzt. Anschließend kann ausgewählt werden, ob durch
eine FBA oder über den MOMA-Algorithmus (Minimization Of Metabolic Adjustment) der Effekt berechnet werden soll. Während bei der FBA einfach das maximale Wachstum erneut berechnet wird (ohne die spezifische Reaktion), versucht
MOMA [109] die Abweichungen der metabolischen Flüsse zwischen der optimalen Flussverteilung des Wildtyps und des Gen-Knockouts minimal zu halten.
• Flussvariabilitätsanalyse:
Mithilfe der COBRA-Toolbox ist es möglich, die Variabilität eines Flusses in Bezug auf die Maximierung der Zielfunktion zu berechnen. Dies bedeutet, wie stark
der Fluss durch eine bestimmte Reaktion variieren darf unter Berücksichtigung,
dass das Maximum der Zielfunktion um einen bestimmten prozentualen Wert
abweichen darf. Natürlich ist es möglich, keine Abweichung zu erlauben und
trotzdem die Variabilität jeder einzelnen Reaktion zu ermitteln.
Nachteile der Flussbilanzanalyse
Selbstverständlich besitzt auch die Anwendung FBA ihre Grenzen und Einschränkungen. Eines der wichtigsten Kriterien der FBA ist die Zielfunktion, welche für die spezifische Zelle beziehungsweise den spezifischen Zelltyp im Vorfeld bekannt sein muss.
Hier ist leicht zu erkennen, dass diese Zielfunktion vor allem für multizelluläre Organismen nicht leicht zu definieren ist. Allgemein ist es nicht möglich, dass eine einzelne
Zielfunktion den Zustand der metabolischen Flüsse für jede mögliche Wachstumsbedingung beschreibt [110].
Ein weiteres Defizit der FBA besteht darin, dass durch das Lösen des Optimierungsproblems, nur eine einzige Flussverteilung geliefert wird. Falls mehrere optimale Lösungen existieren, welches aufgrund alternativer Stoffwechselwege sehr oft der Fall
ist, gibt es keine Garantie, dass diese bestimmte Flussverteilung der gesuchten in
vivo Flussverteilung entspricht.
2.1.3. Rekonstruktion metabolischer Netzwerke
Die Rekonstruktion metabolischer Netzwerke folgt meist einem Standardverfahren
mit vier Schritten, welches im Detail in der Literatur beschrieben wurde [48, 111, 112].
Als erster Ausgangspunkt dient die annotierte Genomsequenz des spezifischen Organismus aus der GenBank-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) [113]
beziehungsweise aus einer spezifischen Datenbank, wie zum Beispiel für Cyanobakterien die CyanoBase-Datenbank (http://genome.microbedb.jp/cyanobase/) [114, 115],
19
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
die zusammen mit einer Stoffwechseldatenbank, wie unter anderem der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; http:// www.genome.jp/kegg/) [51], einen ersten Entwurf des Netzwerkes für den spezifizierten Organismus ergeben.
Als nächstes wird versucht, Lücken und Unstimmigkeiten innerhalb dieses ersten Entwurfs des Netzwerkes zu identifizieren und diese manuell auf Grundlage und
unter Zuhilfenahme der verfügbaren biochemischen Literatur, zu kuratieren. Jedoch
muss beachtet werden, dass nicht alle identifizierten, fehlenden Schritte auch fehlerhaften Lücken im jeweiligen metabolischen Netzwerk entsprechen. Besonders Cyanobakterien sind für ihr sehr kleines und „schlankes“ Genom bekannt, wie vor allem
die Gattung Prochlorococcus [36]. Bei einem anderen Beispiel, dem marinen Cyanobakterium UCYN-A, wurde erst vor kurzem gezeigt, dass der Sauerstoff erzeugende
Photosystem II-Komplex (PS II) in der Elektronentransportkette fehlt. Stattdessen
zeigt UCYN-A einen stark eingeschränkten, photofermentativen Stoffwechsel und ist
wahrscheinlich abhängig von essentiellen Verbindungen, die von anderen Organismen
synthetisiert werden [116]. In einem solchem Fall würde eine Vervollständigung dieser Stoffwechsellücke zu fehlerhaften Lösungen führen und Stoffwechselwege einbeziehen, die nicht im jeweiligen Organismus vorhanden sind.
Sobald innerhalb der Rekonstruktion die Synthese von allen relevanten Stoffwechselzwischenprodukten ermöglicht ist, wird der gesamte Satz von Reaktionen, also das
metabolische Netzwerk, in ein mathematisches Modell transferiert. Bei dieser Umwandlung in ein Rechenmodell werden mehrere zusätzliche Reaktionen, sogenannte Hilfsreaktionen in das Netzwerk integriert, welche nicht zu den „echten“ enzymatischen Reaktionen zählen. Zu diesen Hilfsreaktionen gehört unter anderem die
Bildung von Biomasse, welches einem zellulären Wachstum entspricht (siehe Kapitel 2.1.9). Eine weitere wichtige Hilfsreaktion ist die Reaktion für die zelluläre Maintenance, ein basaler Energieverbrauch, der für die Erhaltung zusätzlicher, nicht modellierter zellulärer Prozesse benötigt wird. Dieser basale Energieverbrauch wird in der
Regel durch das Hinzufügen einer ATP-verbrauchenden Reaktion (ATP-Hydrolyse) simuliert, aber auch die Nutzung von NADPH oder ein genereller Metabolitverbrauch
können ebenfalls in dieser Funktion berücksichtigt werden. In den metabolischen Modellen in dieser Arbeit wird der Energieverbrauch durch einen basalen ATP-Verbrauch
repräsentiert.
Darauffolgend muss das Netzwerk noch in ein computerlesbares Format umgewandelt werden. Dabei wird auf eine einheitliche Annotation sowie eine leichte Austauschmöglichkeit des Formates geachtet. Geeignet ist zum Beispiel das etablierte
SBML-Format (Systems Biology Markup Language) [117]. Das SBML-Format wird
als Standard-Austauschformat für die stöchiometrische Analyse von mathematischen
Modellen gesehen. Zu diesem Zweck stehen mehrere Software-Pakete zur Verfügung,
welche in der Lage sind, das SBML-Format zu lesen [104–107]. Abschließend wird
das Modell unter Verwendung von Constraint-basierten und anderen Methoden der
Systembiologie analysiert, mit denen es insbesondere möglich ist, Vorhersagen über
optimale Flussverteilungen zu treffen, um zum Beispiel phänotypische Daten zu validieren.
20
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
soziationen für jedes annotierte Gen und einer Reihe von zusätzlichen nicht enzymatischen (spontanen) Reaktionen und Transportprozessen bestand, erstellt werden. Darauffolgend wurden Ansätze unternommen, die bestehenden Lücken im Netzwerk iterativ zu schließen. Zu diesem Zweck wurden zunächst unvollständige Stoffwechselwege
identifiziert, indem überprüft wurde, ob das jeweilige Produkt oder der jeweilige Endmetabolit unter phototrophen Bedingungen synthetisiert werden kann. Besonders alle
Stoffe, die in der Biomassereaktion aufgeführt werden, müssen innerhalb des Netzwerkes synthetisierbar sein. Zudem müssen Metabolitbestände jeder internen Spezies, die
während des Wachstums vermindert werden, durch das Modell wieder auffüllbar sein.
Um die identifizierten Lücken in den Stoffwechselwegen zu schließen, wurden verschiedene Stoffwechsel-Datenbanken, wie die KEGG- , die BioCyc- und die BRENDADatenbank (BRaunschweig ENzyme DAtabase; http://www.brenda-enzymes.org/) [50]
sowie biochemische Fachliteratur durchsucht. Ein konkretes Beispiel für die Notwendigkeit der Einbeziehung spezieller Literatur zeigte sich bei Synechocystis für den
Fall der Photorespiration beziehungsweise der dazugehörigen Stoffwechselwege. Die
Aufklärung der einzelnen Schritte der Photorespiration, war zum Zeitpunkt der Rekonstruktion [93] für Synechocystis in den genannten Stoffwechseldatenbanken nicht
beschrieben und konnte nur im Detail aus der Literatur von Eisenhut et al. [118, 119]
entnommen werden.
Wenn die Literatursuche nicht erfolgreich war, wurde recherchiert, welche Reaktionen, in anderen Organismen vorhanden sind, um die Synthese des gewünschten Produktes zu gewährleisten. Hierbei begann die Suche zuerst in anderen Cyanobakterienstämmen und anschließend wurde diese auf weiter entfernte Organismen wie andere Bakterien oder Pflanzen ausgedehnt. Unter Verwendung des BLAST-Algorithmus
(http://blast.kazusa.or.jp/blast_search/cyanobase/Gene) [55] wurden zutreffende Kandidaten-Gene im Genom von Synechocystis identifiziert. Ein Beispiel für diesen Vorgang ist das Enzym Methylentetrahydrofolatreduktase (EC 1.5.1.20), welches für Synechocystis nicht annotiert ist, aber ein entsprechendes Gen für Cyanothece PCC 8801
gefunden werden kann. Diese Erkenntnis ermöglichte die Identifizierung eines Kandidaten-Gens slr2141 für dieses Enzym im Genom von Synechocystis sp. PCC 6803.
Wenn eine solche Suche durch einen direkten Vergleich kein zufriedenstellendes
Ergebnis lieferte, wurde in der primären Literatur nach einer Beschreibung des jeweiligen Stoffwechselweges recherchiert, beginnend mit dem Stoffwechsel von Cyanobakterien und anschließender Ausdehnung der Suche auf Pflanzen und andere Bakterien
und schließlich auf alle restlichen Organismen. Eine Liste aller neu annotierten Gene,
die für metabolische Enzyme kodieren könnten, sind in der Tabelle A.2 im Anhang
aufgeführt. Auch Details zum Vergleich, wie die jeweiligen Scores und E-Werte, sind
in dieser Liste zu finden.
Im Laufe des Rekonstruktionsprozesses fiel auf, dass die Spezifität für den jeweiligen Cofaktor für viele Enzyme bezüglich NAD(H) und NADP(H) unklar beziehungsweise nicht bekannt ist. Da das metabolische Netzwerk von Synechocystis über eine
NAD-NADP-Transhydrogenase (slr1239, slr1434) verfügt, die eine direkte Konvertierung zwischen NADH und NADPH in beide Richtungen ermöglicht, wurden für solche
22
2.1. Material und Methoden
Fälle generell nur NADP(H) als Cofaktor für die jeweilige Reaktion ins Modell übernommen.
2.1.5. Annahmen für das metabolischen Netzwerk von Synechocystis sp.
PCC 6803
Obwohl mehrere Rekonstruktionen des Cyanobakteriums Synechocystis schon seit
längerem in der Literatur verfügbar sind [120–126], wurden nur wenige Versuche
unternommen, um das fehlende metabolische Wissen zu systematisieren. Tatsächlich
sind mehrere Aspekte des metabolischen Netzwerkes und seiner wichtigsten Synthesewege noch unzureichend erforscht. Zum Beispiel fehlen innerhalb der aktuellen Rekonstruktion [94] komplette Synthesewege für die Aminosäuren Methionin und Asparagin. Ferner sind auch die Synthesewege für Serin, Glycin und Alanin wahrscheinlich
unvollständig beziehungsweise nicht vollständig aufgelöst. Um trotzdem die Synthese
von Methionin und Asparagin für die Biomasse zu ermöglichen, wurden die Reaktionsschritte für Methionin (EC 2.3.1.31, EC 2.5.1.49) von dem Cyanobakterium Microcystis aeruginosa NIES-843 übernommen. Für Asparagin wird angenommen, dass
eine Asparagin-Synthetase (EC 6.3.5.4) die Umsetzung von Asparagin aus Aspartat
katalysiert. Für alle anderen proteinogenen Aminosäuren sind die Synthesewege und
deren vermeintliche enzymatische Schritte annotiert oder konnten im Laufe der Rekonstruktion aufgeschlüsselt werden.
Um längere Perioden ohne Licht zu überleben, nutzen Cyanobakterien Glykogen,
Cyanophycin und Poly-β-Hydroxybutyrat (PHB) als natürliche interne Speicherverbindungen. Nichtsdestoweniger gilt auch für die Speicherstoffe, dass deren Stoffwechselwege, also der Aufbau und die spätere Mobilisierung, nicht komplett aufgelöst sind.
Während der Syntheseweg von internem PHB vollständig aufgeklärt ist und bereits
in der Literatur beschrieben wurde [127], sind die notwendigen Schritte zum enzymatischen Abbau bei Cyanobakterien zum jetzigen Zeitpunkt nicht bekannt. Zudem
sind enzymatische Schritte zur Synthese mehrerer Zellwandkomponenten, wie UDPGlucose (UDP-Glucose-Phosphorylase; EC 2.7.7.9) und vor allem Glycerolipide lückenhaft beziehungsweise nicht annotiert. Auch die Synthesewege der Cofaktoren Vitamin B6 und B12 weisen einige fehlende enzymatische Schritte auf.
Eine wesentliche Unklarheit für Synechocystis betrifft den Eletronentransport innerhalb der Elektronentransportkette. Es ist nicht vollständig geklärt, ob das pflanzliche Plastochinon oder das bakterielle Ubichinon als Elektronentransporter fungiert.
Während der pflanzliche Syntheseweg des Plastochinons nahezu vollständig in Synechocystis annotiert ist, zeigen Knockout-Studien von Dähnhardt et al. (2002) [128],
dass eine Ausschaltung dieses Stoffwechselweges keinen Effekt auf die photosynthetischen Funktionen von Synechocystis hat. Daher könnte es sein, dass ein alternativer
Stoffwechselweg für die Synthese von Plastochinon in Cyanobakterien beziehungsweise Synechocystis existiert, oder Synechocystis stattdessen Ubichinon verwendet. Ein
alternativer Weg für die Synthese von Plastochinon bei Cyanobakterien wurde erst
kürzlich von Sadre et al. (2012) [129] vorgeschlagen.
23
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Weitere fehlende enzymatische Schritte wurden durch gezielte BLAST-Suchen identifiziert und geschlossen. Hierfür wurde die Suche zunächst mit nah verwandten Cyanobakterien begonnen [130]. Darüber hinaus wurde extensiv in der verfügbaren biochemischen Literatur recherchiert, um mögliche alternative enzymatische Wege zu
identifizieren. Eine Liste der fehlenden oder unklaren enzymatischen Schritte und notwendigen Ergänzungen, damit alle Bedingungen für die Synthese der Biomasse und
damit das Wachstum in silico gewährleistet wird, sind in der Tabelle A.1 im Anhang
aufgeführt.
2.1.6. Die Synthese von Glycin und Serin
Für Serin und Glycin wurde angenommen, dass eine Synthese über den GlyoxylatStoffwechsel möglich ist, welcher durch Eisenhut et al. (2008) [119] detailliert beschrieben wurde. Dabei dient insbesondere Glyoxylat, welches während der Photorespiration zwangsläufig gebildet wird, als Vorstufe für die Aminosäuren Glycin, Serin und
Cystein.
Eine weitere Möglichkeit der Serin-Synthese besteht durch die Existenz eines Phosphoserin-Weges. In diesen Weg sind eine 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.95), eine Phosphoserin-Transaminase (EC 2.6.1.52) und eine PhosphoserinPhosphatase (EC 3.1.3.3) involviert. Von diesen drei Enzymen ist alleinig die 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase zum Zeitpunkt der Rekonstruktion in den Stoffwechselund Genomdatenbanken für Synechocystis annotiert. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass für Hydrogenobacter thermophilus eine Phosphoglycerat-Mutase die Funktion einer Phosphoserin-Phosphatase übernehmen kann [131]. Da mehrere dieser Phosphoglycerat-Mutasen im Genom von Synechocystis auffindbar sind [130], ist es sehr
wahrscheinlich, dass auch für Synechocystis eine Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität
einer Phosphoglycerat-Mutase existiert.
Aufgrund dieser Hypothese wurden experimentelle Ansätze für ein solches Szenario definiert, mit denen eine Aktivität der Reaktion der Phosphoserin-Phosphatase
in Zellextrakten von Synechocystis nachgewiesen werden konnte. Anschließend war
es möglich, die zugehörige Phosphoglycerat-Mutase zu identifizieren (slr1124; persönliche Kommunikation Wolfgang Lockau). Ferner konnte im Labor die Aktivität des
gesamten Phosphoserin-Weges in Synechocystis nachgewiesen und die entsprechende Transaminase identifiziert werden (persönliche Kommunikation Wolfgang Lockau
und Martin Hagemann). Abschließend wurde daraufhin der komplette PhosphoserinWeg in das stöchiometrische Modell von Synechocystis übernommen.
2.1.7. Formale Eigenschaften des metabolischen Netzwerkmodells
Eine der wichtigsten Eigenschaften eines Netzwerkes ist, dass das Netzwerk in sich
konsistent ist und alle Ladungen und Atome, besonders auf der Ebene der Protonen,
innerhalb der Reaktionen ausgeglichen sind. Für das Synechocystis-Netzwerk wurden
diese Kriterien unter Verwendung der COBRA-Toolbox [105] und der SuBliMinaLToolbox (durchgeführt von Neil Swainston) [132] überprüft und gegebenenfalls kor-
24
2.1. Material und Methoden
rigiert. Für den Protonen- und Ladungsausgleich ist der vorherrschende pH-Wert
des Milieus entscheidend. Unter Standardbedingungen variiert der intrazelluläre pHWert von Synechocystis im Laufe des Tages zwischen ca. 7,2 und 7,8 [133]. Der Einfachheit halber und aufgrund der Datenlage wurde bei der Rekonstruktion ein pH-Wert
von 7,00 als Referenzzustand angenommen.
Zur Durchführung der Simulationen und dem Transfer des Modells in verschiedene
Analyse-Softwares wurde das metabolische Modell im MIRIAM-kompatiblen SBMLStandard [134] exportiert. Unter anderem wurden dabei alle Metaboliten des Netzwerkes, wenn möglich mit ihrer entsprechenden CheEBI ID (Chemical Entities of Biological Interest) [135], referenziert. Zudem wurde eine SBML-Version des Netzwerkes
speziell für die Analysen unter der Verwendung der COBRA-Toolbox erstellt.
2.1.8. Kriterien für die Modellierung des metabolischen Netzwerkes
Für die Flussbilanzanalyse des phototrophen Wachstums von Synechocystis sp. PCC
6803 wurde angenommen, dass ausschließlich Nitrat als einzige Stickstoffquelle fungiert und über einen ATP-abhängigen Transport in die Zelle gelangt. Eine Verwendung von Harnstoff oder Ammoniak, welche ebenfalls als Stickstoffquelle für Synechocystis fungieren könnten, wurde für die Simulationen nicht berücksichtigt. Die
Aufnahme von Kohlenstoff wurde ausschließlich in Form von Hydrogencarbonat über
einen ATP-abhängigen Transporter [136] beschränkt. Das heterotrophe beziehungsweise mixotrophe Wachstum, welches mit der Aufnahme von Verbindungen mit mehreren Kohlenstoffatomen wie Glucose einhergeht, wurde nicht genauer untersucht.
Auch wurde die Aufnahme von komplexeren Verbindungen, wie zum Beispiel von Aminosäuren oder Putrescin, nicht in den Simulationen betrachtet.
Für die Simulationen wurde nur der Licht-Eingang in Form von der Anzahl einfallender Photonen als Austauschfluss festgelegt, während die Aufnahme von Nitrat, Sulfat und Kohlenstoff (in Form von Hydrogencarbonat) nicht beschränkt wurde. Durch
diese Vorgehensweise wurde die Optimierung über zwei Schritte, wie es bei Shastri
und Morgan (2005) [120] der Fall ist, auf einen Schritt reduziert. Diese hatten zuerst
die Bildung von Biomasse mit einer festen Kohlenstoffaufnahme und unbegrenztem
Licht optimiert und anschließend den Licht-Eingang bei gleichbleibender Biomassebildung als zusätzliche Nebenbedingung minimiert. Für die Simulationen des phototrophen Wachstums mittels der Flussbilanzanalyse wurde immer von einer Verdopplungszeit von 24 Stunden für Synechocystis sp. PCC 6803 ausgegangen, welches einer
Wachstumsrate von ungefähr 0,0289 h-1 entspricht.
Neben der BOF wurde zusätzlich ein basaler ATP-Verbrauch (Maintenance) für jede
Flussoptimierung angenommen. Diese entspricht einem allgemeinen ATP-Verbrauch
aller übrigen zellulären Prozesse, die nicht vom metabolischen Netzwerk abgedeckt
werden, wie zum Beispiel Regulationsprozesse. Da keine experimentellen, zuverlässigen Daten in der Literatur zu dieser Thematik zur Verfügung standen, wurde der Wert
auf ca. 10 % der maximalen ATP-Erzeugung durch die Photosynthese festgelegt. Es
stellte sich heraus, dass die basale ATP-Nutzung, im Gegensatz zu der Situation in heterotrophen Organismen, keinen qualitativen Einfluss auf die FBA-Lösung besitzt, da
25
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Tabelle 2.1.: Eingangsparameter für die FBA des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC
6803. Aufgeführt sind die festgelegten Flussraten [mmol gDW-1 h-1 ] für die entsprechenden Reaktionen
im Netzwerk für das phototrophe Wachstum (Licht) und bei Abwesenheit von Licht (Dunkel).
Reaktion
Reaktionsnummer Licht
Dunkel
Lichteingang
R443
18,7
0
Diverse Kohlenstofftransporter
R674
R675
R676
R677
R678
R679
R680
R681
R682
R685
R686
R687
R712
R713
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
basaler ATP-Verbrauch
R147
0,13
0,07
Cytochrom-c-Oxidase
Mehler-ähnliche Reaktion
R457
R481
0,2263
0,2263
0
0
Sauerstoffradikale am PS II
Mehler-Reaktion
R480
R482
0,0477
0,0473
0
0
Glykogenmobilisierung
R765
0
0,01
Biomassezielfunktion
R147
max.
max.
durch eine simple Erhöhung der Lichtintensität beziehungsweise der Photonenanzahl
dieser Wert ausgeglichen werden kann.
Für die Simulation von Wachstum bei Abwesenheit von Licht wurde einzig Glykogen als Speicherstoffverbindung berücksichtigt. Ferner wird für dieses Szenario festgelegt, dass die Reaktion der Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.4) (GDH) irreversibel abläuft. Andernfalls wäre es möglich, dass diese spezifische Reaktion, zusammen
mit anderen Reaktionen, als zusätzliche Transhydrogenase fungieren könnte, was es
für manche Simulationsszenarien bei Abwesenheit von Licht, in denen eine inaktive Transhydrogenase erwünscht war, zu vermeiden galt. Alle Eingangsparameter der
FBA des Synechocystis-Modells für das phototrophe Wachstum sowie das Wachstum
bei Abwesenheit von Licht, sind in der Tabelle 2.1 aufgeführt.
26
2.1. Material und Methoden
Die Optimierung der Biomasseproduktion ergibt in den meisten Fällen keine eindeutige Lösung, sondern es ist möglich, dass viele Flusslösungen die Optimierungskriterien erfüllen. Um hier weiter anzusetzen, können noch weitere Einschränkungen bei
der Optimierung als Kriterium dienen. Es ist zum Beispiel möglich, auch die Minimierung der gesamten Flusswerte als weitere Bedingung für das Optimierungsproblem
festzulegen. Dies wird normalerweise angewandt, um die Minimierung der Synthesekosten von metabolischen Enzymen, die für eine bestimmte Flusslösung benötigt
werden, zu repräsentieren [137]. Alle für diese Arbeit relevanten Flussverteilungen
wurden unter Berücksichtigung dieser zusätzlichen Bedingung berechnet.
2.1.9. Die Biomassezielfunktion
Eine besondere Bedeutung für die FBA hat die Definition einer Biomassezielfunktion
(Biomass Objective Function) (BOF), die meistens als Zielfunktion bei einer FBA fungiert. Diese Biomassefunktion ist eine Hilfsreaktion, welche das zelluläre Wachstum
repräsentiert. Sie spezifiziert die molaren Verhältnisse aller zellulären Komponenten
beziehungsweise metabolischen Vorstufen, die nötig sind, ein Gramm Trockengewicht
von kompletten Zellen zu synthetisieren. Die Biomassezielfunktion kann sich je nach
den experimentellen Bedingungen ändern. Bei Cyanobakterien wird deswegen oft zwischen heterotrophem, mixotrophem oder phototrophem Wachstum unterschieden, da
sich bei diesen Zuständen auch die zelluläre Zusammensetzung ändert [120]. Für diese Arbeit wurde nur eine Biomassezusammensetzung für phototrophes Wachstum berücksichtigt.
Eine erste Definition der Biomassefunktion für Synechocystis wurde schon 2005
von Shastri und Morgan [120] und 2008 von Fu [122] vorgeschlagen. Allerdings basierte diese Biomassefunktion vor allem auf Vorstufen von Aminosäuren als Bestandteil
der Biomassezusammensetzung und war somit sehr beschränkt. Eine deutlich aufwändigere Funktion wurde durch Cogne et al. (2003) [138] für ein metabolisches Modell
von Arthrospira platensis, auch bekannt unter Spirulina platensis, einem weiteren
Cyanobakterium, bereitgestellt. Diese Funktion setzte sich aus fünf Komponenten von
Makromolekülen zusammen: Kohlenhydrate, Proteine, Lipide, RNA und DNA und das
Pigment Chlorophyll. Eine modifizierte Version dieser Biomasseformel wurde in den
ersten Versionen des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis verwendet [93].
Für die aktuelle Version des Netzwerkes wurde die Biomassefunktion, welche in
Nogales et al. (2012) [125] aufgeführt wird, modifiziert und verfeinert. Zu diesem
Zweck wurden zuerst die verschiedenen Bestandteile der Biomasse in sieben verschiedene Biomassekomponenten eingeteilt und einzelne Makromoleküle definiert: Proteine, DNA, RNA, Zellwandbestandteile, Lipide, lösliche Zellkomponenten, anorganische
Ionen und Pigmente. Außerdem wurden zusätzliche Metaboliten, die bei den Metabolitbestimmungen in den Zusatzinformationen von Nogales et al. (2012) [125] aufgeführt wurden, in die Biomasseformel integriert. Dazu gehört unter anderem Vitamin
B6 . Überdies wurde ein wachstumsabhängiger ATP-Verbrauch für den Energiebedarf
von Proteinsynthesen, Regulation und Wachstum mit einbezogen. Die komplette Biomasseformel ist in Tabelle 2.2 aufgeführt.
27
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Tabelle 2.2.: Die in dieser Arbeit verwendete Biomasseformel des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803. Die Biomasse ist dabei aufgeteilt in die Komponenten: Proteine, DNA, RNA,
Lipide, Zellwand, lösliche Zellkomponenten, anorganische Ionen und Pigmente. Sie enthält zusätzlich Glykogen als Speicherverbindung und einen wachstumsabhängigen ATP-Verbrauch (Tabelle aus Knoop et
al. (2013) [94]).
Zusammensetzung
Proteine
DNA
RNA
Zellwand
Lipide
lös. Zellkomponenten
anorgan.
Ionen
Pigmente
Biomasse
0,766 L-Alanin +
0,455,L-Arginin +
0,366 L-Asparagin +
0,454 L-Aspartat +
0,090 L-Cystein +
0,502 L-Glutamin +
0,546 L-Glutamat +
0,666 Glycin +
0,168 L-Histidin +
0,566 L-Isoleucin +
1,029 L-Leucin +
0,378 L-Lysin +
0,177 L-Methionin + 0,362 L-Phenylalanin + 0,463 L-Prolin + 0,524 L-Serin +
0,496 L-Threonin + 0,140 L-Tryptophan + 0,263 L-Tyrosin + 0,608 L-Valin
0,7749 dCTP + 0,8517 dTTP + 0,7772 dGTP + 0,8487 dATP
0,8080 GTP + 0,7300 ATP + 0,7799 CTP + 0,8012 UTP
0,4276 Lipid A-Disaccharid + 0,4276 Peptidoglycan
0,380 3-β-D-Galactosyl-1,2-Diacylglycerol +
0,2650 Digalactosyl-Diacylglycerol +
0,2550 Sulfoquinovosyldiacylglycerol + 0,100 Phosphatidylglycerol
1,147 Putrescin +
0,233 Spermidin +
0,010 Acetyl-CoA +
0,006 CoA +
0,003 Succinyl-CoA +
0,001 Malonyl-CoA +
0,062 NAD+ +
0,002 NADH +
0,004 NADPH +
0,012 NADP+ +
0,008 FAD+ +
0,008 Tetrahydrofolat +
0,008 5,10-Methenyltetrahydrofolat +
0,008 5-Methyltetrahydrofolat +
0,008 Thiamin-Diphosphat +
0,008 Pyridoxalphosphat +
0,008 Heme
O+
0,008 Heme A +
0,008 Heme +
0,008 Glutathion +
0,008 Cobalamin +
0,002 Undecaprenyl-Diphosphat +
0,008 10-Formyltetrahydrofolat +
0,008 Chorismat + 0,008 S-Adenosylmethionin + 0,008 Riboflavin
17,040 K+ + 1,136 NH4+ + 0,757 Mg2+ + 0,454 Ca2+ + 0,682 Fe2+ + 0,682 Fe3+ +
0,303 Cu2+
+ 0,303 Mn + 0,303 H2 MoO4 + 0,303 Co2+ + 0,303 Zn3 Cu2+ +
0,379 Sulfat + 0,379 Orthophosphat + 0,379 Na+
0,827 Chlorophyll a + 0,134 β-Carotin + 0,113 Zeaxanthin + 0,098 Echinenon +
0,063 γ-Carotin + 0,010 α-Tocopherol + 0,001 β-Tocopherol + 0,001 γ-Tocopherol +
0,009 δ-Tocopherol + 0,067 Phyllochinon
53,350 ATP +
53,350 H2 O +
0,51 Proteine +
0,031 DNA +
0,17 RNA +
0,059 Zellwand + 0,12 Lipide + 0,029 lös. Zellkomponenten + 0,01 anorgan. Ionen +
0,0244 Pigmente + 0,21031 Glykogen
2.1.10. Zeitaufgelöste Flussbilanzanalyse
Für die Modellierung eines vollständigen Tagesablaufes mithilfe der Flussbilanzanalyse wurde zunächst von einer Verdopplungszeit von etwa 24 Stunden ausgegangen.
Da bei der FBA der Fluss durch die einzelnen Biomassekomponenten in mmol pro
Stunde pro Gramm Trockengewicht gegeben ist, wurden die Flusswerte über 24 Stunden aufintegriert, um eine Schätzung der Gesamtmenge jedes Bestandteils über den
Tagesverlauf zu erhalten. Basierend auf diesen angegebenen Mengen, wurde ein artifizielles Szenario für die Simulation eines kompletten Tagesdurchlaufs postuliert:
• Eine kontinuierliche Synthese der DNA- und der anorganischen Ionen-Biomassekomponenten.
• Die Synthese der Protein-, RNA-, Zellwand- und Lipid-Komponenten wurde auf
die Lichtphase beschränkt.
28
2.1. Material und Methoden
• Für die Synthese der Pigmente wurden die Parameter für die Simulation so gewählt, dass diese zwei Stunden vor dem Beginn der Lichtphase startet und zwei
Stunden vor dem Beginn der Dunkelphase endet.
• Um den Bedarf an Energie in der Dunkelphase zu erfüllen, wenn kein Licht zugegen ist um die beiden Photosysteme anzuregen, wird angenommen, dass Glykogen, welches ab Mitte der Lichtphase aufgebaut wird, als Speicherverbindung
verwendet wird.
• Während der Lichtphase wurde eine stetige Respirationsrate der Cytochrom-cOxidase von 0,2263 mmol gDW-1 h-1 angenommen, dies entspricht ca. 10 % der
maximalen photosynthetischen Sauerstoffproduktion des Photosystems II. Während der Dunkelphase wird die Respirationsrate auf 0,005 mmol gDW-1 h-1 reduziert.
• Für die Aufrechterhaltung von zellulären Prozessen wird ein basaler ATP-Verbrauch (Maintenance) von 0,13 mmol gDW-1 h-1 während der Lichtphase festgesetzt. In der Dunkelphase wird der ATP-Verbrauch nicht festgesetzt, aber die
Synthese von ATP als Zielfunktion definiert.
• In der Simulation wurde für den Lichteinfall ein einfaches Szenario in einer
dreieckigen Form gewählt, beginnend mit einem linearen Anstieg bei der circadianen Zeit CT = 0 h und einem Maximum bei CT = 6 h mit einem Wert von
9,44 mmol Photonen gDW-1 h-1 und einem anschließenden linearen Abfall.
Tabelle 2.3.: Modifikationen der Faktoren für die Biomassekomponenten Proteine, DNA, RNA, Lipide,
Zellwand, lösliche Zellkomponenten, anorganische Ionen und Pigmente zu bestimmten Zeitpunkten des
Tages (Hauptschritte) für die zeitabhängige FBA. Die Synthese der DNA- und der anorganischen IonenKomponente bleibt über den gesamten Tagesablauf konstant. Die Pigmentsynthese erreicht ihr Maximum
am Anfang des Tages, während die Glykogensynthese erst nach CT = 6 h beginnt. In den Vormittagsstunden (CT = 0-6 h) und während der Dunkelphase (CT = 12-24 h) wurden die Faktoren dem nächstem
Hauptschritt angenähert (Tabelle aus Knoop et al. (2013) [94]).
Proteine
DNA
RNA
Zellwand
Lipide
lös. Zellk.
an. Ionen
Pigmente
Glykogen
0
6
7
0,55
0,38
0,39
0,18
0,06
0,13
0,03
0,13
0,04
0,09
0,02
0,13
0,04
0,09
0,02
0,04
0,00
0,01
0,32
0,01
0,32
CT [h]
8
0,39
konst.
0,13
0,04
0,09
0,02
konst.
0,01
0,32
9
10
11
0,43
0,46
0,57
0,14
0,05
0,10
0,02
0,15
0,05
0,11
0,03
0,19
0,07
0,14
0,03
0,01
0,24
0,01
0,19
0,00
0,00
29
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Der gesamte Tagesablauf wurde für die Simulation in 24 · 8 = 192 Optimierungsschritte unterteilt und für jeden einzelnen dieser Schritte wurde eine neue Biomassefunktion festgelegt. Die Übergänge zwischen den unterschiedlichen Biomassezusammensetzungen (Hauptschritten) wurden geglättet, dadurch dass die Differenz der einzelnen Faktoren innerhalb der Biomassefunktion durch die Anzahl der Zwischenschritte dividiert wurde und anschließend für jeden Schritt die Faktoren um diese Werte
geändert wurden. Die Hauptschritte der zeitabhängigen Biomassefunktion sind in Tabelle 2.3 gezeigt.
30
2.2. Ergebnisse und Diskussion
2.2. Ergebnisse und Diskussion
2.2.1. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Im Laufe der Arbeit wurde eine umfassende Rekonstruktion der primären Stoffwechselwege von Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) entwickelt. Die erste Version
dieser Rekonstruktion [93] umfasste die Hauptstoffwechselwege inklusive der photosynthetischen Lichtreaktionen, des Calvin-Benson-Zyklus, der Glykolyse, des Citratzyklus, des Pentosephosphatweges, der oxidativen Phosphorylierung, der Photorespiration, der Synthesen der proteinogenen Aminosäuren sowie der Bereitstellung von
Nukleotiden, Lipidvorstufen und Cofaktoren. Dieses Netzwerk wurde unter Berücksichtigung der immer weiter fortschreitenden Kenntnisse über den Organismus sowie
aus unterschiedlichen ergänzenden Netzwerkrekonstruktionen neueren Datums [120–
126, 139] erweitert .
Das Kernnetzwerk umfasst eine verbundene Sammlung aller bekannten Stoffwechselwege zur Synthese der Biomasse und Cofaktoren, von denen bekannt ist, dass sie
im Stoffwechsel von Synechocystis vorkommen. So umfasst die aktuelle Version der
Netzwerkrekonstruktion von Synechocystis [94] zusätzlich zu den vorher genannten
Stoffwechselwegen den Lipid- und Fettsäure-Stoffwechsel, die Biosynthese von Peptidoglycan, Chlorophyll a, verschiedenen Carotinoiden, Terpenoiden, Chinonen, Tocopherolen und Thiaminpyrophosphat sowie die Synthese von mehreren weiteren Cofaktoren, Vitaminen und vereinzelten stressassoziierten Metaboliten. Zusätzlich wurden
im Verlauf der weiteren Beschreibung des Stoffwechsels von Synechocystis die photosynthetischen Lichtreaktionen sowie die Transportprozesse qualitativ verbessert und
detailreicher beschrieben. Bei der Beschreibung der aufgeführten Stoffwechselwege
wurde auf die Vollständigkeit aller Synthesewege in Bezug auf die unterschiedlichen
Biomassekomponenten geachtet.
Um profunde Aussagen aus dem Netzwerk zu gewinnen, wurde während dieser
Arbeit zwischen einem Kernnetzwerk, welches die vorher genannten, gut validierten
Reaktionen enthält und einem erweiterten Netzwerk unterschieden. Das erweiterte
Netzwerk beinhaltet, zusätzlich zu den Reaktionen aus dem Kernnetzwerk, noch alle
verbleibenden annotierten Enzyme aus dem Genom von Synechocystis, welche eine putative Stoffwechselfunktion besitzen (siehe Abbildung 2.3). Dies bedeutet, dass auch
unzureichend validierte Reaktionen im erweiterten Netzwerk enthalten sind. Dies
führt in vielen Fällen dazu, dass Reaktionen unverbunden sind, ohne dass die jeweilig
beteiligten Metaboliten synthetisiert oder weiter verwendet werden können. Aus diesem Grund wurden für die rechnerischen Analysen ausschließlich das Kernnetzwerk
verwendet.
Während der Rekonstruktion wurde sichergestellt, dass die Vollständigkeit aller
Synthesewege in Bezug auf die Biomassekomponenten, Cofaktoren und Minderung
des Metabolitbestandes durch Wachstum gewährleistet wird. Das resultierende metabolische Netzwerk von Synechocystis umfasst in der aktuellen Version 677 Gene, die
für 491 Enzyme oder Enzymkomplexe kodieren. Hieraus ergeben sich 759 zusammenhängende Stoffwechselreaktionen, bei denen 601 unterschiedliche Spezies umgesetzt
31
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Abbildung 2.3.: Überblick über die Attribute des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC
6803: A) Unterscheidung zwischen dem Kernnetzwerk und dem erweiterten Netzwerk. B) Verteilung der
759 Reaktionen über die unterschiedlichen Stoffwechselwege des Netzwerkes. C) Aufteilung der unterschiedlichen Komponenten, die für die Biomasse (BOF) benötigt werden (ohne Glykogen und basalem
ATP-Verbrauch) (Abbildung aus Knoop et al. (2013) [94]).
werden. Von diesen 759 Reaktionen sind 679 enzymatisch katalysiert, einschließlich
56 Isoreaktionen, sechs spontan ablaufenden beziehungsweise nicht katalysierten Reaktionen, 61 Diffusions- und Transportreaktionen und 13 sogenannten Hilfsreaktionen, wie zum Beispiel Reaktionen der Lichtabsorption, Photophosphorylierung, Biomassebildung oder ein basaler ATP-Verbrauch (Maintenance).
Im Modell laufen die Reaktionen innerhalb sieben unterschiedlichen, voneinander
getrennten Kompartimenten der Zelle ab. Das sind: Der extrazelluläre Raum, welcher
alle Spezies umfasst, die sich außerhalb der Zellmembran befinden, die Zellmembran
sowie auch die Thylakoidmembran und der davon eingeschlossene periplasmatische
Raum und das Thylakoidlumen. Die meisten metabolischen Reaktionen laufen jedoch
im Cytosol der Zelle ab. Zuletzt sind noch die Carboxysomen zu nennen, welche eine
wichtige Rolle für die CO2 -Fixierung übernehmen (CO2 -Concentrating Mechanisms).
Die Rekonstruktion des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis konzentriert
sich auf eine funktionale Beschreibung des phototrophen Wachstums und die Verwertung von Speicherkomponenten als Energie und Kohlenstoffquelle bei Abwesenheit
von Licht. Die Aufnahme und Verwertung von zusätzlichen organischen Kohlenstoffquellen wird bei der mathematischen Modellierung nicht berücksichtigt. Die wichtigsten Eigenschaften des Netzwerkes wurden in Abbildung 2.3 zusammengefasst.
Die Rekonstruktion liegt auf der Webseite der elektronischen Version der Veröffentlichung Knoop et al. (2013) [94] im Anhang als SBML- und Excel-Datei vor (http://http:
//www.ploscompbiol.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pcbi.1003081).
Zusätzlich wurde eine detaillierte graphische Übersicht des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis angefertigt, welche im Anhang dieser Arbeit zu finden ist (siehe
Abbildung A.1).
32
2.2. Ergebnisse und Diskussion
2.2.2. Vereinbarkeit bestehender Rekonstruktionen
Während metabolische Rekonstruktionen von phototrophen Organismen im Vergleich
zu heterotrophen Mikroorganismen noch unterrepräsentiert sind, wurden vor und
während dieser Arbeit einige andere Rekonstruktionen eines metabolischen Netzwerkes von Synechocystis sowie von einer Reihe anderer Cyanobakterien publiziert.
Die erste Rekonstruktion von Synechocystis wurde bereits 2005 von Shastri und
Morgan [120] veröffentlicht und auch unter Verwendung der FBA untersucht. Dieses
erste Modell wurde zwei Jahre später von Hong und Lee (2007) [121] erweitert. Beide
Rekonstruktionen sind vergleichsweise klein und beschränken sich auf den Primärmetabolismus beziehungsweise den Zentralstoffwechsel von Synechocystis, einschließlich der Glykolyse, einem unvollständigen Tricarbonsäurezyklus (Tricarboxylic Acid
Cycle) (TCA-Zyklus) und dem Calvin-Benson-Zyklus. Zudem beinhalten beide Rekonstruktionen einen Glyoxylatzyklus, dessen Existenz jedoch umstritten ist. Das Vorhandensein des Glyoxylatzyklus in Synechocystis wurde zuerst von Yang et al. (2002)
[140] vorgeschlagen. Jedoch existieren keine schlüssigen Beweise für diese Behauptung und es wird angenommen, dass dieser im Wesentlichen in die Rekonstruktionen
aufgenommen wurde, um einen funktionalen C2 -Zyklus zu ermöglichen (siehe Kapitel 2.2.8).
Eine wesentlich größere genomskalige Rekonstruktion wurde 2008 von Fu [122]
veröffentlicht. Diese umfasst etwa 831 Stoffwechselreaktionen. Jedoch enthält diese
Rekonstruktion nur eine sehr geringe, manuelle Kuration, was durch spätere Veröffentlichungen bestätigt wurde. Demzufolge existieren sehr viele unvollständige Stoffwechselwege, die aber bei genauerer Betrachtung für eine Modellierung und Simulation unerheblich sind, da bei der Rekonstruktion die eingeschränkte Biomasseformel von Shastri und Morgan [120] (siehe Kapitel 2.1.9) verwendet wurde, wodurch
die zusätzlichen Reaktionen keine funktionelle Rolle bei den Simulationen übernehmen. Auch bei der Rekonstruktion von Fu [122] ist der von den Bakterien stammende
Glyoxylatzyklus implementiert.
2010 wurde die erste Version des Synechocystis-Netzwerkes im Rahmen dieser Arbeit publiziert [93], welche zum Teil noch nicht die hohe Komplexität besaß, wie die
aktuelle Version des Netzwerkes. Diese erste Version des Netzwerkes enthielt erstmals eine detaillierte Darstellung der Photorespiration und verzichtete auf eine Einbeziehung des bakteriellen Glyoxylatzyklus. Stattdessen wurde der unvollständige
TCA-Zyklus über den alternativen γ-Aminobutyrat (GABA)-Shunt geschlossen und
ermöglichte dadurch einen zirkulären Fluss bei der Abwesenheit von Licht. Kurz darauf wurden vier zusätzliche Rekonstruktionen veröffentlicht [123, 124, 139, 141], die
jeweils einen unvollständigen TCA-Zyklus und den Glyoxylatzyklus beinhalteten.
Erst vor kurzem wurde eine weitere Rekonstruktion von Nogales et al. (2012) [125]
vorgestellt, die eine erweiterte Biomassefunktion verwendet, welche aus der Literatur
abgeleitet wurde. Diese Rekonstruktion beinhaltet weder einen Glyoxylatzyklus, noch
den TCA-Nebenweg, der von Zhang und Bryant [142] für Cyanobakterien beziehungsweise Synechococcus sp. PCC 7002 vorgeschlagen wird. Zudem wurden Rekonstruktionen sowohl von Cyanothece ATCC 51142 [143] als auch von Synechococcus sp. PCC
33
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
7002 [144] in letzter Zeit veröffentlicht. Auch ein Vergleich des metabolischen Potenzials der beiden Modellorganismen Synechocystis sp. PCC 6803 und Cyanothece ATCC
51142 wurde vor kurzem publiziert [126].
2.2.3. Flussbilanzanalyse des Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803
Genomskalige metabolische Netzwerke bieten die Möglichkeit, die physiologischen Eigenschaften des jeweiligen spezifischen Organismus mit Constraint-basierten Analysen zu untersuchen [103]. Während für eine Vielzahl von heterotroph wachsenden
einzelligen Organismen die Flussbilanzanalyse (Flux Balance Analysis) (FBA) schon
oft mit großem Erfolg eingesetzt wurde, steht jedoch die Anwendung bei phototroph
wachsenden Organismen immer noch am Anfang [145]. Insbesondere ermöglicht das
phototrophe Wachstum neue, zusätzliche, mathematische und konzeptionelle Herausforderungen, wie zum Beispiel die Simulation von unterschiedlichen Lichtbedingungen durch verschiedene Stadien eines simulierten Tagesablaufs. Doch bevor solche
komplexeren Szenarien berücksichtigt werden können, muss erst eine Referenzlösung
für das phototrophe Wachstum unter konstanten Lichtbedingungen gegeben sein.
Für die FBA wird davon ausgegangen, dass die intrazellulären Flüsse so aufgeteilt sind, dass sie eine bestimmte zelluläre Zielfunktion, wie zum Beispiel die Maximierung der Biomasse, gewährleisten. Dabei sind die Rahmenbedingungen, wie auch
bestimmte Austauschflüsse, festgesetzt. In der aktuellen Netzwerkversion wurde die
BOF aus der Literatur (Nogales et al. [125]) modifiziert (siehe Kapitel 2.1.9). Sie beinhaltet acht unterschiedliche zelluläre Bestandteile: Proteine, DNA, RNA, Zellwandbestandteile, Lipide, lösliche Zellkomponenten, anorganische Ionen und Pigmente. Zusätzlich wurde ein wachstumsabhängiger ATP-Bedarf für den Energiebedarf von Proteinsynthesen, Regulationsprozessen und Wachstum miteinbezogen. Für die Simulationen unter Lichtabwesenheit wurde einzig Glykogen als Speicherstoffverbindung berücksichtigt.
Neben dem Zellwachstum muss die angestrebte FBA-Referenzlösung zusätzliche
zelluläre Prozesse widerspiegeln, von denen bekannt ist, dass sie den cyanobakteriellen Stoffwechsel beeinflussen. Dazu gehören unter anderem ein vom Wachstum unabhängiger basaler ATP-Verbrauch für die Aufrechterhaltung zellulärer Prozesse sowie
eine verbleibende Restaktivität der Zellatmung, welche für Cyanobakterien auch unter Lichtbedingungen angenommen wird [146, 147]. Des Weiteren sind eine Reihe von
anderen Prozessen direkt abhängig vom Lichteinfall, wie die Bildung von reaktiven
Sauerstoffradikalen (ROS), Photoinhibition und Schäden durch eine erhöhte Lichteinstrahlung. Um die freiwerdenden Sauerstoffradikale unschädlich zu machen, wird ein
erhöhter NADPH-Bedarf benötigt, wohingegen die durch erhöhte Lichtkonzentration
verursachten Schäden, vor allem des D1-Proteins des Photosystems II, einen wachstumsunabhängigen Umsatz von zellulären Komponenten zur Folge haben [148].
Erst vor kurzem wurde auch die Existenz einer Mehler-ähnlichen-Reaktion nachgewiesen, bei welcher im Gegensatz zu der Mehler-Reaktion in höheren Pflanzen keine
freien Sauerstoffradikale gebildet werden, sondern die Elektronen direkt in Wassermolekülen gebunden werden [149, 150]. Allerdings sind quantitative Daten über diesen
34
2.2. Ergebnisse und Diskussion
Prozess kaum verfügbar und das Wissen über dessen Wechselbeziehung mit dem Zellwachstum ist nur rudimentär.
Mit dem Ziel das Netzwerkmodell zu parametrisieren, um es mit experimentellen
Daten vergleichbarer zu machen, wurde bei den Simulationen unter konstanten Lichtbedingungen eine durchschnittliche Verdopplungszeit von 24 Stunden angenommen.
Dies entspricht einer durchschnittlichen Wachstumsrate von 0,029 h-1 . Für die Simulation diente Nitrat (NO3− ) als Stickstoffquelle, welches über ein ABC-Transportersystem
aufgenommen wurde. Als einziger wachstumslimitierender Faktor wurde Licht, welches durch den Fluss von absorbierten Photonen repräsentiert wird, angenommen und
begrenzt. Andere Nährstoffe, wie zum Beispiel Stickstoff, Phosphor und Schwefel, wurden hingegen nicht limitiert und konnten frei vom System aufgenommen werden. Die
Aufnahme von komplexeren Molekülen wie Glucose oder Aminosäuren als Kohlenstoffsowie auch als Stickstoffquelle, wurde bei den Simulationen nicht berücksichtigt. Als
Kohlenstoffaufnahme wurde nur Hydrogencarbonat (HCO3− ) erlaubt, welches über
einen aktiven Transport (ABC-Transporter-System) [136] aufgenommen wird. Diese
Aufnahme wurde jedoch nicht eingeschränkt. Es wird nur eine Nettoaufnahme von
Hydrogencarbonat und kein zyklischer Austauschtransport berücksichtigt [151].
Zusätzlich zu dem wachstumsabhängigen ATP-Bedarf wurde der basale ATP-Verbrauch (Maintenance) auf 0,13 mmol ATP gDW-1 h-1 gesetzt. Um eine basale Aktivität
der Zellatmung auch unter Lichtbedingungen einzuberechnen, wurde der terminalen
Cytochrom-c-Oxidase also auch der Mehler-ähnlichen-Reaktion, welche NADPH und
O2 zu H2 O und NADP umwandelt, ein Fluss zugewiesen. Es wird angenommen, dass
beide Prozesse jeweils ungefähr 10 % des Sauerstoffes, welcher am Photosystem II
frei wird, aufnehmen. Hierbei ist zu beachten, dass Schätzungen zur Aktivität dieser beiden Prozesse in der Literatur stark variieren und auch sehr stark von den
Wachstumsbedingungen abhängen. Für die Aktivität der terminalen Oxidase werden
Werte von Helman et al. (2005) [152] verwendet, der das Ausmaß des Elektronenflusses über Cytochrom-c-Oxidase im Licht beschreibt und auf einen Sauerstoffkonsum
von etwa 6 % der Sauerstoffentwicklung schließt. Die Mehler-ähnliche-Reaktion wurde erst vor kurzem von Allahverdiyeva et al. (2011) [150] untersucht, die berichten,
dass unter luftähnlichen CO2 -Bedingungen etwa 20 % der Elektronen, die aus der
Wasserspaltung stammen, auf den Sauerstoff übergehen, hauptsächlich auf Grund
der Mehler-ähnlichen-Reaktion. Um oxidativen Stress bei erhöhten Lichtkonzentrationen zu modellieren, wurde im Netzwerk eine Reaktion eingebaut, die Superoxide
(O2− ) am Photosystem II und am Photosystem I (durch die von höheren Pflanzen bekannte Mehler-Reaktion) erzeugt. Es wird aber angenommen, dass beide Prozesse nur
mit einer geringen Rate ablaufen. Im Netzwerk wird diese so gesetzt, dass ca. 0,5 %
der Elektronen im jeweiligen Photosystem direkt auf den Sauerstoff übergehen.
35
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
2.2.4. Optimale Flussverteilung für das phototrophe Wachstum
Unter Beachtung der vorher genannten Bedingungen und Einschränkungen wurde
mithilfe der COBRA-Toolbox (COBRA) unter MATLAB eine Lösung für die Flussoptimierung unter phototrophen Bedingungen berechnet. Die Flussverteilung liefert die
maximale Wachstumsrate zu den vorher definierten externen Bedingungen. Um die erhaltene Lösung zu verifizieren, wurde anschließend mit der FASIMU-Software [107]
für die gleiche Simulation unter den gleichen Bedingungen eine Lösung berechnet. Diese Berechnung führte Sabrina Hoffmann durch. Beide Programme lieferten identische
Ergebnisse. Zu beachten ist jedoch, dass diese Referenzlösung für einen konstanten
Lichteingang nicht eindeutig ist.
Die Flussvariabilitätsanalyse ergab, dass eine deutliche Variabilität in den Reaktionen der Transaldolase (EC 2.2.1.2) (TALDO) (talB, slr1793), der Fructose-1,6-Bisphosphat-Aldolase (EC 4.1.213) (FBPA) (cbbA und fda, sll0018 und slr0943) und der
Fructose-1,6-Bisphosphatase/ Sedoheptulose-1,7-Bisphosphatase (EC 3.1.3.37) (SBP)
(fbpI und glpX, slr2094 und slr0952) existiert. Diese entsprechen alternativen optimalen Routen innerhalb des Netzwerkes [153]. Eine graphische Übersicht der erhaltenen Flussverteilung ist in Abbildung 2.4 dargestellt. Insgesamt gesehen stimmt diese
Flusslösung gut mit den in der Literatur publizierten Ergebnissen überein [124, 125].
Wie erwartet, basiert das autotrophe Wachstum auf der Assimilierung von Kohlenstoffdioxid durch die Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/-Oxygenase (EC 4.1.1.39)
(RuBisCO). RuBisCO wandelt ein Molekül Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) und CO2
in zwei Moleküle Glycerat-3-Phosphat (PG3) um. Um eine weitere Kohlenstofffixierung und damit verbundenes Wachstum zu garantieren, wird PG3 anschließend zum
größten Teil genutzt, um RuBP über den Calvin-Benson-Zyklus zu regenerieren. Dabei können für jeweils sechs Moleküle PG3, die vom Zyklus gewonnen werden, ein
Molekül PG3 für das Wachstum verwendet werden. Die Energie in Form von ATP und
Reduktionsäquivalenten (NADPH), die für diesen Zyklus benötigt wird, werden durch
die photosynthetische Lichtreaktion zur Verfügung gestellt. Aus diesem Grund weisen die Reaktionen der Photosynthese sowie des Calvin-Benson-Zyklus die höchsten
Flusswerte auf.
Für alle Lösungen gilt, dass innerhalb des Calvin-Benson-Zyklus die Reaktion der
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.12/59) (GAPDH) (gap2, sll1342)
immer den höchsten, absoluten Fluss besitzt (230,2 · 10-2 mmol gDW-1 h-1 ). Diese Reaktion ist eine der Schlüsselreaktionen des Calvin-Benson-Zyklus und essentiell für
das phototrophe Wachstum. Die Erzeugung einer entsprechenden Mutante ist demgemäß unter phototrophen Bedingungen nicht möglich (Koksharova et al. [154]). Zu
beobachten ist auch, dass über die Reaktion der Ribulosephosphate-3-Epimerase (EC
5.1.3.1) (cfxE, sll0807) immer ein höherer Fluss führt als über die Reaktion der Ribose5-Phosphat-Isomerase (EC 5.3.1.6) (RPI) (rpiA, slr0194), mit einer fast doppelt so hohen Flussrate (81,6 zu 45,4 · 10-2 mmol gDW-1 h-1 ). Beide Reaktionen sind im Netzwerk essentiell. Stoffwechselwege, die sich an den Calvin-Benson-Zyklus anschließen
und zur Biomassesynthese führen, besitzen eine weit geringere Flussrate.
36
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
In Abbildung 2.5 wird die maximale Wachstumsrate als eine Funktion der
Eingangsflüsse Licht (absorbierte Photonen) und HCO3− dargestellt. Das maximale Wachstum ist linear abhängig vom
absorbierten Licht und der Netto CO2 Verfügbarkeit, mit einem Versatz für geringe Lichtintensitäten. Es ist zu erkennen, dass bei einer Variation der Lichtintensität keine qualitativen Unterschiede in der Flussverteilung zu beobachten
sind, so lange Licht als der wachstumsliAbbildung 2.5.: Die maximale Wachstumsrate in Ab- mitierende Faktor bleibt.
hängigkeit zur Lichtintensität (Photonenanzahl) und
HCO3− -Verfügbarkeit. Da der festgelegte basale ATPVerbrauch (Maintenance) erfüllt werden muss, ist
ein leichter Versatz der Wachstumsrate bei geringen
Lichtintensitäten zu erkennen.
Der Vergleich von simulierten Modelldaten mit der Realität ist ein essentieller Schritt in jedem Forschungsbereich. Deshalb wurden auch für diese
Arbeit die Ergebnisse der Flussoptimierung mit experimentellen Daten verglichen. In der Literatur sind unter anderem typische Kohlenstoffaufnahmeraten für Cyanobakterien zu finden. So haben
Van Liere und Walsby [155] eine typische Kohlenstoffaufnahmerate von 0 bis 13
mg Kohlenstoff gDW-1 h-1 gemessen, welche einer Flussrate von ungefähr 0 bis
1,1 mmol CO2 gDW-1 h-1 entspricht. Bei der Simulation des phototrophen Wachstums,
bei der von einer Wachstumsrate von 0,0289 h-1 ausgegangen wird, beträgt der Fluss
des Hydrogencarbonat-Transports 1,23 mmol gDW-1 h-1 und entspricht somit annähernd der gemessenen Rate. Der photosynthetische Quotient, welcher das molare Verhältnis von ausgeschiedenem Sauerstoff und aufgenommenem CO2 beschreibt, beträgt
in der simulierten Flussverteilung ca. 1,47. Des Weiteren wurden 2011 von Young
et al. [156] Daten von dynamischen Flussmessungen mithilfe von isotopenmarkiertem Kohlenstoff unter photoautotrophem Wachstum von Synechocystis publiziert. Die
Flussverteilung dieser Messungen stimmt ziemlich genau mit den Ergebnissen der Simulation des phototrophen Wachstums (Abbildung 2.4) überein, gleichwohl es kleine
interessante Unterschiede gibt:
Bei der Optimierung der Biomasseproduktion erhält man in der berechneten Lösung einen Fluss durch die Phosphoketolase (EC 4.1.2.22) (PKL), die entweder Xylose5-Phosphat (X5P) zu Acetylphosphat (ACEP) und Glyceraldehyd-3-Phosphat (GAP)
umwandelt oder Fructose-6-Phosphat (F6P) zu Acetylphosphat und Erythrose-4-Phosphat (E4P). Somit ermöglicht die PKL eine Abkürzung vom Calvin-Benson-Zyklus zu
Acetyl-CoA und umgeht den CO2 -Verlust der Reaktion des Pyruvat-DehydrogenaseKomplexes (PDH). Interessanterweise wurde die Phosphoketolase zuvor schon für den
C5 -Katabolismus in Saccharomyces cerevisiae [157] und für die Glutamatproduktion
in Corynebacterium glutamicum [158] genauer betrachtet und diskutiert. Zudem hat
die Anwesenheit der PKL einen signifikanten Einfluss auf den Verzweigungspunkt
38
2.2. Ergebnisse und Diskussion
von Phosphoglyceratkinase (EC 2.7.2.3) (PGK) und Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.1)
(PGM), welcher sich an den Calvin-Benson-Zyklus anschließt. Mit einem Fluss durch
die PKL erhält man ein Verhältnis von PGK zu PGM von etwa 12,5:1. Ohne das Vorhandensein der PKL beträgt dieses Verhältnis etwa 7,4:1, was auch dem Wert aus früheren Netzwerkversionen [93] und anderen Netzwerkpublikationen [125] entspricht.
Das Verhältnis aus den experimentellen Daten von Young et al. [156] entspricht ungefähr 10,0 ± 1,0, so dass keine Schlussfolgerung über die Gültigkeit der beiden Lösungen gezogen werden kann. Nichtsdestotrotz liegt der gemessene und simulierte
Wert signifikant höher als der Lehrbuchwert, der ein Verhältnis von 5:1 beschreibt.
Das liegt daran, dass während der Regeneration des Calvin-Benson-Zyklus Vorstufenmetaboliten für unterschiedliche Biomassekomponenten abgezogen werden, wie zum
Beispiel Glucose-6-Phosphat zur Synthese von Glykogen und Nukleotid-Zuckern und
Ribose-5-Phosphat zur Synthese von Folat, DNA, RNA und Histidin, die einen höheren Fluss durch die PGK fordern.
Ein weiterer Unterschied zwischen den experimentell bestimmten Daten und der
simulierten Flusslösung ist die Rolle des Malatenzyms (ME) während des phototrophen Wachstums. Das ME wandelt Malat zu Pyruvat um und setzt dabei CO2 frei. In
Übereinstimmung mit früheren Studien über heterotrophes Wachstum [140], haben
Young et al. [156] einen Fluss durch das ME gemessen, was darauf hindeutet, dass
das Enzym bei der intrazellulären Konzentration von CO2 beteiligt sein könnte, analog zu seiner Rolle in C4 -Pflanzen. Da jedoch ein solcher Zyklus Energie in Form von
ATP konsumiert, wird bei der Flussoptimierung durch die FBA kein solcher Fluss in
einer Lösung vorhanden sein, solange nicht noch weitere Einschränkungen oder Nebenbedingungen festgelegt werden.
Die Flussmessungen von Young et al. (2011) [156] zeigen einen geringen Fluss
durch den oxidativen Pentosephosphatweg (OPP), welcher unter der Freisetzung von
CO2 zur Erzeugung von NADPH beiträgt . Dieser ist unter phototrophen Bedingungen nicht zu erwarten, da unter Anwesenheit von Licht ein Großteil des NADPHs
durch die Elektronentransportkette (ETK) erzeugt wird, wodurch ein Fluss durch den
OPP zu einem geringen aber signifikanten Verlust von CO2 führt. Young et al. [156]
argumentieren, dass dieser geringe Fluss aus einer unvollständigen Unterdrückung
der Enzymaktivität des OPP während des Tages resultiert. Jedoch kann eine solche
suboptimale Flusslösung nicht ohne weitere Beschränkungen beziehungsweise ein explizites Fordern durch eine FBA simuliert werden.
Tatsächlich wurde schon gezeigt, dass sich der Zellstoffwechsel in unterschiedlichen
Standby-Modi befinden kann, um schnell und direkt auf sich ändernde Umwelteinflüsse zu reagieren, was auf Kosten des optimalen Wachstums geht [110, 159]. Dieser Kompromiss zwischen Flexibilität und Effizienz erfordert die Investition von zusätzlichen
Ressourcen und spielt sehr wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Regulation des
Stoffwechsels von phototrophen Organismen beim Wachstum unter natürlichen TagNacht-Bedingungen.
39
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
2.2.5. Die Oxygenase-Reaktion von RuBisCO und die Photorespiration
Das bifunktionale Enzym Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/-Oxygenase (EC
4.1.1.39) besitzt nicht nur eine Affinität für CO2 , sondern ebenfalls noch für molekularen Sauerstoff (O2 ), welches es als alternatives Substrat nutzen kann. Bei der
Carboxylierung von RuBisCO entstehen zwei Moleküle Glycerat-3-Phosphat (PG3),
wohingegen bei der konkurrierenden Oxygenierung ein Molekül PG3 und ein Molekül 2-Phosphoglycolat (2PGL) entstehen (Photorespiration), wovon letzteres nur aus
zwei Kohlenstoffatomen zusammengesetzt ist und sie somit ineffektiver zur Carboxylierung macht.
Betrachtet man den heutigen Zustand der Erdatmosphäre, mit ca. 21 % Sauerstoff
und ca. 0,04 % CO2 , wird deutlich, dass die Produktivität von photosynthetischen Organismen signifikant durch die Biofunktionalität von RuBisCO beeinträchtigt wird.
Diese Tatsache wird meist als ein evolutionäres Relikt aus der Zeit gesehen, in der
sich die Photosynthese beziehungsweise RuBisCO entwickelte. Im Vergleich zu heute
herrschte zu dieser Zeit eine viel höhere CO2 -Konzentration in der Atmosphäre und
die O2 -Konzentration war minimal. Infolgedessen wird auch die Photorespiration als
ein scheinbar „verschwenderischer“ Prozess gesehen, der Kohlenstoff aus dem CalvinBenson-Zyklus entnimmt. Dementgegen existieren aber auch Hypothesen, die darauf
hindeuten, dass die Photorespiration eine wesentliche Funktion bei der Energiedissipation bei hohen Lichtkonzentrationen [160] oder anderen Prozessen spielt [161].
Die Rolle und Bedeutung der Photorespiration in Cyanobakterien ist bis heute nur
teilweise geklärt. Es ist bekannt, dass Cyanobakterien CO2 -Konzentrationsmechanismen zur lokalen Erhöhung der CO2 -Konzentration entwickelt haben, wodurch sie in
der Lage sind, die Oxygenase-Aktivität von RuBisCO wesentlich zu unterdrücken und
dadurch die photosynthetische Leistung zu steigern [162]. Allerdings ermöglichen die
CO2 -Konzentrationsmechanismen nicht die völlige Unterdrückung der Oxygenierung
und Eisenhut et al. (2008) [119] haben gezeigt, dass ein aktiver photorespiratorischer
2-Phosphoglycolat-Stoffwechsel für das cyanobakterielle Wachstum in der heutigen
sauerstoffhaltigen Atmosphärenzusammensetzung essentiell ist. Insbesondere wird
eine schnelle Umwandlung von 2PGL zu Glyoxylat bei einer nicht unwesentlichen
Photorespirationsrate benötigt, um einen toxischen Effekt und eine Hemmung des
Calvin-Benson-Zyklus zu verhindern.
Als überraschendes Ergebnis zeigten sich in der ersten Version der Netzwerkrekonstruktion inklusive deren Optimierungslösungen für den Synechocystis-Metabolismus,
dass bei der Maximierung von Biomasse unter phototrophen Bedingungen ein geringer Fluss über die Oxygenierungsreaktion von RuBisCO vorhergesagt wird. Dieses Ergebnis lässt sich auch in experimentell bestimmten Daten wiederfinden [93].
Der Grund für diesen scheinbar nicht optimalen Stoffwechselweg war das Nichtvorhandensein eines stöchiometrisch effektiveren Weges für die Synthese der Aminosäuren Serin, Glycin und Cystein. Insbesondere konnten für die Enzyme PhosphoserinTransaminase (EC 2.6.1.52) und Phosphoserin-Phosphatase (EC 3.1.3.3) zunächst keine Homologe im Genom von Synechocystis gefunden werden.
40
2.2. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 2.6.: Die Stoffwechselwege der Photorespiration und des Glyoxylat-Stoffwechsels in
Synechocystis. Zusätzlich ist die Serin-Synthese über den Phosphoserin-Weg gezeigt. Die Erklärung der
Abkürzungen für die verwendeten Metaboliten sind im Anhang in der Tabelle A.3 aufgeführt (Abbildung
aus Knoop et al. (2013) [94]).
Erst vor kurzem wurde entdeckt, dass ein Homolog für eine Glucomutase ein vielversprechender Kandidat für die Aktivität der Phosphoserin-Phosphatase ist [131].
Desgleichen konnte die Aktivität einer Phosphoserin-Transaminase in Synechocystis
bestätigt werden (persönliche Mitteilung Wolfgang Lockau und Martin Hagemann).
Genauere Untersuchungen hierfür stehen aber noch aus.
Ohne den Phosphoserin-Weg wird Glycin aus Glyoxylat synthetisiert, welches als
Nebenprodukt aus der Photorespiration entsteht. Aus diesem Grund wurden für diese
Arbeit drei Szenarien im Zusammenhang mit den Synthesemöglichkeiten der Aminosäuren Glycin, Serin und Cystein genauer untersucht.
Beim ersten Szenario wird davon ausgegangen, dass die derzeitige Annotation vollständig ist und dass kein kompletter Phosphoserin-Weg in Synechocystis existiert.
Für diesen Fall werden Glycin, Serin und Cystein aus Glyoxylat synthetisiert. Glyoxylat ist selbst wiederum ein Produkt aus Glycolat und somit auch aus 2PGL, das
Produkt der Photorespiration. Dies hat somit auch zur Folge, dass es bei der Flussoptimierung einen geringen Fluss durch die Photorespiration gibt (siehe Abbildung 2.6
für eine Übersicht der Stoffwechselwege). Es ergibt sich eine Photorespirationsrate
von ungefähr 3,5 %, welche gut mit aktuellen Schätzungen der in vivo Rate übereinstimmt [163]. Jedoch ist zu beachten, dass Young et al. [156] eine deutlich niedrigere
Rate der Photorespiration unter ähnlichen experimentellen Bedingungen beobachteten. Sieht man sich unter diesen Gesichtspunkten eine Simulation des Stoffwechsels
unter Abwesenheit von Licht genauer an, ist ein Fluss durch die Photorespiration bei
der optimalen Flussverteilung nicht mehr gegeben. Hingegen wird der verbleibende
41
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Bedarf an Glycin, Serin und Cystein durch den Abbau von Prolin gewährleistet, welches effektiver ist als die Gewinnung von Glyoxylat durch die Photorespiration unter
nicht phototrophen Bedingungen.
Als zweites Szenario wird angenommen, dass noch zum Teil nicht identifizierte
Gene für eine Phosphoserin-Transaminase und -Phosphatase kodieren und damit der
Phosphoserin-Weg komplett wäre. Werden nun die zugehörigen enzymatischen Schritte beziehungsweise Reaktionen in das Modell eingebracht, erhält man keinen Fluss
mehr durch die Reaktionen der Photorespiration unter phototrophen Bedingungen
und die Oxygenierungsreaktion von RuBisCO ist nicht mehr Teil der optimalen
Lösung. Stattdessen werden Serin und anschließend Glycin und Cystein nun durch
den neu eingeführten Phosphoserin-Weg synthetisiert. Experimentell lässt sich dieses
Szenario durch Ergebnisse von Young et al. [156] und Huege et al. [163] festigen, da
beide Studien eine wesentlich höhere 13 C-Anreicherung bei Serin gegenüber Glycin
messen. Hieraus lässt sich schließen, dass zuerst Serin synthetisiert wird und danach
erst Glycin.
Für das dritte und letzte Szenario wird angenommen, dass die Photorespiration
ein unvermeidbarer Prozess unter den gegenwärtigen atmosphärischen Bedingungen
ist. Es wurde die optimale Flussverteilung unter Miteinbeziehung des PhosphoserinWeges in das Modell und gleichzeitiger Festlegung eines Flusses durch die Oxygenierungsreaktion von RuBisCO berechnet. Zu diesem Zweck wurde die Carboxylierungsmit der Oxygenierungsreaktion gekoppelt. Das Verhältnis dieser beiden Reaktionen
wurde auf 3 % Oxygenierung zu 97 % Carboxylierung festgelegt, so dass immer ein minimaler Fluss über 2PGL existieren muss. Für dieses Szenario zeigt die Flussvariabilitätsanalyse, dass mehrere gleichwertige, optimale Lösungen existieren. Zum Beispiel
gibt es für das Glyoxylat, welches als Zwischenprodukt der Photorespiration entsteht,
mehrere Abbaumöglichkeiten. Es kann entweder zur Synthese von Glycin für die Biomasse verwendet werden oder stöchiometrisch äquivalent (in Bezug auf die Biomasse)
über Glycerat verstoffwechselt werden. Im letztgenannten Fall wird Serin über den
Phosphoserin-Weg synthetisiert (siehe Abbildung 2.6).
Um schlussendlich eine mögliche Aussage über die Existenz des Phosphoserin-Weges in Synechocystis zu treffen, ist zu bedenken, dass die Photorespiration als unvermeidlicher Prozess unter den aktuellen atmosphärischen Bedingungen gilt und es von
Vorteil ist, Produkte, die dabei zwangsweise entstehen, stöchiometrisch so effizient wie
möglich zu nutzen. Zudem wurde schon 1997 vorgeschlagen, dass dieser Weg in Cyanobakterien vorhanden sei [164] und zusätzlich weisen die 13 C-Markierungsexperimente
von Young et al. [156] auf eine Existenz des Phosphoserin-Weges in Synechocystis hin.
Desgleichen ist ein Enzym des Phosphoserin-Weges, die 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.95), in mehreren metabolischen Datenbanken annotiert. Zwar
haben Eisenhut et al. [119] dieses Gen (sll1908) als Hydroxypyruvat-Reduktase annotiert, allerdings deuten jüngste Experimente daraufhin, dass das Gen tatsächlich
für eine 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodiert. Ferner konnte ein alternatives
Gen für die Hydroxypyruvat-Reduktase identifiziert werden (persönliche Mitteilung
Martin Hagemann). Schlussendlich zeigen erste experimentelle Messungen, dass alle
42
2.2. Ergebnisse und Diskussion
Enzyme des Phosphoserin-Weges mit der entsprechenden Funktion in Synechocystis
exprimiert werden und die gesuchten Reaktionen katalysieren können (siehe Kapitel
2.1.6). Aus diesen vorher genannten Gründen wird dieses letzte Szenario, in welchem
der Phosphoserin-Weg aktiv ist und eine nicht vermeidbare Photorespiration existiert,
präferiert und in die Rekonstruktion und das mathematische Modell des Stoffwechsels
von Synechocystis integriert, da es wohl am ehesten der in vivo Situation im Organismus entspricht.
2.2.6. Optimale Flussverteilung bei Abwesenheit von Licht
Neben dem phototrophen Wachstum bei Tageslicht müssen Cyanobakterien auch in
der Lage sein, längere Perioden der Dunkelheit, zum Beispiel bei Nacht, zu überleben.
Dabei greifen sie auf endogene Speicherverbindungen wie Glykogen zurück und auch
zu einem geringen Maße auf Cyanophycin und Poly-β-Hydroxybutyrat, die sich in den
Zeitabschnitten angesammelt haben, als Licht zur Verfügung stand. Leider sind experimentell erworbene Daten von Flussverteilungen bei längerer Dunkelheit kaum in
der Literatur verfügbar.
Um sich dennoch einem solchen Szenario anzunähern und eine Flussverteilung zu
beschreiben, wurde vermutet, dass anders als bei einigen diazotrophen Cyanobakterien, welche einen sehr aktiven Dunkelstoffwechsel betreiben, bei Synechocystis nur
eine sehr geringe Aktivität des Stoffwechsels besteht und diese sich hauptsächlich auf
die Erzeugung von Energie für den zellulären basalen ATP-Verbrauch (Maintenance)
beschränkt. Es wird daher davon ausgegangen, dass das zelluläre Wachstum bei Dunkelheit minimal ist, was auch schon durch zahlreiche experimentelle Beobachtungen
bestätigt wurde.
Aus diesem Grund wurde bei der Flussoptimierung bei Abwesenheit von Licht angenommen, dass die maximale Glykogenabbaurate geringfügig über dem Wert lag, der
benötigt wird, um die Vorgaben für die Zellatmung und den basalen ATP–Verbrauch
zu erfüllen und dementsprechend festgelegt. Zusätzlich wurde angenommen, dass der
restliche, minimale Anteil des Glykogens, welches durch den Abbau zur Verfügung
stand, für das Zellwachstum oder äquivalent als gesamt zellulärer Metabolitumsatz,
der ebenfalls durch die Biomassefunktion angenähert wird, genutzt wird [93]. Kurz
gesagt, die Optimierung für eine Dunkelperiode versucht die BOF bei einer Beschränkung des Glykogenabbaus zu maximieren, der nur geringfügig oberhalb der Anforderung für den basalen ATP-Verbrauch (Maintenance) liegt. Glykogen wird als das
Hauptsubstrat für die Zellatmung während der Dunkelheit angesehen. Es ist aber
darauf hinzuweisen, dass Synechocystis sehr wahrscheinlich auch in der Lage ist, andere Speicherverbindungen zu nutzen. Kürzlich wurde gezeigt, dass Mutanten mit
einer unterbrochenen Glykogensynthese eine reduzierte Lebensfähigkeit unter TagNacht-Bedingungen aufweisen. Diese fällt jedoch nicht so stark aus, dass man daraus
schließen könnte, dass Glykogen die einzige Speicherstoffverbindung ist [165]. Bei den
folgenden Analysen wurde der Einfluss von alternativen Speicherverbindungen nicht
berücksichtigt.
43
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Abbildung 2.7.: Ausschnitt des Zentralstoffwechsels der optimalen Flussverteilung für Synechocystis sp.
PCC 6803 bei Abwesenheit von Licht. Es ist ein zyklischer Fluss über den TCA-Zyklus zu erkennen.
Die Flüsse sind in 10-2 mmol gDW-1 h-1 gegeben. Die Erklärung der Abkürzungen für die verwendeten
Metaboliten sind im Anhang in der Tabelle A.3 aufgeführt.
Die resultierende optimale Flussverteilung zeigt eine große Variabilität bezogen auf
die Annahmen über die Spezifität beziehungsweise Reaktionsrichtung bestimmter Enzyme. Hierbei ist vor allem die Reaktion der annotierten Transhydrogenase (slr1239
und slr1434; EC 1.6.1.2) zu nennen. Wird davon ausgegangen, dass dieses Enzym im
Stoffwechsel aktiv ist und einen reversiblen Fluss katalysieren kann, so wird das Redoxpotenzial (NADH) hauptsächlich über den TCA-Zyklus generiert und hinterher zu
NADPH umgewandelt. Das gewonnene NADPH wird anschließend zum größten Teil
über den NADPH-Dehydrogenasekomplex (NDH I) für die Zellatmung verbraucht, für
den gezeigt wurde, dass dieser spezifisch für NADPH ist [146].
Wiederum eine ganz andere Flussverteilung ergibt sich, wenn man davon ausgeht,
dass entweder die Transhydrogenase nicht vorhanden ist oder nur unidirektional die
44
2.2. Ergebnisse und Diskussion
Reaktion von NADPH zu NADH katalysiert. Für diesen Fall wird in der errechneten optimalen Flussverteilung das Redoxpotenzial für die Zellatmung (NADPH) überwiegend über den oxidativen Pentosephosphatweg (OPP) und nicht zyklisch über den
TCA-Zyklus generiert. Ein Fluss über den OPP würde gut mit experimentell gewonnenen Daten übereinstimmen, die beim heterotrophen Wachstum voraussagen, dass ein
großer Anteil der aufgenommenen Glucose über den OPP oxidiert wird [140]. Erlaubt
man nun hingegen, dass die NADH I die beiden Redoxpotenziale NADH und NADPH
gleichermaßen als Substrat nutzen kann, erhält man in der errechneten Flussverteilung erneut einen zyklischen Fluss durch den TCA-Zyklus. Die Verwendung des zyklischen TCA-Zyklus wird ebenfalls durch die Beobachtungen und Messungen gestützt,
wonach die Succinat-Dehydrogenase (EC 1.3.99.1) (SDH) (sll0823, sll1625, slr1233)
den Hauptumsatz an Elektronen in die Elektronentransportkette beziehungsweise
den Plastochinon-Pool liefert [146]. Schlussendlich ist es auf der Grundlage der gegenwärtig verfügbaren Informationen leider nicht möglich, eine endgültige Aussage über
die tatsächliche Flussverteilung bei Abwesenheit von Licht zu treffen. Da auch keine
zusätzlichen Informationen zur Transhydrogenase-Aktivität bekannt sind, wurde in
dieser Arbeit das Szenario mit dem zyklischen TCA-Zyklus bevorzugt. Die simulierte
Flussverteilung unter Abwesenheit von Licht ist in Abbildung 2.7 gezeigt.
2.2.7. Übergang von der Nutzung von Speicherstoffen hin zum
phototrophen Wachstum
Durch die Simulation eines Überganges von Tag- zu Nacht-Bedingungen, ermöglicht
das in silico Modell die Beobachtung, wie sich der Stoffwechsel vom Glykogen-verwendenden Nachtstoffwechsel zum phototrophen Wachstum reorganisiert und wie sich dabei bestimmte Reaktionen im Netzwerk verhalten. Dieser metabolische Übergang ist
in Abbildung 2.8 für einige ausgewählte Reaktionen gezeigt. Hierbei werden die Flüsse farbkodiert auf einer zweidimensionalen Ebene als eine Funktion der absorbierten
Photonen (Abszisse) und der Glykogen-Nutzung (Ordinate) gezeigt. Innerhalb jedes
Einzelgraphen entspricht der Übergang vom Nacht-Stoffwechsel (Glykogen-Mobilisierung) zum phototrophen Wachstum einem Weg von der oberen linken zur unteren rechten Ecke. Einher eines solchen Verlaufs sind mehrere charakteristische Übergänge in
der Reorganisation der metabolischen Flüsse zu beobachten. Bei der Verwendung der
Speicherstoffe, was einem Punkt auf der Ordinate in Abbildung 2.8 entspricht, wird angenommen, dass Glykogen als einzige Ressource für Energie und Kohlenstoff fungiert.
Für diesen Fall ist die Flussverteilung dadurch gekennzeichnet, dass eine Sauerstoffaufnahme vorliegt und ein Fluss durch die Reaktion der RuBisCO nicht stattfindet.
Stattdessen ist ein zyklischer Fluss durch den TCA-Zyklus (Abbildung 2.8 G) über die
Succinat-Dehydrogenase (EC 1.3.99.1) (SDH) (slr037) zu beobachten.
Mit zunehmender Lichtintensität und gleichzeitiger Abnahme der Glykogen-Nutzung, nimmt dieser Fluss durch den TCA-Zyklus jedoch ab und stattdessen gewinnt der
OPP an Aktivität (Abbildung 2.8 H). Bei steigenden Lichtverhältnissen beginnen die
photosynthetischen Lichtreaktionen die Erzeugung der Energie (in Form von ATP)
und Redoxäquivalente (NADPH), die für den basalen ATP-Verbrauch (Maintenance)
45
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Abbildung 2.8.: Übergang von der Nutzung von Speicherstoffen hin zum phototrophen Wachstum. Gezeigt ist der Fluss durch die entsprechenden Reaktionen (farbkodiert) als Funktion der absorbierten Photonen (Abszisse) und der Glykogen-Mobilisierung (Ordinate). Alle Flüsse sind in mmol gDW-1 h-1 gegeben,
bis auf die Biomassezielfunktion (A). Die Netto-Sauerstoffaufnahmerate (F) nimmt positive Werte entsprechend der Zellatmung an. A) BOF: Biomassezielfunktion B) RuBisCO: RuBisCO-Reaktion C) GAP2:
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase 2 D) PDH: Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex E) PKL: Phosphoketolase F) Sauerstoffaufnahmerate G) TCA: zyklischer Fluss über den TCA-Zyklus H) OPP: oxidativer Pentosephosphatweg.
und für die CO2 -Fixierung benötigt werden. Somit wird ab einem bestimmten Schwellenwert ein Fluss durch den Calvin-Benson-Zyklus eingeleitet, was zu einer zunehmenden Rate der Carboxylierungs- und Oxygenierungsreaktion von RuBisCO führt
und gleichzeitiger Aktivität der Phosphoketolase (Abbildung 2.8 B und E). Diese ermöglicht es den CO2 -freisetzenden Schritt des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes zu
umgehen (Abbildung 2.8 D). Zusätzlich steigt ab diesem Zeitpunkt die Sauerstoffabgabe aufgrund der photosynthetischen Lichtreaktionen (Abbildung 2.8 F).
2.2.8. Der cyanobakterielle Glyoxylat-Shunt
Die meisten der in der Literatur veröffentlichten Netzwerkrekonstruktionen des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis beinhalten die Stoffwechselreaktionen der
Isocitratlyase (EC 4.1.3.1) (ICL) und der Malat-Synthase (EC 2.3.3.9) (MS). Hieraus
erhält man einen funktionierenden, bakteriellen Glyoxylatzyklus [120, 122–124].
46
2.2. Ergebnisse und Diskussion
Die Isocitratlyase, das erste Enzym dieses Zyklus, spaltet Isocitrat zu Succinat und
Glyoxylat. Die Malatsynthase verbindet anschließend Glyoxylat und Acetyl-CoA zu
Malat und Coenzym A. Jedoch sind die entsprechenden Gene für beide Enzyme nicht
im Genom annotiert. Das Einfügen dieser beiden Reaktionen in das entsprechende
Netzwerk wurde zum Teil damit begründet, dass es Anzeichen gab, dass die jeweilige
enzymatische Aktivität experimentell nachgewiesen werden konnte [140, 166, 167]. Allerdings sind diese experimentellen Ergebnisse nicht schlüssig [93]. Überdies wurden
kürzlich erst Gene für einen funktionierenden Glyoxylatzyklus im Genom von einigen Cyanothece-Stämmen identifiziert [168]. Diese besitzen jedoch keine Homologie
zu Genen im Genom von Synechocystis.
Um Gewissheit in dieser Sache zu bekommen, wurden in dieser Arbeit die funktionalen Auswirkungen eines Glyoxylatzyklus auf die optimale Flussverteilung beim phototrophen Wachstum durch mehrere Szenarien getestet. Zusätzlich wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe ‚Biochemie der Pflanzen‘, die einzelnen enzymatischen
Schritte eines Glyoxylatzyklus bei Synechocystis experimentell untersucht und validiert. Die zugehörigen Experimente wurden von Marianne Gründel durchgeführt.
Wenn eine Isocitratlyase in die Stoffwechselrekonstruktion von Synechocystis eingebracht wird, ist deren enzymatische Reaktion ein Teil der berechneten optimierten
Flussverteilung. In diesem Fall dient die Isocitratlyase zur Synthese von Glyoxylat,
welches als Vorstufe für die Aminosäuren Glycin, Serin und Cystein fungiert. Demzufolge sind die Reaktionen der Photorespiration bei dieser Flusslösung unter diesen Bedingungen dafür nicht notwendig. Wenn jedoch angenommen wird, dass der
Phosphoserin-Weg existiert und funktioniert, gibt es weder einen Fluss durch den
kompletten Glyoxylatzyklus noch durch die Isocitratlyase. Für die Simulation des
Zellwachstums unter der Abwesenheit von Licht erhält man ebenfalls einen Fluss in
der Optimierung durch den kompletten Glyoxylatzyklus. Es lässt sich noch anmerken,
dass in einigen Netzwerkrekonstruktionen [120] der Glyoxylatzyklus eingeführt wurde, um den sonst unvollständigen cyanobakteriellen TCA-Zyklus zu schließen.
Um experimentell die Möglichkeit einer enzymatischen Aktivität der Isocitratlyase
in Synechocystis nachzuweisen, wurde eine verbesserte Methode zur IsocitratlyaseAktivitätsbestimmung im zellfreien Extrakt angewandt. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Methode von Dixon und Kornberg [169] adaptiert. Diese beschreibt ein
Standardverfahren für den Nachweis und die Bestimmung von Glyoxylat in löslichen
Zellextrakten. Hierbei reagiert Glyoxylat mit Phenylhydrazin zu Phenylhydrazon, welches durch Absorption bei 324 nm gemessen werden kann. Zu beachten ist jedoch, dass
auch andere Metaboliten mit reaktiven Keto- oder Aldehydgruppen zu der gleichen Reaktion führen können. Deswegen sei besonders 2-Oxoglutarat erwähnt, welches durch
die Decarboxylierung von Isocitrat durch die Isocitrat-Dehydrogenase in Anwesenheit
von NADP entsteht.
Aus diesem Grund, wurden die Messungen in Rohextrakten von SynechocystisZellen durchgeführt, die über eine PD-10 Gelfiltrationssäule aufgereinigt wurden, um
kleine reaktive Metaboliten und NADP zu entfernen. Die Ergebnisse ließen erkennen, dass keine signifikante Isocitratlyase-Aktivität in gefilterten Rohextrakten von
47
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Synechocystis nachweisbar war (Abbildung 2.9 A; Spur B). Ohne den Filtrationsschritt
konnte eine kleine Erhöhung der Absorption bei 324 nm auch in Abwesenheit von Isocitrat gemessen werden. Diese beruht wahrscheinlich auf der Absorption von kleinen
reaktiven Metaboliten im Rohextrakt. Nach Zugabe von Isocitrat konnte eine viel höhere Zunahme der Absorption (324 nm) gemessen werden (Abbildung 2.9 A; Spur A),
welche ähnlich zu den Messungen aus der Literatur sind [166, 167].
Diese Ergebnisse zeigen, dass die gemessene Zunahme der Absorption (324 nm) in
Rohextrakten, die nicht durch Gelfiltration aufgereinigt wurden, vor allem aus der Bil-
Abbildung 2.9.: Experimentelle Überprüfung des Glyoxylat-Shunts.
A) Enzymatischer Test um die Isocitratlyase-Aktivität in zellfreien Extrakten von Synechocystis sp. PCC 6803 zu bestimmen. Messung der Phenylhydrazon-Bildung bei A324 nm.
Spur A: Messung im Rohextrakt. Spur B: Messung im aufgereinigten Rohextrakt. Die Pfeile markieren
die schrittweise Zugabe von Phenylhydrazin (Phe, 5 mM), Isocitrat (IC, 1 mM) und NADP (0,2 mM). Der
Anstieg der A324 nm in der Spur A nach der Zugabe von Phenylhydrazin lässt sich durch reaktive Metaboliten erklären. Der weitere Anstieg nach der Zugabe von IC erklärt sich durch internes NADP im
Rohextrakt, welches durch die Isocitrat-Dehydrogenase mit dem IC zu 2-Oxoglutarat reagiert. Beide Spuren zeigen den gleichen starken Anstieg nach der externen Zugabe von NADP, der sich auf die Aktivität
der Isocitrat-Dehydrogenase zurückführen lässt.
B) Spot-Assay zur Überprüfung der Acetat-Aufnahme und der Nutzung von Acetat als alleinige Kohlenstoffquelle. Die photosynthetische Aktivität wurde mittels des Photosystem II-Inhibitors DCMU unterdrückt,
um die Fähigkeit des photoheterotrophen Wachstums zu bestimmen. Die entsprechenden Kontrollen wurde ohne DCMU und mit oder ohne externes Acetat durchgeführt. Gezeigt sind verschiedene Verdünnungsstufen (1:1, 1:10 und 1:100) von Synechocystis-Kulturen auf BG11-Agar (Experimentelle Ergebnisse von
Marianne Gründel und Yvonne Zilliges; Abbildung aus Knoop et al. (2013) [94]).
48
2.2. Ergebnisse und Diskussion
dung von 2-Oxoglutarat resultiert. Verifiziert wurde dies außerdem durch einen enzymatischen Test für 2-Oxoglutarat (nicht dargestellt). Daraus lässt sich schließen, dass
die Isocitratlyase-Aktivität, die in der Literatur beschrieben wird, sehr wahrscheinlich
das Ergebnis der Isocitrat-Dehydrogenase-Reaktion ist.
Weitere Hinweise auf das Nichtvorhandensein des Glyoxylatzyklus gibt die Tatsache, dass Synechocystis nicht die Fähigkeit besitzt, Acetat als alleinige Kohlenstoffquelle in Gegenwart des Photosystem II-Inhibitors 3-(3,4-Dichlorphenyl)-1,1-Dimethylharnstoff (DCMU) (photoheterotrophes Wachstum) zu nutzen. Dieser Test wurde von Yvonne Zilliges durchgeführt. Simulationen mit dem Netzwerkmodell zeigen
hier, dass beim Vorhandensein des Glyoxylatzyklus, ein solches photoheterotrophes
Wachstum möglich wäre. Die Versuchsergebnisse von Marianne Gründel zum Nachweis einer Isocitratlyase-Aktivität und der Spot-Assay zur Überprüfung der AcetatAufnahme von Yvonne Zilliges sind in der Abbildung 2.9 B gezeigt.
2.2.9. Der TCA-Zyklus der Cyanobakterien
Als einer der wichtigsten Wege im zentralen Stoffwechsel hat der TCA-Zyklus eine
zweifache Rolle. Zum einem wird er für die Oxidation von Substraten für die Atmungskette zur ATP-Generierung gebraucht und zum anderen für die Bereitstellung von Metaboliten, wie zum Beispiel Oxalacetat oder 2-Oxoglutarat, die für das Zellwachstum
benötigt werden [170].
Bis vor kurzem ist man davon ausgegangen, dass Cyanobakterien einen unvollständigen TCA-Zyklus besitzen, da die Gene, welche für den 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase (OGDH)-Komplex kodieren, nicht in dessen Genomen annotiert sind. Dementsprechend besitzen bisher nahezu alle älteren, veröffentlichten Netzwerkrekonstruktionen
von Synechocystis jeweils einen unvollständigen TCA-Zyklus und verwenden daher zusätzliche Reaktionen, um einen zyklischen Fluss zu ermöglichen. Ein Beispiel hierfür
ist die Rekonstruktion, die von Shastri und Morgan [120] veröffentlicht wurde, welche
den Glyoxylatzyklus benutzt, um den TCA-Zyklus zu schließen. Ebenso wie in den vorangegangenen Netzwerkkonstruktionen beziehungsweise in den ersten Versionen des
Netzwerkes [93] wurde der TCA-Zyklus durch einen Bypass, den sogenannten γ-Aminobutyrat (GABA)-Shunt, geschlossen. Dabei läuft ein Fluss von 2-Oxoglutarat über
Glutamat, γ-Aminobutyrat und Succinat-Semialdehyd, zu Succinat.
Erst vor kurzer Zeit wurde in Synechococcus sp. PCC 7002 eine direktere Möglichkeit von Zhang und Bryant gefunden, den TCA-Zyklus in Cyanobakterien zu schließen [142]. Viele Cyanobakterien, einschließlich Synechocystis, besitzen Gene für zwei
Enzyme, welche den fehlenden OGDH-Komplex ersetzen können. Dazu gehören zum
einen Gene für eine 2-Oxoglutarat-Decarboxylase (EC 4.1.1.71) (2OGDC) (sll1981)
und zum anderen eine Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.16) (SSADH)
(slr0370). Zusammen bilden diese beiden Enzyme eine direkte Verbindung, welche
es den Cyanobakterien gestattet, den unvollständigen TCA-Zyklus zu schließen und
einen zyklischen Fluss zu ermöglichen (siehe Abbildung 2.10 B).
Wie in Kapitel 2.2.4 dargelegt, zeigt die optimale Flussverteilung des photoautotrophen Wachstums, keinen zyklischen Fluss durch den TCA-Zyklus. Dieser dient haupt-
49
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Abbildung 2.10.: Alternative Möglichkeiten des TCA-Zyklus. A) Der konventionell geschlossene, bakterielle TCA-Zyklus über einen OGDH-Komplex. B) Der TCA-Bypass von Zhang und Bryant [142] über eine
2-Oxoglutarat-Decarboxylase. C ) Der Glyoxylat-Shunt, um den TCA-Zyklus zu überbrücken, verwendet
unter anderem bei der Rekonstruktion von Shastri und Morgan [120]. D) Der GABA-Shunt wurde als erste
Möglichkeit eingebaut, einen zyklischen Fluss über den TCA-Zyklus ohne Glyoxylat-Shunt zu ermöglichen
[93]. Vom stöchiometrischen Aspekt her ist der konventionelle Zyklus A) am effektivsten (Abbildung aus
Knoop et al. (2013) [94]).
sächlich dazu, Oxalacetat und 2-Oxoglutarat für die Synthese der Biomasse bereitzustellen und um Fumarat, welches während des Wachstums zum Beispiel bei der
Purinsynthese entsteht, zurück in den Stoffwechsel zu führen. Demzufolge tragen die
beiden neu entdeckten Enzyme bei der berechneten Flusslösung keinen Fluss. Nichtsdestotrotz ist das Nichtvorhandensein eines zyklischen Flusses durch den TCA-Zyklus,
während des ausschließlich phototrophen Wachstums, nicht in vollständiger Übereinstimmung mit experimentell gemachten Beobachtungen. Zumindest besitzen Synechococcus sp. PCC 7002-Mutanten, bei denen die 2OGDC und SSADH fehlen beziehungsweise nicht funktionsfähig sind, eine geringere Wachstumsrate unter konstanten Lichtbedingungen und unter Hell-Dunkel-Bedingungen, als der Wildtyp [142].
Bei Abwesenheit von Licht ändert sich das vorhergesagte Flussmuster. In der Dunkelphase läuft typischerweise ein zyklischer Fluss durch den TCA-Zyklus ab, damit
der respiratorische Stoffwechsel ablaufen kann, um die ATP-Synthese zu gewährleis-
50
2.2. Ergebnisse und Diskussion
ten (siehe Kapitel 2.2.6. Um die Rolle des zyklischen Flusses in Abwesenheit von Licht
durch den TCA-Zyklus abzuschätzen, wird zwischen vier möglichen Szenarien unterschieden, welche in Cyanobakterien eine Schließung des TCA-Zyklus ermöglichen:
A) einem konventionellen bakteriellen TCA Zyklus mit OGDH-Komplex, welcher nicht
in Cyanobakterien annotiert ist
B) einem cyanobakteriellen TCA-Zyklus mit Verwendung einer 2-Oxoglutarat-Decarboxylase und einer Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase
C) einem Glyoxylatzyklus inklusive Isocitratlyase-Reaktion für einen zyklischen Fluss
durch den TCA-Zyklus
D) sowie einem unvollständigen TCA-Zyklus, der durch den GABA-Shunt geschlossen
wird, um einen zyklischen Fluss zu ermöglichen
In der ersten veröffentlichten Rekonstruktion des Stoffwechselnetzwerkes von Synechocystis [93] (Abbildung 2.10 D) war ein Fluss durch den GABA-Shunt für die Zellatmung notwendig. Dabei ist die Abfolge der zugehörigen Reaktionen von der Stöchiometrie identisch zum relativ neu entdeckten Weg über die 2-Oxogluterate-Decarboxylase
von Zhang und Bryant [142] (Abbildung 2.10 B). Daher werden im Kontext einer FBA
beide Wege mit der gleichen Effektivität genutzt.
Interessanterweise ist jedoch die Effektivität in Bezug auf die Biomasseproduktion
für die beiden erst genannten Fälle niedriger als bei der Nutzung des konventionellen
Zyklus über den OGDH-Komplex und somit eigentlich nur eine suboptimale Lösung
für den respiratorischen Stoffwechsel. Nogales et al. [125] argumentieren, dass der
GABA-Shunt trotzdem eine evolutionär günstigere Lösung wäre und begründen dies
damit, dass ein festgesetzter Fluss durch den GABA-Shunt während des phototrophen
Wachstums zu keiner Verringerung der Wachstumsrate führt im Vergleich zu einem
festgesetzten Fluss durch den OGDH-Komplex. Gleichwohl bezogen auf den neuesten
TCA-Weg nach Zhang und Bryant [142] kann dieser Tatbestand nicht unterstützt werden. Eine genauere Betrachtung dieses Sachverhalts ist in Kapitel 2.2.10 dargelegt.
Eine schlüssigere Erklärung für die Nutzung des stöchiometrisch ineffizienteren
TCA-Weges bei Cyanobakterien über eine 2-Oxoglutarat-Decarboxylase und eine Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase anstelle des herkömmlichen OGDH-Komplexes,
kann der Unterschied beider Wege in den Anforderungen in Bezug auf die Proteinsynthese sein: Der OGDH-Komplex ist eine hochentwickelte Maschinerie, die analog
zum Pyruvatdehydrogenase (PDH)-Komplex durch drei Untereinheiten kodiert wird.
In Escherichia coli besteht dieser Komplex aus einem 24-teiligen Kern aus E2-Proteinkomponenten, welche durch das sucB-Gen kodiert werden und einer unbekannten
Anzahl der beiden anderen Komponenten in einem bis jetzt noch nicht vollständig geklärten Verhältnis [171, 172]. Hingegen werden die beiden alternativen Routen über
den GABA-Shunt oder den Weg über die 2-Oxoglutarat-Decarboxylase von Zhang und
Bryant [142] von strukturell einfacheren Enzymen kodiert. Ein Überblick über die
Aminosäurenanzahl für die jeweiligen Enzyme ist in Tabelle 2.4 zu sehen.
51
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Angesichts der hohen strukturellen Komplexität des OGDH-Komplexes und der relativen Bedeutungslosigkeit des zyklischen Flusses durch den TCA-Zyklus für das phototrophe Wachstum von Cyanobakterien, könnte ein solcher Unterschied in den Proteinkosten ein Kompromiss zwischen der enzymatischen Effektivität und den Synthesekosten darstellen. Tatsächlich wird zunehmend beobachtet, dass die Maximierung des
Stoffwechsels auf Effektivität und Biomassesyntheseeffizienz nicht notwendigerweise
immer das universelle Prinzip ist [101, 173]. In diesem Kontext ist auch interessanterweise die Isocitratlyase zu nennen, welche nicht in Synechocystis vorhanden ist.
Auch hier gilt, wenn diese in das Modell eingefügt wird, ergibt sich eine etwas höhere
Ausbeute an Biomasse beim Wachstum bei Abwesenheit von Licht. Bei diesem Szenario dient das entstehende Succinat als Substrat für die SDH und erlaubt damit einen
zyklischen Fluss durch den TCA-Zyklus für den respiratorischen Stoffwechsel.
Tabelle 2.4.: Enzymschritte mit der benötigten Anzahl (Länge) an Aminosäuren für eine Verbindung im
TCA-Zyklus beziehungsweise dessen Bypass von 2-Oxoglutarat zu Succinat beziehungsweise SuccinylCoA (Tabelle aus Knoop et al. (2013) [94]).
Organismus
Stoffwechselweg
Gen
EC-Nummer
Länge
Escherichia
coli K-12
OGDHKomplex
Arabidopsis
thaliana
OGDHKomplex
Chlamydomonas
reinhardtii
OGDHKomplex
Helicobacter
pylori 26695
OOR
Synechocystis
sp. PCC 6803
2OGDC
sucA
sucB
lpd
AT3G55410
AT5G65750
AT4G26910
AT5G55070
mtLPD1
LPD1
mtLPD2
AT4G16155
OGD1
OGD2
DLD2
GCSL
oorA
oorB
oorC
oorD
sll1981
gabD
slr1022
sll1641
gabD
1.2.4.2
2.3.1.61
1.8.1.4
1.2.4.2
1.2.4.2
2.3.1.61
2.3.1.61
1.8.1.4
1.8.1.4
1.8.1.4
1.8.1.4
1.2.4.2
2.3.1.61
1.8.1.4
1.8.1.4
1.2.7.3
1.2.7.3
1.2.7.3
1.2.7.3
4.1.1.71
1.2.1.16
2.6.1.19
4.1.1.15
1.2.1.16
933
405
474
1017
1025
464
464
507
623
507
630
1037
450
574
502
375
273
186
113
550
454
429
467
454
GABAShunt
52
2.2. Ergebnisse und Diskussion
2.2.10. Der zyklische Fluss durch den TCA-Zyklus in der optimalen
Flussverteilung
In der Literatur wird behauptet, dass ein Nebenweg über γ-Aminobutyrat (GABAShunt) gegenüber einem kompletten TCA-Zyklus einen evolutionären Vorteil bei autotrophen Bedingungen auf Kosten des reduzierten Wachstums bei heterotrophen Bedingungen besitzt [125]. Diese Hypothese wurde überprüft, indem ein Fluss durch einen
potentiellen OGDH-Komplex sowie durch die Glutamat-Synthase erzwungen wurde,
einmal unter autotrophen und einmal unter heterotrophen Bedingungen.
Ein Fluss durch den OGDH-Komplex führt zu einer sofortigen und starken Reduktion des Wachstums unter autotrophen Bedingungen, während ein erzwungener Fluss
durch die Glutamat-Synthase (EC 1.4.1.14) (GLS) nur zu einer geringfügigen Reduktion des autotrophen Wachstums führt. Wie in Kapitel 2.2.4 beschrieben wird, ist jedoch
für das autotrophe Wachstum kein geschlossener TCA-Zyklus erforderlich und ein festgesetzer Fluss durch einen OGDH-Komplex würde nur eine Umverteilung des optima-
Abbildung 2.11.: Auswirkungen das TCA-Zyklus auf das optimale Wachstum unter phototrophen Bedingungen. Gezeigt sind hierbei die Wachstumsraten bei einem zunehmenden Fluss durch: A) GLS:
die Gutamat-Synthase B) GDH: die Glutamat-Dehydrogenase C) SSADH: die Succinat-SemialdehydDehydrogenase D) OGDH: den 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex. Während ein zunehmender
Fluss durch die Glutamat-Dehydrogenase (GDH) bis zur unteren beziehungsweise oberen Flussgrenze
keinen Einfluss auf die optimale Wachstumsrate hat, ist bei einem größeren Fluss durch die GutamatSynthase (GLS) ein Einfluss zu erkennen. Bei der Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase (SSADH) und
der 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase (OGDH) genügt schon ein niedriger Fluss, um die Wachstumsrate
stark zu beeinträchtigen.
53
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
len Flusses erzwingen und somit eine unnötige metabolische Belastung darstellen. Auf
der anderen Seite fließt auch unter autotrophen Bedingungen ein Fluss durch die GLS.
Eine manuelle Festlegung des Flusses durch die GLS hat daher keine großen unmittelbaren Auswirkungen auf das Wachstum. Wenn aber anstatt eines Flusses durch die
GLS ein Fluss durch die Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase erzwungen wird, welche auch einen Schritt des GABA-Shunts darstellt, erhält man ähnliche Ergebnisse
wie für den Fluss durch den OGDH-Komplex (siehe Abbildung 2.11). Die evolutionäre
Bedeutung und die jeweiligen möglichen Vorteile des GABA-Shunts gegenüber dem
OGDH-Komplex und dem neu entdeckten TCA-Nebenweg (Bypass) von Zhang und
Bryant (2011) [142], bleiben demnach noch offen.
2.2.11. Zeitliche Koordination des phototrophen Stoffwechsels
In den meisten natürlichen Lebensräumen der Cyanobakterien müssen sie ihren Stoffwechsel an unterschiedliche Lichtbedingungen anpassen, die während eines Tagesverlaufs auftreten. Diese Maßgaben haben einen signifikanten Einfluss auf den Organismus und bringen ihn dazu, seinen Stoffwechsel innerhalb des metabolischen Netzwerkes zu reorganisieren und zu verändern. Dementsprechend sind Cyanobakterien die
einzigen bis jetzt bekannten Prokaryoten, die eine endogene circadiane Uhr besitzen,
die als intrazellulärer Zeitgeber fungiert [174].
Um das zyklische Verhalten von Cyanobakterien genauer zu erforschen, gab es über
die letzten Jahre viele Studien, zum Beispiel mit Hochdurchsatzdaten des Stoffwechsels [145, 175–178]. Allerdings konzentrieren sich alle aktuellen großen Netzwerkrekonstruktionen ausschließlich auf ein phototrophes Wachstum unter konstantem
Lichteinfall oder auf ein heterotrophes Wachstum. In dieser Arbeit wird versucht, diese Lücke durch eine Analyse der zeitlichen Koordination des cyanobakteriellen Stoffwechsels zu schließen, indem ein voller Tagesablauf des phototrophen Stoffwechsels
simuliert wurde. Das Einbeziehen und Modellieren von zirkadianen Änderungen in
ein genomskaliges Modell des Stoffwechsels ist keine triviale Aufgabe. Um dies zu
lösen, stehen im Allgemeinen zwei Ansätze zur Verfügung:
• Der Bottom-up-Ansatz:
Hierbei können große Mengen von Gentranskriptionsdaten oder Proteinexpressionsdaten verwendet werden, um die Präsenz von Proteinen beziehungsweise enzymatischen Umwandlungen zu bestimmten Zeitpunkten zu ermitteln. Dabei ist jedoch zu
beachten, dass das Vorhandensein von Gentranskripten oder Proteinen nicht notwendigerweise mit dem metabolischen Fluss korreliert und es wurden schon häufig widersprüchliche Expressionswerte für einzelne Wege oder Isoenzyme gemessen. Eine aktuelle Analyse, in der gepaarte mRNA- und Proteindaten für Tag-Nacht-synchronisierte
Kulturen des Cyanobakteriums Prochlorococcus MED4 ausgewertet wurden, zeigte
nur eine geringe Korrelation zwischen mRNA- und Proteinvorkommen. Zudem wurden nur geringe Änderungen in der relativen Abundanz aller Enzyme über den gesamten zeitlichen Verlauf beobachtet [179]. Daher wird vermutet, dass eine direkte Integration von Gentranskriptionsdaten um metabolische Flüsse zu regeln beziehungsweise einzuschränken, wie es bereits für heterotrophe Bakterien angewendet wurde [180],
54
2.2. Ergebnisse und Diskussion
keine geeignete Strategie ist, um den periodischen Tagesverlauf des cyanobakteriellen
Stoffwechsels zu beschreiben.
• Der Top-down-Ansatz:
Eine alternative Strategie, welche in dieser Arbeit verfolgt wurde, ist daher ein Topdown-Ansatz, bei dem die Zielfunktion der Zelle
abhängig von der Zeit und den Veränderung der
Lichtverfügbarkeit definiert wird. Speziell hierfür
wurde ein kürzlich erworbener Datensatz vom zyklischen Verhalten der Gentranskripte von Synechocystis sp. PCC 6803 [181] verwendet (bereitgestellt von Robert Lehmann), welcher Einblicke in
die zeitliche Koordination des cyanobakteriellen
Stoffwechsels gewährt. Hierbei wurde der Transkriptdatensatz, entgegen dem Einsatz bei einem
Bottom-up-Ansatz, nicht direkt dazu verwendet,
um bestimmte Enzymaktivitäten und damit verbundene Reaktionsraten festzulegen oder einzugrenzen, sondern um einen umfassenden Überblick über die zeitliche Koordination ganzer Enzymgruppen im Stoffwechsel zu erhalten.
Die sich hieraus ergebenden Expressionsmuster von Stoffwechselenzymen sind in Abbildung 2.12 gezeigt und liefern wichtige Hinweise auf die zeitliche Koordination des phototrophen Stoffwechsels. Besonders fällt auf, dass in
Synechocystis im Gegensatz zu einigen diazotrophen Stämmen [175], die Mehrheit der oszillierenden Gene ihr Transkriptionsmaximum während
des Tages erreichen, was auf eine stark reduzierte Expressionsaktivität während der Nacht schließen lässt. Von den Transkripten, deren Expressionsrate während der Nacht am höchsten ist, können die meisten Transportvorgängen zugeordnet
werden oder auch zum Teil dem TCA-Zyklus. Hierzu zählt insbesondere das Transkript, welches
dem Gen entspricht (sll1981), das von Zhang und
Bryant [142] für den TCA-Bypass identifiziert
wurde. Aufgrund der Tatsache, dass viele Transportprozesse für die Aufnahme von wachstumslimitierenden Mikronährstoffen, wie Eisen oder
Mangan, zuständig sind, gibt es wenig Grund zu
der Annahme, dass der Transport exklusiv auf
den Tag beschränkt ist.
Abbildung 2.12.: Phasensortierte Expressionsprofile von metabolischen Genen in
Synechocystis als eine Funktion der circadianen Zeit (CT). Es sind zwei unabhängige
Replikate nacheinander gezeigt. Die große
Mehrheit der Transkripte hat ihr Expressionsmaximum während der Lichtphase (Abbildung aus Knoop et al. (2013) [94]).
55
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Die Einblicke, die man durch Expressionsdaten erhält, können zusätzlich durch
physiologische Daten ergänzt werden. So existieren zum Beispiel für Synechocystis
oder anderen Cyanobakterienstämme wie Cyanothece ATCC 51142 zeitliche Messungen beziehungsweise Abschätzungen der Biomasse und des Chlorophyllgehalts durch
Bestimmung der optischen Dichte bei verschiedenen Wellenlängen. Es konnte gezeigt
werden, dass die Chlorophyllkonzentration vom frühen Morgen bis zum Mittag stark
ansteigt und anschließend konstant bleibt [176]. Demgegenüber erhöht sich die Biomasse erst signifikant nach Ende der Chlorophyllakkumulation, was sich durch eine entsprechende Zunahme von Speicherverbindungen wie Glykogen erklären lässt
[176]. Ferner wurde für Synechococcus elongatus PCC 7942 gezeigt, dass trotz einer
rhythmischen Zellteilung die DNA-Synthese immer mit einer konstanten Rate erfolgt,
das heißt, es existiert keine Koppelung zwischen der DNA-Synthese und der Zellteilung [182].
Basierend auf diesen empirischen Beobachtungen, wurde eine zeitaufgelöste Biomassezielfunktion (Biomass Objective Function) entwickelt, um einen vollen Tagesablauf des phototrophen Stoffwechsels von Synechocystis zu simulieren. Statt der
Benutzung einer einzelnen BOF wurden die unterschiedlichen Biomassekomponenten nach ihrer Synthesereihenfolge wie folgt aufgeschlüsselt: Es wurde davon ausgegangen, dass die Aufnahmerate von Mikronährstoffen beziehungsweise anorganischen Ionen über den ganzen Tagesverlauf gleich bleibt. Auch die DNA-Synthese wird
über den gesamten Zeitraum konstant gesetzt. Ebenso wird eine gleichbleibende ATPVerbrauchsrate für den basalen ATP-Verbrauch (Maintenance) über den Tag angenommen. Alle anderen Biomassekomponenten werden durch einen Faktor in der BOF beschrieben, die nach Lichtverfügbarkeit maximiert wird.
Um die Ergebnisse der Pigmentmessungen [176] abzubilden, wurde der Faktor für
die Pigmentsynthese zwei Stunden vor Sonnenaufgang erhöht und ab Mittag wieder
vermindert. Im Gegensatz dazu wurde der Faktor für die Synthese der Speicherstoffe beziehungsweise von Glykogen erst nach der Mitte des Tages erhöht. Zusätzlich
wurde ein ATP-Verbrauch für die Proteinsynthese in die BOF eingebracht, der einen
erhöhten Bedarf an ATP während des Wachstums widerspiegeln soll. Ähnlich zu den
Simulationen bei Abwesenheit von Licht (siehe Kapitel 2.2.6), wird eine untere Grenze
des Flusses für die Zellatmung auch während der Lichtperioden gesetzt, so dass eine
restliche respiratorische Aktivität auch während des Tages gewährleistet wird. Die
Entwicklung von radikalen Sauerstoffspezies und die Mehler-Reaktion werden abhängig zur Lichtintensität gesetzt. Der Stoffwechsel während der Nacht wird auf den Glykogenabbau, welcher zur DNA-Synthese, zur Aufnahme von Nährstoffen und anorganischen Ionen sowieso zur Zellatmung und zur Erfüllung des basalen ATP-Verbrauchs
(Maintenance) dient, beschränkt. Für die Biomassesynthese wurde das Prinzip der dynamischen FBA [183] genutzt.
Die Ergebnisse eines vollen Tagesablaufs des phototrophen Stoffwechsels sind in
Abbildung 2.13 gezeigt. Dabei sind komplexe Übergänge in den metabolischen Flüssen
über den gesamten Tagesverlauf von 24 Stunden zu beobachten. Angefangen vom Metabolismus in der Nacht, der von dem respiratorischen Stoffwechsel dominiert wird,
56
2.2. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 2.13.: Zeitabhängige Biomassezielfunktion. Die obere Graphik zeigt die Aufteilung der Biomassefunktion über einen vollen Tagesgang. Der untere Graph zeigt die Simulation der Synthesen und
Akkumulationen der einzelnen Biomassekomponenten in Abhängigkeit zur circadianen Zeit (CT). CT = 0 h
markiert den Sonnenaufgang (Abbildung aus Knoop et al. (2013) [94]).
bis hin zum optimierten Zellwachstum im Laufe des Tages. Wie vorher definiert, erhöht sich die Konzentration der Pigmente in den frühen Morgenstunden und bleibt
nach der Mitte des Tages annähernd konstant. Der Glykogengehalt nimmt während
der zweiten Hälfte des Tages stark zu und wird während der Nacht als Kohlenstoffund Energiequelle verwendet.
Für einige ausgewählte metabolische Reaktionen sind die zeitabhängige Flussraten
in der Abbildung 2.14 dargestellt. Gezeigt sind dabei:
A) die Netto-Sauerstoffaufnahme, die bei der Abwesenheit von Licht positiv ist und
am Tage proportional zur Lichtverfügbarkeit verläuft
B) die Phosphoglyceratkinase, welche zuerst in der Nacht einen geringen negativen
Fluss gemäß des Glykogenabbaus und später tagsüber einen hohen positiven Fluss
entsprechend der Regeneration des Calvin-Benson–Zyklus aufweist.
C) die Interkonversion von Glucose-1-Phosphat zu Glucose-6-Phosphat läuft zunächst
entsprechend des Glykogenabbaus im Dunkeln Richtung der Glykolyse ab, also zu
57
2.3. Schlussfolgerungen
2.3. Schlussfolgerungen
n der heutigen Zeit wird die Analyse der Struktur und Funktion von metabolischen Netzwerken zunehmend durch rechnerische Ansätze unterstützt, welche
eine systematische Sichtweise auf die möglichen Interkonversionsrouten innerhalb des Netzwerkes gewähren. Für eine solche Analyse ist eine umfassende Rekonstruktion, die alle enzymatischen Reaktionen, die in einer Zelle beziehungsweise einem Organismus ablaufen, umfasst, eine wichtige Voraussetzung. In dieser Hinsicht
wurde in dieser Arbeit eine manuell kuratierte Rekonstruktion des metabolischen
Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803 erstellt, welcher ein bekannter einzelliger Modellorganismus für den photothrophen Stoffwechsel ist. Die Rekonstruktion
eines metabolischen Netzwerkes basiert in der Regel auf der annotierten Genomsequenz des spezifischen Organismus, kombiniert mit verschiedenen Reaktions- und
Stoffwechselrepertoires beziehungsweise Datenbanken. Allerdings liegt der Fokus der
meisten Datenbanken und Repositorien in erster Linie auf einzelnen Ausschnitten
des Stoffwechsels und sie betrachten deshalb nicht das resultierende Netzwerk als
eine ganze gesamte funktionale Einheit. Im Gegensatz dazu zielt die Netzwerkrekonstruktion insbesondere darauf, die vielfältigen Anforderungen, die eine bloße Liste von
Reaktionen gegenüber einem funktionalen Netzwerk unterscheiden, mit einzubeziehen. Solche Anforderungen umfassen die Fähigkeit des Netzwerkes, alle essentiellen
Zwischenprodukte und Vorstufenmetaboliten, die für die Produktion von Biomasse benötigt werden, zu synthetisieren, eine Möglichkeit aus dem System heraus Energie
(ATP) für zum Beispiel den basalen ATP-Verbrauch (Maintenance) zu gewinnen, das
Redox-Gleichgewicht zu erhalten und auch in der Lage zu sein, alle Metaboliten und
Cofaktoren des Netzwerkes wieder zu regenerieren. Falls eine oder mehrere dieser
Anforderungen nicht von der Netzwerkrekonstruktion erfüllt werden, weist dieses auf
Fehler oder Lücken in der Stöchiometrie des Netzwerkes hin. Dies hätte eine entsprechende erneute Prüfung des Netzwerkes zur Folge. Somit kann die Rekonstruktion
metabolischer Netzwerke, welche den zellulären Stoffwechsel als hoch integratives
Netzwerk ansieht, als Vorstufe zur metabolischen Modellierung gesehen werden.
I
Trotz der bedeutenden Leistungen der letzten Jahre durch mehrere Dutzend Rekonstruktionen von unterschiedlichen Organismen, befindet sich die systematische
Rekonstruktion genomskaliger metabolischer Netzwerke von phototrophen Organismen noch in ihrem Anfangsstadium. Während bereits viele Studien und Analysen für
Algorithmen zur automatisierten Lückenschließung in Netzwerken existieren, sind
diese Algorithmen in der Regel nur an hoch idealisierten Beispielen veranschaulicht,
wie zum Beispiel die Wiederherstellung eines zuvor bekannten kompletten Netzwerkes nach manuellem Entfernen einzelner Reaktionen. Aus diesem Grund basiert bis
jetzt eine qualitativ hochwertige Rekonstruktion überwiegend auf einer umfangreichen manuellen Kuration, die ihre Informationen aus der biochemischen Primärliteratur bezieht.
Ein anhaltendes Problem sind die vielfältig verwendeten Namenskonventionen in
verschiedenen Datenbanken und bestehenden Rekonstruktionen sowie die manchmal
59
Kapitel 2. Das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
inkonsistente oder falsche Annotation von Enzymen, die oft nur auf Sequenzvergleichen basiert. Eine zeitnahe Lösung für dieses Problem könnte die Entwicklung von
Standards beziehungsweise die Durchsetzung von Normen und Konventionen in wissenschaftlichen Veröffentlichungen sein [184]. Andere Probleme rühren meist von spezifischen Variationen her und sind weniger leicht zu überwinden. Zum Beispiel wurde
kürzlich gezeigt, dass selbst innerhalb eines solchen grundlegenden und gut analysierten Stoffwechselweges, wie dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel in Escherichia
coli, neue und unbekannte Reaktionen immer noch entdeckt werden können [185]. In
dieser Hinsicht kann jetzt nicht erwartet werden, dass die in dieser Arbeit vorgestellten Rekonstruktionen der metabolischen Netzwerke von Synechocystis sp. PCC 6803
oder Synechococcus elongatus PCC 7942 (siehe Kapitel 3) eine fehlerfreie Darstellung
des in vivo-Zustandes widerspiegeln. Vielmehr liegt die Absicht dieser Arbeit auch
darin, neue Diskussionen über mögliche Inkonsistenzen oder Schwachpunkte des Wissensstandes über den cyanobakteriellen Stoffwechsel anzuregen und weitere Ideen zu
fördern, die diese Unklarheiten auflösen oder beheben. Insbesondere bietet eine qualitativ hochwertige Netzwerkrekonstruktion, auch wenn sie zum Teil fehlerhaft oder
unvollständig ist, enorme Möglichkeiten, die Funktionsweise des Stoffwechsels zu erforschen und zu verstehen.
Die in dieser Arbeit vorgestellte genomskalige Rekonstruktion des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 beinhaltet das Wissen und die Informationen, welche bis zum aktuellen Zeitpunkt für dieses Cyanobakterium verfügbar waren. Integriert sind dabei neuartige Ergebnisse bezüglich des cyanobakteriellen TCA-Zyklus,
über den vermeintlich vorhandenen Glyoxylatzyklus sowie die Rolle der Photorespiration im Zusammenhang mit dem Zellwachstum. Das Modell beinhaltet verschiedene
Aspekte, die spezifisch für den phototrophen Stoffwechsel sind, wie unter anderem eine lichtabhängige Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zusätzlich zu dem Modell
selber, welches im verbreiteten SBML-Format vorliegt und somit für weitere Modellierungszwecke leicht zur Verfügung steht, wurde eine detaillierte grafische Übersicht
des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis angefertigt, welche weitere Diskussionen und die Interpretation von Ergebnissen erleichtert. Der Fokus lag hierbei auf
der Analyse des phototrophen Wachstums des Organismus, insbesondere wurden auch
die Konsequenzen und Einflüsse von einer abweichenden Topologie des Netzwerkes
auf das Wachstum beziehungsweise den gesamten Stoffwechsel untersucht.
In der Tat bleiben trotz der zahlreichen Rekonstruktionen in jüngster Zeit und der
umfangreichen biochemischen Literatur, die für Synechocystis zur Verfügung steht,
einige wichtige Reaktionsschritte unklar. In dieser Arbeit wurden mehrere alternative Möglichkeiten zur Schließung des TCA-Zyklus bei Cyanobakterien analysiert und
der Biomasseertrag beziehungsweise das Wachstum für die verschiedenen Szenarien
untereinander verglichen. Ein evolutionärer Vorteil des GABA-Shunts gegenüber dem
traditionellen OGDH-Komplex, wie Nogales et al. [125] argumentieren, konnte nicht
bestätigt werden. Der kürzlich entdeckte TCA-Bypass von Zhang und Bryant [142]
sowie auch der GABA-Shunt, erfordern wesentlich kleinere Investitionen bezüglich
der Enzymsynthese im Vergleich zum konventionellen OGDH-Komplex und könnte
60
2.3. Schlussfolgerungen
daher evolutionär gesehen von Vorteil sein für Organismen, die in erster Linie vom
phototrophen Wachstum abhängig sind.
Um die verschiedenen in der Literatur verfügbaren Rekonstruktionen zu bewerten,
wurde experimentell von Marianne Gründel und Yvonne Zilliges getestet, ob der vermeintliche Glyoxylatzyklus, der auf Grund von biochemischen Beobachtungen in mehreren Rekonstruktionen implementiert wurde, vorhanden ist. Im Endeffekt konnte
die Existenz einer enzymatischen Aktivität der Isocitratlyase unter den getesteten Bedingungen weder bestätigt werden, noch konnte gezeigt werden, dass Synechocystis
in der Lage ist, auf Acetat in Gegenwart von DCMU zu wachsen. DCMU inhibiert
die Oxidation von Wasser am Photosystem II und verhindert demzufolge den linearen Elektronentransport, aber nicht den zyklischen Elektronentransport am Photosystem I und die ATP-Generation. Beide Sachverhalte weisen stark darauf hin, dass
kein funktionaler Glyoxylatzyklus in Synechocystis vorhanden ist.
Die meisten aktuellen Rekonstruktionen werden anhand der Flussbilanzanalyse,
die es erlaubt, optimale Flussmuster, unter Einbeziehung einer speziellen Zielfunktion, vorherzusagen und zu bewerten, analysiert. Innerhalb dieser Arbeit half die FBA
unter anderem dabei, Schlüsse über das phototrophe Wachstum und dessen optimalen
Reaktionsflüsse zu ziehen sowie essentielle Gene und Synthesewege des photosyntetischen Stoffwechsels zu identifizieren. Zudem wurde gezeigt, wie sich der Stoffwechsel
beim Übergang von Licht- zu Dunkelphasen beziehungsweise bei tagestypischen wechselnden Hell-Dunkel-Zyklen reorganisiert, was ein spezifisches Merkmal für phototrophe Organismen ist. Bisher zielten die in der Literatur verfügbaren Rekonstruktionen
auf eine Analyse und Auswertung des hetero, mixo- und phototrophen Wachstums unter konstanten Lichtbedingungen, mit wenig Bezug zu den tatsächlichen Umgebungsbedingungen, denen der Organismus in vivo ausgesetzt ist. Dabei helfen Genexpressionsdaten und physiologische Eigenschaften, die es ermöglichen, grundlegende tageszeitpunktabhängige Abläufe im Stoffwechsel des Organismus zu beschreiben. Natürlich sind weitere ähnliche Ansätze erforderlich, um ein besseres Verständnis der Prinzipien und Abstimmungen während des phototrophen Wachstums zu erzielen. Zudem
wirft die Auswertung der Simulation eines gesamten Tagesverlaufs mehrere Fragen
in Bezug auf den cyanobakteriellen Stoffwechsel auf, die eine genauere Betrachtung
und Aufmerksamkeit in der Zukunft verdienen.
Insbesondere der Stoffwechsel bei Abwesenheit von Licht, zu dem auch das Wechselspiel zwischen oxygener Photosynthese und aerober Atmung, die in einem einzigen
Kompartiment der Zelle ablaufen, gehört, sind bis jetzt noch unzureichend erforscht.
Letzteres unterstreicht die Verbindung und das Zusammenarbeiten zwischen den zellulären Stoffwechselwegen als ein System von Versorgung und Nachfrage, das durch
den metabolischen Zustand der Zelle beeinflusst wird. Hierbei sind zahlreiche charakteristische Umschaltpunkte auszumachen, die verdeutlichen, dass die Effizienz von
zellulären Stoffwechselreaktionen keine intrinsische Eigenschaft des jeweiligen Stoffwechselweges ist, sondern von dem aktuellen Zustand und der metabolischen Nachfrage des gesamten Stoffwechsels abhängt.
61
KAPITEL
3
Die Diversität des cyanobakteriellen
Stoffwechsels
Dieses Kapitel basiert auf der Veröffentlichung:
[130] C. Beck, H. Knoop, I. M. Axmann und R. Steuer (2012). The diversity of cyanobacterial metabolism: genome analysis of multiple phototrophic microorganisms. BMC
Genomics, 13(1):56
63
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
Vorwort
m vorangegangenen Kapitel dieser Arbeit wurde im Detail auf den Stoffwechsel
des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 eingegangen und dieser mithilfe der Constraint-basierten Flussbilanzanalyse genauer untersucht.
Das nun anschließende Kapitel beschreibt die genaue Betrachtung und den Vergleich von 15 weiteren Cyanobakterien (16 Stämme inklusive Synechocystis sp. PCC
6803) auf Genomebene, wobei besonders Übereinstimmungen und Unterschiede auf
Ebene des Stoffwechsels hervorgehoben werden. Die Beantwortung der Frage nach
den Gemeinsamkeiten dieser Organismen des gleichen Phylums wird mithilfe der Definition von Clustern von vermutlichen orthologen Genen (CLOGs) eingeleitet. Diese
ermöglichen zwischen Kern-Genen, gemeinsamen und einzigartigen Genen zu unterscheiden und somit Rückschlüsse über das Kern- und das Pan-Genom der Cyanobakterien zu ziehen. Gemeinsamkeiten unter den Cyanobakterien werden im Detail in
Bezug auf den Zentralstoffwechsel und die Speicherstoffe genauer betrachtet, also welche Enzyme konserviert sind und wo Variabilität unter den einzelnen Cyanobakterien
existiert.
Die Methoden und Ergebnisse, die in diesem Kapitel vorgestellt werden, wurden
in Kooperation mit Christan Beck erarbeitet. Die Analysen, die im ersten Abschnitt
dieses Kapitels aufgeführt werden, die Definition und Berechnung der CLOGs (Kapitel
3.1.2 bzw. 3.2.1) sowie die Anreicherung der GO-Annotation (Kapitel 3.1.3 bzw. 3.2.2)
und die phylogenetische Analyse (Kapitel 3.1.4 bzw. 3.2.3), wurden von ihm durchgeführt.
I
64
3.1. Material und Methoden
3.1. Material und Methoden
3.1.1. Auswahl der Cyanobakterienstämme
Für die vergleichende Analyse der Diversität unter den Cyanobakterien wurden folgende 16 Stämmen ausgewählt:
• Acaryochloris marina MBIC 11017 (Aca11017)
• Cyanothece ATCC 51142 (Cyn51142)
• Cyanothece PCC 8801 (Cyn8801)
• Gloeobacter violaceus PCC 7421 (Glo7421)
• Microcystis aeruginosa NIES-843 (Mic843)
• Nostoc sp. PCC 7120 (Nos7120)
• Prochlorococcus marinus MED4 (ProMED4)
• Prochlorococcus marinus MIT 9211 (Pro9211)
• Prochlorococcus marinus MIT 9215 (Pro9215)
• Synechococcus sp. JA-2-3B’a(2-13) (SycJA23)
• Synechococcus sp. PCC 7002 (Syc7002)
• Synechococcus sp. WH7803 (Syc7803)
• Synechococcus elongatus PCC 7942 (Syc7942)
• Synechocystis sp. PCC 6803 (Syn6803)
• Thermosynechococcus elongatus BP-1 (ThermoBP1)
• Trichodesmium erythraeum IMS101 (Trich101)
Eine kurze Einleitung zu den Stämmen ist in Kapitel 1 gegeben. Die jeweiligen chromosomalen Genomsequenzen wurden im August 2010 aus der GenBank-Datenbank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) [186] extrahiert. Plasmidsequenzen wurden
für diese Analyse nicht weiter berücksichtigt, da nicht vollständig aufgeklärt ist, welche Gene auf diesen DNA-Fragmenten kodiert sind. Außerdem könnte die Einbeziehung solcher Sequenzen zu einer möglichen Verzerrung der Ergebnisse zugunsten von
Genomen mit Plasmiden, welche mehrere Gene enthalten, die über einen möglichen
horizontalen Gentransfer gewonnen wurden, im Vergleich zu Stämmen ohne Plasmide
führen [187].
Die Auswahl der Stämme beruhte auf den Ergebnissen, die von Gupta und Mathews (2010) [188] beschrieben wurden. Basierend auf einem phylogenetischen Baum,
der aus den Sequenzen von 44 konservierten Proteinen erstellt wurde, war es das Ziel,
möglichst Stämme auszuwählen, die die Vielfalt der Cyanobakterien repräsentativ widerspiegeln. Ein Überblick über die Eigenschaften der ausgewählten Stämme ist in
Tabelle 3.1 gegeben.
65
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
Tabelle 3.1.: Eine Zusammenfassung der Eigenschaften der 16 untersuchten Cyanobakterienstämme.
Aufgeführt ist die spezifische Abkürzung des Stammes, der RuBisCO-Typ [162], die Genomgröße in Mb,
der G+C Gehalt, die Anzahl annotierter Gene, der prozentuale Anteil kodierender DNA gemäß der IMGDatenbank [189], die Fähigkeit der Stickstofffixierung, das Habitat und die vorherrschende Zellform. In
der Kategorie des Habitats steht (M) für einen marinen Stamm, (S) für einen Süßwasserstamm und
(T) für einen thermophilen Stamm. Bei der Zellform wird zwischen Einzelzellen (S) und filamentösen,
mehrzelligen Zellformen (F) unterschieden. Die Unterteilung der Sektion des Stamms erfolgte gemäß
Rippka et al. (1979) [190] (Tabelle aus Beck et al. (2012) [130]).
Abkürz.
Acaryochloris
marina MBIC11017
Cyanothece sp.
ATCC 51142
Cyanothece
sp. PCC 8801
Gloeobacter
violaceus PCC 7421
Microcystis
aeruginosa NIES-843
Nostoc sp.
PCC 7120
Prochlorococcus
marinus MED4
Prochlorococcus
marinus MIT 9211
Prochlorococcus
marinus MIT 9215
Synechococcus sp.
JA-2-3B’a(2-13)
Synechococcus sp.
PCC 7002
Synechococcus sp.
WH7803
Synechococcus
elongatus PCC 7942
Synechocystis sp.
PCC 6803
Thermosynechococcus
elongatus BP-1
Trichodesmium
erythraeum IMS101
GenomDNA
N2 ZellTyp größe (Mb) G+C Gene kod. (%) Fix. Habitat form Sektion
Aca11017
β
8,36
46,96 8488
83,26
-
M
S
I
Cyn51142
β
5,46
37,94 5354
86,80
•
M
S
I
Cyn8801
β
4,79
39,76 4615
84,85
•
S
S
I
Glo7421
β
4,66
62,00 4490
89,36
-
S
S
I
Mic843
β
5,84
42,33 6360
81,43
-
S
S
I
Nos7120
β
7,21
41,27 6222
82,50
•
S
F
IV
ProMED4
α
1,66
30,80 1766
88,42
-
M
S
I
Pro9211
α
1,69
38,01 1901
90,12
-
M
S
I
Pro9215
α
1,74
31,15 2059
89,62
-
M
S
I
SycJA23
β
3,05
58,45 2947
85,48
•
S/T
S
I
Syc7002
β
3,41
49,19 3237
87,64
-
M
S
I
Syc7803
α
2,37
60,24 2591
93,39
-
M
S
I
Syc7942
β
2,80
55,43 2719
89,21
-
S
S
I
Syn6803
β
3,57
47,37 3628
86,74
-
S
S
I
ThermoBP1
β
2,59
53,92 2555
89,99
-
S/T
S
I
Trich101
β
7,75
34,14 5156
60,11
•
M
S
III
3.1.2. Cluster von vermutlich orthologen Genen (CLOG)
Um die genetische Diversität zu untersuchen, wurden Cluster von vermutlich orthologen Genen (Cluster of Likely Ortholog Genes) (CLOG) bestimmt, indem alle identifizierten Proteinsequenzen aller 16 cyanobakteriellen Stämme paarweise, „jede gegen
jede“ verglichen wurden. Um für jede mögliche Kombination der Spezies A und B die
orthologen Gene zu identifizieren, wurde eine Methode angewendet, die ähnlich der
KEGG-Datenbank ist beziehungsweise des automatisierten Annotationsservers von
KEGG [191]. Die Analyse beschränkte sich nur auf die Chromosomen der cyanobakteriellen Genome. Ihre Plasmide wurde nicht berücksichtigt.
66
3.1. Material und Methoden
Zwei Proteinsequenzen wurden als vermutliche Orthologe betrachtet, wenn beim
reziproken Vergleich die bidirektionale Trefferrate (Bidirectional Hit Rate) (BHR) größer war als ein gegebener Schwellenwert. Dafür wurden zuerst alle Gene von Spezies
A mit jedem Gen aus Spezies B verglichen und umgekehrt. Für diesen Vergleich wurde der BLASTp –Algorithmus benutzt. Alle Treffer, die einen Bit-Score kleiner als 50
Bits aufwiesen, wurden nicht weiter berücksichtigt. Anschließend wurde mithilfe des
Bit-Scores eine BHR wie folgt berechnet:
BHR = (
Sa,b
Sb,a
),
) × ( bestB
bestA
Sa
Sb
wobei Sa,b der BLASTp-Score von a gegen b ist und SbbestA der beste Score von b gegen
irgendein Gen in A ist (welches nicht a sein muss).
Der Wert der BHR ist für zwei Gene gleich Eins, wenn sie sich gegenseitig den besten Treffer in beide Richtungen liefern, andernfalls ist er niedriger. Überdies wurden
auch für die Gene, die auf demselben Genom lokalisiert sind, die BHR errechnet. Um
aber genomübergreifende orthologe Gene im weiteren Verlauf zu begünstigen, wurde für die Analyse die BHR von Genen, die auf demselben Genom liegen, auf einen
Wert von 0,95 beschränkt, auch wenn der errechnete Wert höher liegen konnte. Alle
Genpaare mit einer BHR größer oder gleich 0,95 wurden als mutmaßliche Orthologe
klassifiziert.
In einem zweiten Schritt wurden die Genpaare in vorläufige Cluster gruppiert, indem alle Gene, die als vermutliche Orthologe identifiziert wurden, zusammengefasst
wurden. Um Cluster zu vermeiden, in denen zwei Gene eine niedrige BHR aufweisen,
aber trotzdem eine schwache Verbindung durch ein drittes Gen besitzen, wurden alle
Gene in diesem vorläufigen Cluster mithilfe der UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) und einer minimalen BHR von 0,75 erneut gruppiert [192].
Dies wurde erreicht, indem die engsten Gene, also die mit der höchsten BHR, zuerst
gruppiert wurden und anschließend die BHRs zu allen anderen Einträgen des Clusters berechnet wurden:
BHR X,C =
| A| × BHR A,C + | B| × BHR B,C
,
| A| + | B|
wobei X die neue Einheit bestehend aus A und B ist, | A| die Größe von A und BHR X,C
die BHR von zwei Einträgen, bis alle Paare von Einheiten eine BHR größer oder gleich
0,75 besitzen. Bei diesem Verfahren wurde jedes Gen nur einem einzigen Cluster zugeordnet.
Der Ansatz der Analyse basiert auf schon früher publizierten Untersuchungen, die
das Ziel hatten, CLOGs in mehrere Genomsequenzen zu identifizieren [193–200]. Jedoch wurden in der Analyse in dieser Arbeit eher strengere Kriterien festgesetzt, um
die Aufnahme von falschen, nicht orthologen Genpaaren zu vermeiden (falsche Positive). Dies hat aber zur Folge, dass die Anzahl an echten potenziellen orthologen Genen
unterschätzt wird. Diese Analyse wurde von Christan Beck durchgeführt.
67
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
3.1.3. Anreicherung der GO-Annotation
Um funktionale Unterschiede zwischen Kern- und einzigartigen CLOGs zu untersuchen, wurde jedem CLOG die jeweilige Funktionsannotation für jedes Gen in dem
CLOG aus der GO-Datenbank (Gene Onthology) [201, 202] (Stand: Januar 2011) zugewiesen. Für die Analyse bezüglich welche GO-Einteilungen vermehrt auftreten, wurde
die TopGO-Software verwendet [203], welche Teil des Bioconductor R-Paketes (http://
www.bioconductor.org) ist. Hierfür wurde der Eltern-Kind-Algorithmus [204] mit Standardparametern und exaktem Fisher-Test gewählt. Für die Berechnung der p-Werte
wurden nur CLOGs mit einer zugeordneten GO-Einteilung berücksichtigt. Diese Analyse wurde von Christan Beck durchgeführt.
3.1.4. Phylogenetische Analyse
Die phylogenetischen Bäume, die in dieser Arbeit gezeigt werden, wurden mit dem
PHYLIP-Paket von Felsenstein [205] (PHYLogeny Inference Package Version 3.69) erstellt. Für den 16S RNA Vergleich (Abbildung 3.4 A), wurde ein Baum im NewickFormat unter Nutzung der Ribosomal Database Project-Webseite (http://rdp.cme.msu.
edu/) [206] konstruiert. Anschließend wurde der Baum mit der DRAWGRAM-Funktion
aus dem PHYLIP-Paket gezeichnet.
Für den Baum der gemeinsamen Cluster (Abbildung 3.4 B) wurde zuerst eine Ähnlichkeitsmatrix für alle Stämme erstellt, wobei die Ähnlichkeit zwischen zwei Stämmen durch die Anzahl der gemeinsamen Cluster geteilt durch die Gesamtanzahl der
Cluster, in denen mindestens einer der beiden Stämme gelistet ist, definiert ist. Die
Kern-Cluster, welche für alle Stämme gleich sind und die einzigartigen Clustern wurden für die Ähnlichkeitsmatrix nicht berücksichtigt. Letzteres diente auch dazu, eine Verzerrung der Ergebnisse zu minimieren. Aus der Ähnlichkeitsmatrix wurde anschließend eine Distanzmatrix berechnet, indem jeder Eintrag vom maximalen Eintrag subtrahiert wurde. Diese Distanzmatrix wurde abschließend in einen Baum mittels NEIGHBOR-Funktion aus dem PHYLIP-Paket umgewandelt und mit der
DRAWGRAM-Funktion gezeichnet. Für beide Bäume wurde Aca11017 als Außengruppe verwendet. Diese Analyse wurde von Christan Beck durchgeführt.
3.1.5. Zuweisung von metabolischen Funktionen zu den CLOGs
Um den zuvor berechneten CLOGs eine Stoffwechselfunktion zuzuweisen, wurden die
in den CLOGs vorkommenden Genen mit der KEGG-Datenbank (Stand: 19. Oktober
2010) [51] abgeglichen. CLOGs mit mindestens einem Gen, welches mit einer enzymatischen Funktion in der KEGG-Datenbank assoziiert ist, wurden mit der jeweiligen
EC-Nummer gekennzeichnet. Für den Fall, dass ein CLOG mehrere Gene mit unterschiedlichen EC-Nummern beinhaltet, wurde der CLOG mit mehreren EC-Nummern
versehen. Nicht berücksichtigt wurden dabei EC-Nummern, die nur eine unvollständige Variante einer anderen EC-Nummer sind (zum Beispiel 3.7.-.- von 3.7.4.21). Folglich muss die Gesamtanzahl der unterschiedlichen EC-Nummern nicht genau der Anzahl der metabolischen CLOGs entsprechen. Bei Enzym-Komplexen, die aus mehre-
68
3.1. Material und Methoden
ren Untereinheiten bestehen, welche durch mehrere einzelne Gene kodiert sind und
die deshalb zu verschiedenen CLOGs zugeordnet sind, wurde jeder zu dem Enzym
gehörige CLOG mit der EC-Nummer des entsprechenden Enzyms gekennzeichnet.
Im Kontext dieser Analyse ist darauf hinzuweisen, dass EC-Nummern nicht nur
streng zu metabolischen Enzymen zugewiesen sind, sondern auch Enzyme umfassen,
die eine allgemeine enzymatische Aktivität besitzen, wie zum Beispiel DNA- und RNAPolymerasen oder Proteinkinasen.
69
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
3.2. Ergebnisse und Diskussion
3.2.1. Genomanalyse und Cluster von vermutlich orthologen Genen
number of CLOGs
Ausgangspunkt der Analyse waren die Genomsequenzen von 16 ausgewählten Cyanobakterien, die in der GenBank-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)
verfügbar sind. Die gewählten 16 Stämme sind nicht auf ein einziges Genus der Cyanobakterien beschränkt, sondern wurden in der Weise ausgewählt, dass sie die genomische und metabolische Diversität reflektieren, die unter dem Phylum der Cyanobakterien zu finden ist. Dementsprechend wurden acht marine und acht Süßwasserstämme
selektiert. Zu den 16 ausgewählten Cyanobakterienstämmen gehören die Modellorganismen Synechocystis sp. PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 7942 und Cyanothece ATCC 51142, mehrere stickstofffixierende (diazotrophe) Cyanobakterien sowie zwei
thermophile Cyanobakterien, die ursprünglich aus der Umgebung von heißen Quellen
isoliert wurden. Details zur Auswahl der Stämme sind in Kapitel 3.1.1 beschrieben
und eine Zusammenfassung der Eigenschaften und Charakteristiken der einzelnen
ausgewählten Stämme sind in Tabelle 3.1 dargestellt.
Der benutzte Algorithmus erkannte 21.238 unterschiedliche Cluster von vermutlich orthologen Genen (Cluster of Likely Ortholog Genes), verteilt über alle 16 Stämme.
Abbildung 3.1 zeigt ein Histogramm der Anzahl zugewiesener Gene pro CLOG. Die
Mehrzahl der Cluster (fast 60 %) enthält nur ein einziges Gen, während nur eine kleine Anzahl von Clustern mehr als 30 oder 40 Gene besitzt. Es fällt auf, dass CLOGs
mit genau 16 Genen überrepräsentiert sind (siehe Abbildung 3.1, durch eine vertikale Linie markiert). Insgesamt unterscheidet sich die Verteilung leicht von den Ergebnissen, die in der COG-Datenbank (Clusters of Orthologous Groups) bereitgestellt
werden [200, 207]. In dieser werden nur
zwei Cyanobakterienstämme aufgeführt
(Synechocystis sp. PCC 6803 und Nostoc
4
10
sp. PCC 7120). Betrachtet man diese beiden, neigen Cluster von orthologen Genen in der Datenbank dazu, auch aus
2
10
mehreren Genen zu bestehen, die meist
aus dem gleichen Stamm kommen.
Um einen Einblick in die Struktur
der
genomischen Diversität unter den
0
10 0
1
2
Cyanobakterien zu erhalten, wurde je10
10
10
number of genes per CLOG
der CLOG einem Cyanobakterienstamm
Abbildung 3.1.: Anzahl der Gene pro CLOG. Die Mehr- zugewiesen, wenn ein oder mehrere Gezahl der CLOGs beinhaltet ein einziges Gen. CLOGs ne des CLOGs im jeweiligen cyanobakmit 16 Genen, hervorgehoben durch eine vertikale Literiellen Genom zu finden waren: Abnie, sind überrepräsentiert. Nur sehr wenige Cluster bestehen aus mehr als 16 Genen und nahezu kein Clus- bildung 3.2 A zeigt ein Histogramm
ter beinhaltet mehr als 32 Gene (Abbildung aus Beck der Anzahl von CLOGs als Funktion
et al. (2012) [130]).
der Anzahl der dazu assoziierten Stämme. Man kann zwischen Kern-Genen
70
3.2. Ergebnisse und Diskussion
(660 CLOGs), welche allen 16 Stämmen zugeordnet sind, gemeinsamen Genen (6668
CLOGs), die in mehr als einem Stamm vorhanden sind, aber nicht in allen, und einzigartigen Genen (13.910 CLOGs), die keine vermutlich orthologen Gene in einer der
anderen 15 Genomsequenzen besitzen, unterscheiden.
Ac
a1
10
M 17
N ic84
os 3
C 71
yn 2
5 0
C 114
yn 2
8
G 80
lo 1
7
Tr 42
ic 1
Sy h10
n 1
Sy 680
c 3
Sy 700
cJ 2
Sy A2
c 3
S 79
Th yc 42
er 78
m 03
o
Pr BP
o 1
Pr 92
oM 15
Pr ED
o9 4
21
1
number of CLOGs
number of CLOGs
In Abbildung 3.2 B sind die Anzahl der CLOGs, die jeweils jedem Stamm zugeordnet wurden, dargestellt. Dabei sind die Anteile von Kern-, gemeinsamen und einzigartigen CLOGs eingezeichnet. Es ist zu erkennen, dass die Mehrzahl der orthologen
Cluster nur mit einem einzelnen Genom assoziiert ist. Sie repräsentieren einzigartige Gene ohne vermutliche Orthologe in irgendeinem anderen der 15 Stämme. Zudem
kann man feststellen, dass die Anzahl der CLOGs, welche zwei oder mehr Genome gemeinsam haben, dann schnell abfällt. Hierbei muss beachtet werden, dass die Anzahl
der CLOGs in Abbildung 3.2 A logarithmisch skaliert ist. Nichtsdestotrotz ist eine
wesentliche Anzahl von CLOGs (660
CLOGs) dem Kern-Genom zugewiesen.
A
Die Anzahl der Kern-CLOGs stimmt
4
10
ziemlich genau mit den Ergebnissen aus
Mulkidjanian et al. (2006) [198] überein.
3
10
Insbesondere wenn man Synechocystis
als Referenz verwendet, findet man, dass
2
10
fast alle Gene (> 90 %), welche in
1
der Analyse einem Kern-CLOG zugewie10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
sen wurden, ebenfalls im cyanobakterinumber of assigned strains
ellen Kern-Cluster von Mulkidjanian et
B
al. (2006) [198] zu finden sind. Auch
core
6000
shared
mit Ergebnissen aus mehreren früheren
unique
Studien über andere bakterielle Spezies
4000
sind die Resultate der Analyse qualitativ gut zu vereinbaren. Zum Beispiel ha2000
ben Hogg et al. (2007) [195] eine ähnli0
che Verteilung für 12 sequenzierte Stämme von Haemophilus influenzae beobachtet. Untersucht man das Konzept des
Pan-Genoms im größeren taxonomischen Abbildung 3.2.: Verteilung der CLOGs innerhalb der
Maßstab, so berichten Lapierre und Go- 16 untersuchten Cyanobakterienstämme. A) Ein Higarten (2009) [208] von einem gemeinsa- stogramm der Anzahl der CLOGs, die einer bestimmten Anzahl von Stämmen zugewiesen wurden. Zu
men Kern-Genom, welches ca. 250 Gene
erkennen ist die Anzahl der Kern-CLOGs (660, die
aus mehr als 500 sequenzierten bakteri- bei allen 16 Stämmen vorhanden sind), der geteilten
ellen Genomen beinhaltet. In beiden Fäl- CLOGs (6668, bei 2-15 Stämmen) und der einzigarlen wurde, genau wie die Ergebnisse in tigen CLOGs (13910, nur in einem einzigen Stamm
Abbildung 3.2 zeigen, eine U-förmige Ver- auftretend). B) Anzahl der CLOGs pro Cyanobakterienstamm. Hierbei sind die Anteile der Kern-, gemeinsateilung beobachtet, so dass die einzigar- men und einzigartigen CLOGs farblich hervorgehoben
tigen und die Kern-Gene überrepräsen- (Abbildung aus Beck et al. (2012) [130]).
tiert sind.
71
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
3.2.2. Das cyanobakterielle Kern- und Pan-Genom
B
2000
1500
1000
500
0
5
10
15
number of genomes
4
number of total CLOGs (pan genome)
A
number of core CLOGs (core genome)
Vergleichsanalysen auf Genomebene bieten die Möglichkeit, die beobachteten Fakten
und Ergebnisse, die sich explizit für die untersuchten Organismen beziehungsweise
Stämme ergeben, auf eine viel größere Anzahl von Organismen beziehungsweise Stämmen, die in der Vergleichsanalyse nicht berücksichtigt wurden, zu extrapolieren. Dies
hat zur Folge, dass sich in den letzten Jahren die Pan-Genomanalyse als neuartiger
Ansatz, um die Größe des Genrepertoires unterschiedlicher Spezies abzuschätzen, entwickelt hat [209]. Übereinstimmend haben mehrere neuere Studien festgestellt, dass
für gewöhnlich die Anzahl der Gene, welche für eine bakterielle Spezies verfügbar
sind, um mehrere Größenordnungen größer ist als die Anzahl von Genen im Genom
eines einzelnen Organismus. Diese Erkenntnisse haben eine direkte Auswirkung auf
die Genomsequenzierung von Organismen, da nun die Möglichkeit besteht, bei jeder
Sequenzierung eine Vorhersage über die Anzahl der vermutlich neu identifizierten
Gene eines neuen Organismus zu treffen. In Abbildung 3.3 ist eine Schätzung der
Größe des cyanobakteriellen Kern- und des Pan-Genoms durch die analysierten 16
Cyanobakterien-Stämme dargestellt.
Das gesamte Pan-Genom aller 16 Stämme umfasst mehr als 2·104 orthologe Cluster und eine Erhöhung der Anzahl der analysierten Genome zeigt keine wesentliche
Abflachung der Kurve (siehe Abbildung 3.3 B). Es ist zu erkennen, dass mit jedem
neu aufgenommenen Genom das Pan-Genom um mehr als 500 neue orthologe Cluster
erweitert wird. Somit kann erwartet werden, dass durch die Sequenzierung von weiteren cyanobakteriellen Stämmen eine große Anzahl von neuen, noch unbekannten
Genen zu erwarten ist.
2.5
x 10
2
1.5
1
0.5
0
0
5
10
15
number of genomes
Abbildung 3.3.: Schätzung der Größe des cyanobakteriellen Kern-(A) und Pan-(B) Genoms. Um einen
Einfluss der Stammreihenfolge zu verhindern, wurden die 16 Cyanobakterienstämme in zufälliger Reihenfolge hinzugefügt. Bei jedem Schritt wurde die Anzahl der Kern-CLOGs und der Pan-CLOGs (die
Gesamtheit aller CLOGs) neu berechnet. Dieser Vorgang wurde über 1.000 Mal wiederholt. Gezeigt ist
der Durchschnittswert dieser Wiederholungen. Die Fehlerbalken entsprechen den Quantilen von 0,1 und
0,9 bei 1.000 Wiederholungen (Abbildung aus Beck et al. (2012) [130]).
72
3.2. Ergebnisse und Diskussion
Nun ergeben sich natürlich aus den Abbildungen 3.2 und 3.3 zwei Fragen:
• Welchen Umfang hat das gesamte cyanobakterielle Pan-Genom?
• Worin liegt der funktionale und evolutionäre Unterschied zwischen den Kern-,
gemeinsamen und einzigartigen Genen, wenn einer existiert?
Beide Fragen wurden auch schon in der Literatur behandelt, konnten jedoch bis heute
nicht mit Sicherheit geklärt werden.
Bezüglich der Größe des bakteriellen Pan-Genoms weichen die derzeitigen Ergebnisse für verschiedene Arten stark voneinander ab. Hogg et al. (2007) [195], berichten
über einen endlichen Umfang des Pan-Genoms für Haemophilus influenzae, extrapoliert aus 12 Genomsequenzen, während Ergebnisse für Streptococcus agalactiae auf
ein unendliches Pan-Genom hindeuten [210].
In der Tat könnten diese Resultate die Folge von Unterschieden in der Evolutionsgeschichte und in den Lebensräumen beziehungsweise ökologischen Nischen der verschiedenen Arten sein. Anzumerken ist jedoch, dass erst kürzlich ein grundsätzlicher
Einwand zur mathematischen Extrapolation von Kislyuk et al. [196] eingebracht wurde. Diese argumentieren, dass eine Extrapolation von seltenen Ereignissen, wie das
Auftreten seltener Gene und Genome höchstwahrscheinlich eine Vielzahl von falschen
Einschätzungen liefert. Deshalb wurde in dieser Arbeit keine Schätzung beziehungsweise Aussage für die Größe des gesamten cyanobakteriellen Pan-Genoms getroffen.
Dennoch konnten mehrere neue wichtige Erkenntnisse gewonnen werden:
• Es existiert ein Kern-Genom, welches von diesen 16 Cyanobakterienstämmen
geteilt wird.
• Durch Extrapolation ist es derzeit nicht möglich, die asymptotische Größe des
Kerns-Genoms aller Cyanobakterienstämme abzuschätzen .
• Weiterhin gibt es keinen Hinweis, dass das cyanobakterielle Pan-Genom endlich
beziehungsweise geschlossen ist.
Daher liefern die Ergebnisse aus Abbildung 3.3 einen großen Anreiz für weitere Genomsequenzierungen, selbst von eng verwandten Stämmen.
Ein weiteres Problem betrifft die möglichen funktionellen und evolutionären Unterschiede zwischen den Kern-, gemeinsamen und einzigartigen Genen. Alle neueren
Studien haben gemeinsam, dass die Anzahl der einzigartigen Gene und diejenigen, die
nur eine kleine Anzahl der Genome gemeinsam haben, einen recht großen Anteil des
gesamten Genrepertoires darstellen [211]. Es existiert eine Vielzahl von Hypothesen
bezüglich des Ursprungs einer solchen Verteilung. Zum Beispiel wird oft angenommen,
dass Kern-Gene sich überwiegend den Housekeeping-Genen zuordnen lassen [211].
Andererseits können einzigartige Gene als charakteristisch für verschiedene Umgebungen angenommen werden und die Folge eines intensiven horizontalen Gentransfers sein [212, 213].
73
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
Diese Behauptungen wurden durch den Vergleich der Annotation, die man aus der
Gene Ontology (GO)-Datenbank [201] erhält, getestet. Eine Analyse der GO-Annotation von Kern-CLOGs offenbarte eine signifikante Anreicherung von Genen mit Bezug
auf die Kategorie „Translation“ (p-Wert < 1·10−30 ), „DNA-Reparatur“ (p-Wert < 1·10−4 ),
„Genexpression“ (p-Wert < 1,8·10−7 ), „RNA-Prozessierung und Modifizierung“ (p-Wert
< 1·10−5 ), diverse Transportprozesse (p-Werte < 1·10−4 ) sowie mehreren metabolischen und biosynthetischen Prozessen (p-Werte < 1·10−5 ). Gene, die in den einzigartigen CLOGs zu finden sind, besitzen meist die Annotation von „Abwehrreaktion“
(p-Wert < 1,6·10−5 ) oder „DNA-Integration“ (p-Wert < 8,2·10−5 ) und sind insbesondere
häufig in der Annotation von regulatorischen Prozessen zu finden. Demzufolge implizieren Kern-Gene eine Erhaltung der Hauptfunktionen der Zelle wie Stoffwechsel
und die Genexpression, während die regulatorischen Eigenschaften und Wechselwirkungen eher spezifisch für die Anpassung an diverse Umgebungen sind (einzigartige
Gene).
Es muss darauf hingewiesen werden, dass es eine mögliche Verzerrung gibt, da eine
deutliche Anreicherung von GO-annotierten Genen in den Kern-CLOGs (p < 9·10−210
nach Fisher-Test) existiert, während Gene, die in den einzigartigen CLOGs zu finden
sind, eher keine GO-Annotation besitzen. Diese Unausgewogenheit kann durch die
Tatsache erklärt werden, dass die GO-Annotationen hauptsächlich auf BLAST-Suchen
bei anderen Organismen basieren und einzigartige Gene erwartungsgemäß weniger
positive BLAST-Treffer besitzen. Ferner könnte sich auch ein großer Anteil der einzigartigen Gene aus Falschannotation beziehungsweise Annotations-Fehlern ergeben
haben oder es sind nicht funktionale Gene, die aufgrund des fortlaufenden Prozesses
der Genomreduktion auftreten [211].
3.2.3. Phylogenetische Übereinstimmungen zwischen den 16
Cyanobakterienstämmen
Um die cyanobakteriellen Spezies zu vergleichen und deren Beziehungen untereinander zu entschlüsseln, sind in Abbildung 3.4 zwei phylogenetische Bäume gezeigt. Ein
konventioneller Stammbaum, basierend auf der 16S rRNA , berechnet und gezeichnet
mit dem PHYLIP-Paket von Felsenstein [205] (Abbildung 3.4 A) und dazu im Vergleich
ein phylogenetischer Baum, berechnet aus den Ergebnissen des vorher beschriebenen
Genvergleichs.
Für die Schätzung der Ähnlichkeit von den Spezies untereinander auf Grundlage
der CLOGs stehen mehrere Optionen zur Verfügung. Bei dieser Analyse wurde ein einfaches Maß, basierend auf der Anzahl von CLOGs, die zwei Stämme gemeinsam haben,
geteilt durch die Gesamtzahl der CLOGs, die beiden Stämmen zusammen zugeordnet
sind, zugrunde gelegt. Der daraus errechnete Distanzbaum ist in Abbildung 3.4 B
gezeigt. Beide Bäume weisen ein hohes Maß an Ähnlichkeit auf, mit nur wenigen topologischen Unterschieden.
In beiden Fällen bilden die Prochlorococcus-Stämme die am engsten verwandte
Gruppe. Hierbei ist anzumerken, dass phylogenetische Bäume einzelner Genfamilien,
in denen ein höherer Grad der phylogenetischen Verschiedenheit erwartet wird [214],
74
3.2. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 3.4.: Phylogenetische Analyse der 16 untersuchten Cyanobakterienstämme. A) Phylogenetischer Baum basierend auf einem Vergleich auf Ebene der 16S rRNA. B) Phylogenetischer Baum basierend auf der Anzahl der gemeinsamen CLOGs, die von zwei Stämmen geteilt werden (Abbildung aus
Beck et al. (2012) [130]).
bei dieser Analyse nicht betrachtet werden. Ebenso ist jede Schätzung der Distanz
auf Basis der gemeinsamen CLOGs durch die unterschiedliche Genomgröße voraussichtlich fehlerbehaftet, was wiederum die evolutionäre Distanz, bestimmt durch 16SrRNA-Analyse, widerspiegelt.
In Tabelle 3.2 ist ein paarweiser Vergleich der gemeinsamen CLOGs zwischen allen 16 Cyanobakterienstämmen zu sehen. Auch diese Tabelle bestätigt erneut die enge
Verbindung der drei Prochlorococcus-Stämme und Syc7803 in Bezug auf die gemeinsamen Gene.
75
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
Cyn51142
2023
2721
Cyn8801
1952
1537
1561
Glo7421
1574
1546
2301
2285
Mic843
1841
2216
1741
2265
2379
Nos7120
2167
989
988
868
983
988
ProMED4
1016
1334
1000
1000
892
1004
1008
Pro9211
1018
1309
1616
974
963
853
970
979
Pro9215
997
888
908
904
1596
1450
1333
1474
1481
SycJA23
1454
1380
962
983
973
1911
1788
1334
1871
1903
Syc7002
1736
1169
1055
1285
1340
1277
1228
1186
1037
1208
1238
Syc7803
1228
1265
1547
1345
998
1040
1022
1671
1626
1278
1622
1625
Syc7942
1602
1581
1169
1812
1379
961
986
972
1906
1951
1385
2043
2049
Syn6803
1726
1490
1441
1109
1459
1364
910
944
924
1614
1517
1269
1537
1557
ThermoBP1
1572
1450
1644
1491
1182
1635
1418
964
992
974
2079
1863
1378
1916
1980
Trich101
1765
Tabelle 3.2.: Tabelle der geteilten CLOGs. Jeder Eintrag enthält die Anzahl der CLOGs, die von zwei Stämmen geteilt werden. Die unterste Zeile zeigt
jeweils die gesamte Anzahl der CLOGs eines Stammes (Tabelle aus Beck et al. (2012) [130]).
Aca11017
5592
Cyn51142
4465
Cyn8801
4048
Glo7421
4032
Mic843
5247
Nos7120
4920
ProMED4
1922
Pro9211
1825
Pro9215
1951
SycJA23
2725
Syc7002
2771
Syc7803
2467
Syc7942
2561
Syn6803
3024
Trich101
4004
ThermoBP1
2340
76
3.2. Ergebnisse und Diskussion
3.2.4. Das metabolische Netzwerk der Cyanobakterien ist stark konserviert
400
200
10
M 17
i
N c84
o
3
C s71
yn 2
51 0
C 14
yn 2
8
G 80
lo 1
7
Tr 42
ic 1
Sy h10
n6 1
Sy 80
c7 3
Sy 00
cJ 2
Sy A2
c7 3
S 94
Th yc7 2
er 80
m 3
o
Pr BP
o 1
Pr 92
oM 15
Pr ED
o9 4
21
1
0
Ac
a1
Abbildung 3.5 zeigt die Verteilung der
metabolischen CLOGs über die einzigartigen, gemeinsamen und Kern-Gene
der einzelnen cyanobakteriellen Genome.
Die CLOGs mit einer metabolischen
Funktion sind stark überrepräsentiert in
den CLOGs, die alle 16 cyanobakteriellen
Stämme gemeinsam haben. Rund 55 %
aller Kern-CLOGs sind mit einer metabolischen Funktion assoziiert. Offenbar
stellt der zelluläre Stoffwechsel, hier definiert als Gene mit einer metabolischen
Funktion, einen großen Anteil des KernGenoms dar.
number of CLOGs
number of CLOGs
Natürlich liegt neben der Pan-Genomanalyse auch ein großes Interesse auf der Struktur und der Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels. Um die CLOGs zu identifizieren, die mit einer metabolischen Funktion assoziiert sind, wurden die EnzymCommison (EC)-Nummern, die für jedes einzelne Gen in der KEGG-Datenbank verfügbar waren, benutzt. Dabei wurde ein CLOG als metabolisch klassifiziert, wenn zu
der jeweiligen Gruppe von orthologen Genen eine oder mehrere EC-Nummern mit
einer spezifischen enzymatischen Aktivität zugeordnet werden konnten. Hierbei ist
anzumerken, dass die hierarchische Systematik der EC-Nummern bei der Zuordnung
sowohl breitere enzymatische Kategorien als auch eine begrenzte Anzahl von nicht
metabolischen Enzymen umfasst. Bei der Anwendung dieser Kriterien auf die CLOGs
aus dem Kapitel 3.2.1 ist auszumachen, dass von diesen 21.238 CLOGs, 1.851 als metabolische CLOGs betrachtet werden können. Zudem kann man feststellen, dass aufgrund von bifunktionalen Enzymen oder widersprüchlicher oder fehlerhafter Annotation, den CLOGs auch mehrere metabolische Funktionen zugeordnet werden könA
nen. Bei der Analyse in dieser Arbeit war
CLOGs with EC number
4
CLOGs without EC number
10
dies bei nur 66 CLOGs (von den 1.851 me3
tabolischen CLOGs) der Fall, bei denen
10
einem CLOG mehr als eine EC-Nummer
2
10
zugeordnet wurde. Somit ist zu erkennen, dass eine widersprüchliche oder feh1
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
lerhafte Annotation die Ergebnisse der
number of assigned strains
Analyse, auch ohne eine vorhergehende
B
Filterung oder manuelle Kuration, nicht
core
1000
shared
wesentlich einschränken. Insgesamt wurunique
800
den 759 verschiedene EC-Nummern den
600
Clustern zugewiesen.
Abbildung 3.5.: Verteilung von metabolischen CLOGs
innerhalb der cyanobakteriellen Genome. A) Ein Histogramm der Anzahl der CLOGs, die einer bestimmten Anzahl von Stämmen zugewiesen wurden (logarithmisch skaliert). Der Anteil an CLOGs mit einer metabolischen Funktion ist hierbei farblich hervorgehoben. Unter den Kern-CLOGs ist dieser Anteil besonders hoch.
B) Ein Säulendiagramm der Anzahl der CLOGs mit einer metabolischen Funktion für jeden einzelnen Stamm
mit Unterscheidung der CLOG-Kategorie (Abbildung
aus Beck et al. (2012) [130]).
77
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
In Abbildung 3.6 sind die prozentualen
Werte der CLOGs, denen eine enCLOGs with EC number
6000
CLOGs without EC number
zymatische Funktion zugewiesen wur4000
de, von allen 16 Stämmen gezeigt. Ausgehend von etwa 500 metabolischen
2000
CLOGs des Kern-Genoms steigt die An0
zahl der enzymatischen CLOGs linear
mit der Anzahl der gesamten CLOGs,
B
die jedem einzelnen Stamm zugeordnet
1000
werden, an. Allerdings ist die Korrela800
tion zwischen der Anzahl der enzymati600
schen CLOGs und der Gesamtanzahl der
400
200
CLOGs eher schwach und stark beein0
flusst durch die relativ hohe Anzahl von
0
1000
2000
3000
4000
number of CLOGs without assigned EC number
enzymatischen Kern-CLOGs.
Eine weitere Analyse, ob bestimmAbbildung 3.6.: Vergleich von metabolischen und
te Stoffwechselwege oder Enzymklasnicht metabolischen CLOGs. A) Ein Säulendiagramm
der Anzahl der CLOGs pro Stamm, die mit einer sen spezifisch verteilt sind, ergab keiEC-Nummer assoziiert sind beziehungsweise nicht as- nen offensichtlichen Unterschied zwisoziiert sind. B) Anzahl der CLOGs mit einer EC- schen einzigartigen und Kern-Genen.
Nummer im Vergleich zu CLOGs ohne EC-Nummer.
Das heißt, in keiner der beiden Klassen
Jeder Punkt entspricht einem der 16 cyanobakteriellen Genome. Die rote Linie entspricht einer Regres- ist eine besondere Enzym-Kategorie oder
sionsgeraden (Methode der kleinsten Quadrate) um ein Stoffwechselweg stark überrepräsendie Tendenz der Daten hervorzuheben. Es herrscht ei- tiert. Trotzdem konnte eine gewisse Anne schwache Korrelation zwischen der Größe (der Ge- zahl an Kern-Stoffwechselwegen identisamtanzahl der CLOGs) und der Anzahl der metabolifiziert werden, die in allen 16 Cyanoschen CLOGs eines Stamms (Abbildung aus Beck et
bakterienstämmen vorhanden sind. Unal. (2012) [130]).
ter den hochkonservierten Stoffwechselwegen sind der Calvin-Benson-Zyklus, der oxidative Pentosephosphatweg, die Synthesewege von Nukleotiden und Aminosäuren zu finden. Auf letztere bezogen sind jedoch
eine Reihe von Phosphatasen und Transaminasen in mehreren Cyanobakterienstämmen nicht annotiert.
number of EC CLOGs
Ac
a1
10
M 17
ic
N 843
os
C 712
yn
51 0
C 142
yn
8
G 801
lo
74
Tr 21
ic
h
Sy 10
n6 1
Sy 803
c7
Sy 002
cJ
Sy A23
c7
S 942
Th yc7
er 80
m 3
oB
Pr P1
o9
Pr 21
oM 5
E
Pr D4
o9
21
1
number of CLOGs
A
3.2.5. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
Schaut man sich bestimmte Enzyme beziehungsweise das metabolische Potenzial, welches unter diesen 16 Cyanobakterienstämmen verteilt ist, genau an, erhält man ein
vielschichtiges und facettenreiches Bild. Zuerst wurde für diese Analyse die Anzahl
der CLOGs auf gemeinsame CLOGs mit einer EC-Nummer beschränkt. Von den insgesamt 759 verschiedenen EC-Nummern aller Cluster, sind eine Teilmenge von 378
EC-Nummern mehr als einem, aber weniger als 16 Stämmen zugeordnet (gemeinsame CLOGs).
Abbildung 3.7 bietet eine geclusterte Heatmap der Zuordnung zu den einzelnen
Stämmen dieser 378 gemeinsamen EC-Nummern. Hierfür wurden die EC-Nummern
78
3.2. Ergebnisse und Diskussion
unter Verwendung der MATLAB-Funktion Clustergram (mit Hamming-Distanz als
Abstandsmaß) geclustert. Bei genauerer Betrachtung kann man zwischen vier Kategorien unterscheiden:
• Cluster A: gemeinsame EC-Nummern, die überwiegend in den ProchlorococcusStämmen mit Pro9215, ProMED4, Pro9211 und Syc7803 annotiert sind
• Cluster B: gemeinsame EC-Nummern, die nur für wenige Stämme annotiert sind
• Cluster C: gemeinsame EC-Nummern, die für eine große Anzahl an Stämmen
annotiert sind
• Cluster D: gemeinsame EC-Nummern, die für fast alle Stämme annotiert sind,
mit Ausnahme der drei Prochlorococcus-Stämmen und Syc7803
Es ist festzustellen, dass Abbildung 3.7 erneut die Ähnlichkeit zwischen den drei
Prochlorococcus-Stämmen und Syc7803 hervorhebt, welche bereits in Abbildung 3.4
und Tabelle 3.2 zu erkennen ist.
Beim genaueren Betrachten der einzelnen Zuordnungen werden die Unterschiede
zwischen diesen vier Gruppen noch ersichtlicher. Es wird deutlich, dass die beiden Enzyme Malat:Chinon-Oxidoreduktase (EC 1.1.5.4) (MQO), die im TCA-Zyklus involviert
ist und die Cystathionin-γ-Synthase (EC 2.5.1.48), welche einen essentiellen Schritt
bei der Synthese der Aminosäure L-Methionin katalysiert, exklusiv mit den vier Stämmen ProMED4, Pro9211, Pro9215 und Syc7803 assoziiert sind. Hingegen ist der Syntheseweg von L-Methionin bei den meisten anderen Stämmen noch ungeklärt. Es existieren keine EC-Nummern, die ausschließlich mit den drei Prochlorococcus-Stämmen
Abbildung 3.7.: Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels. Gezeigt ist eine geclusterte Heatmap,
die die Zuweisung der 378 gemeinsamen EC-Nummern zu den einzelnen Stämmen zeigt. Das Clusterschema hat eine hohe Übereinstimmung mit den Ergebnisse aus Abbildung 3.4. Mit Bezug auf die
EC-Nummern kann durch einfaches Betrachten zwischen vier Kategorien unterschieden werden: Cluster
A: EC-Nummern, die überwiegend bei den drei Prochlorococcus-Stämmen und Syc7803 auftreten. Cluster B: EC-Nummern, die nur bei wenigen Stämmen annotiert sind. Cluster C: EC-Nummern, die für eine
große Anzahl an Stämmen annotiert sind. Cluster D: EC-Nummern, die bei fast allen Stämmen auftreten, aber wenig unter den Prochlorococcus-Stämmen und Syc7803 verbreitet sind (Abbildung aus Beck
et al. (2012) [130]).
79
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
assoziiert sind. Umgekehrt enthält Gruppe D eine Reihe von 11 EC-Nummern, welche zu allen Stämmen außer den drei Prochlorococcus-Stämmen ProMED4, Pro9211,
Pro9215 assoziiert sind. Dazu gehören unter anderem die Nitrit- und die NitrateReduktase (EC 1.7.7.1 und EC 1.7.7.2). Dieses deckt sich mit der weit verbreiteten
Annahme, dass Nitrat für die Prochlorococcen nicht verwendbar ist, da keiner der
sequenzierten Laborstämme die entsprechenden Gene für eine Nitratverwertung besitzt [215]. Durch die hohe Verfügbarkeit von metagenomischen Sequenzdaten wurde diese Ansicht allerdings in letzter Zeit widerlegt, da herausgefunden wurde, dass
doch mehrere andere Prochlorococcus-Ökotypen ein Gen für die Nitrat-Reduktase besitzen [216].
Unter den EC-Nummern, die nicht für Syc7803 und die drei Prochlorococcus-Stämmen annotiert sind, treten viele Enzyme des Zentralstoffwechsels auf, wie z.B. das Malatenzym (EC 1.1.1.38) (ME), die Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.94)
und die Fructose-1,6-Bisphosphatase (EC 3.1.3.11) (FBP).
3.2.6. Der Stoffwechsel von unterschiedlichen Speicherstoffen bei
Cyanobakterien
Cyanobakterien zählen bekanntermaßen zu den phototrophen Organismen und verlassen sich demzufolge auf intrazelluläre Verbindungen, die als Speicherstoffe dienen
und die Aufrechterhaltung von zellulären Prozessen während der Abwesenheit von
Licht und vor allem in der Nacht gewährleisten.
Die häufigste Speicherstoffverbindung bei Cyanobakterien ist Glykogen, welches
als verzweigtes Polymer aus Glucose-6-Phosphat synthetisiert wird. Es wird angenommen, dass Glykogen im Laufe des Tages, wenn genügend Licht vorhanden ist,
aufgebaut wird und bei Abwesenheit von Licht wieder mobilisiert wird. Zudem ist der
Glykogenstoffwechsel auch für das Wachstum unter Stickstoffmangelbedingungen von
Bedeutung. Alle 16 Stämme, die in dieser Arbeit untersucht wurden, besitzen die notwendigen Enzyme zur Synthese und Mobilisierung von Glykogen. Insbesondere existiert ein CLOG, welcher für die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (EC 2.7.7.27) (AGP)
annotiert ist, der auch zum Kern-Genom gehört und dementsprechend auch mit allen
16 analysierten Stämmen assoziiert ist. Genauso sind die Enzyme, wie die GlykogenSynthase (EC 2.4.1.21) (GS) und das 1,4-α-Glucan-verzweigende Enzym (Glycogen
Branching Enzyme) (EC 2.4.1.18) (GBE) für alle 16 Cyanobakterien-Stämme annotiert. Jedoch sind für diese beiden Stoffwechselschritte die jeweiligen Enzyme in verschiedene CLOGs aufgeteilt und aus diesem Grund nicht unbedingt als Orthologe für
alle Stämme definiert. Derselbe Sachverhalt gilt auch für die Glykogen-Phosphorylase
(EC 2.4.1.1) (GP), welche für die spätere Mobilisierung von Glykogen verantwortlich
ist. Sie ist für alle 16 Stämme annotiert, allerdings nicht in einem einzigen CLOG. Ein
Überblick über die entsprechenden Gene ist in Tabelle 3.3 zu finden.
Besonders zu erwähnen ist, dass in allen Fällen, in denen ein metabolisches Enzym
mit mehr als einem CLOG assoziiert ist, normalerweise ein „primärer“ CLOG existiert, der mit fast allen Stämme verbunden ist und ein oder eine kleine Anzahl von
„sekundären“ CLOGs, die mit demselben Enzym assoziiert sind. Bei einer genaueren
80
3.2. Ergebnisse und Diskussion
Betrachtung dieser Analyse wird deutlich, dass dies nicht ein Artefakt des ClusteringAlgorithmus ist, sondern auch durch paarweise Vergleiche der jeweiligen Sequenzen
unterstützt wird.
Im Vergleich zu Glykogen sind andere Speicherstoffverbindungen unter den Cyanobakterien weniger verbreitet. Nichtsdestotrotz sind die Enzyme für die CyanophycinSynthese und -Mobilisierung bei vielen Stämmen annotiert. Cyanophycin ist ein Polymer, welches zu gleichen Teilen aus den Aminosäuren L-Aspartat und L-Arginin
gebildet wird. Somit dient es in mehreren Cyanobakterien sowohl als Stickstoff- als
auch als Kohlenstoffquelle. Auch in diesem Fall ist das Enzym für die CyanophycinSynthetase (EC 6.3.2.29/30) (CphA) (siehe Knoop et al. [93]), zu mehreren CLOGs
assoziiert, während das Enzym für die Cyanophycin-Mobilisierung, die Cyanophycinase (EC 3.4.15.6) (CphB), nur für einen einzigen CLOG annotiert ist. Beide Enzyme
sind in der Regel zusammen für einen Stamm annotiert. Das heißt, dass kein Stamm
ein Enzym lediglich für die Synthese oder nur für die Mobilisierung besitzt. Jedoch
existiert mit Syc7803 eine einzige Ausnahme. Für diesen Fall ist es aber sehr wahrscheinlich, dass maßgeblich eine falsche Annotation dafür verantwortlich ist, da es
sich hierbei um einen einzelnen separaten CLOG handelt. Das zugehörige Gen ist als
vermeintliche Cyanophycin-Synthetase in CyanoBase [114] annotiert, jedoch ist die
Ähnlichkeit zu anderen bekannten Genen der Cyanophycin-Synthetase sehr niedrig.
Weniger verbreitet als Cyanophycin ist die Nutzung von Poly-β-Hydroxybutyrat
(PHB) als Speicherstoff für Kohlenstoff. PHB ist ein nicht toxischer, biologisch abbaubarer Polyester mit großer Bedeutung für biotechnologische Anwendungen. Die
Produktion von PHB durch gentechnisch veränderte Cyanobakterien wurde erst vor
Tabelle 3.3.: Zusammenfassung der Gene der 16 Cyanobakterienstämme, die in der Synthese und Mobilisierung von den drei verschiedenen Speicherstoffen Glykogen, Cyanophycin und Poly-β-Hydroxybutyrat
involviert sind. Schwarze Punkte repräsentieren die Anzahl der Gene, die mit einem CLOG, dem eine
spezifische enzymatische Aktivität zugewiesen wurde, assoziiert sind. Jede Spalte entspricht einem unterschiedlichen CLOG, jedoch können mehreren CLOGs die gleiche enzymatische Aktivität zugewiesen
sein (Tabelle aus Beck et al. (2012) [130]).
Glykogen
Aca11017
Cyn51142
Cyn8801
Glo7421
Mic843
Nos7120
ProMed4
Pro9211
Pro9215
SycJA23
Syc7002
Syc7803
Syc7942
Syn6803
ThermoBP1
Trich101
AGP
••
••
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
GS
• •
• •
• •
• • •
• •
• • • • •
• •
• • • •
• • -
GBE
• - • • •
• - •
• • • - • • • - • - • - • - • - • - • - • - • - • - -
•
••
••
••
•
•
•
•
•
•
•
••
••
••
Cyanophycin
GP
•
•
••
•
-
•
•
-
•
-
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
CphA
•
•
- (•)
-
CphB
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Poly-β-Hydroxybutyrat
PhaA
•
•
•
-
PhaB
•
•
-
PhaC
•
•
-
PhaE
•
•
-
81
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
kurzem in der Literatur diskutiert [217]. Von den 16 Cyanobakterienstämmen, die
in dieser Analyse untersuchten wurden, sind nur für Synechocystis und Mic843 die
entsprechenden Enzyme zur Synthese von PHB annotiert. Es ist zu beachten, dass
obwohl der Stamm Aca11017 ebenfalls ein Gen besitzt, welches mit dem CLOG, der
für die Polyhydroxyalkanoat-spezifische β-Ketothiolase/Acetyl-CoA Acetyltransferase
(EC 2.3.1.9) (PhaA) annotiert ist, assoziiert ist, die anderen verbleibenden Schritte
für die PHB-Synthese fehlen. Der Grund hierfür könnte sein, dass das jeweilige Gen
in Aca11017 eine eng verwandte Variante des PhaA-Gens ist, welches jedoch nicht
spezifisch für die PHB-Synthese ist.
3.2.7. Die Diversität des Zentralstoffwechsels unter den Cyanobakterien
Neben den Speicherstoffen sind auch eine Reihe von anderen Enzymen des zentralen
Stoffwechsels in Cyanobakterien von allgemeinem wissenschaftlichen Interesse. In Tabelle 3.4 und 3.5 sind mehrere wichtige Enzyme des zentralen Kohlenstoffmetabolismus der 16 untersuchten Cyanobakterienstämme zusammengefasst. Im Gegensatz
zu Tabelle 3.3 wurde bei diesen Tabellen nicht zwischen den einzelnen CLOGs, welche
die gleiche enzymatische Funktion besitzen, unterschieden. Ähnlich zum Kapitel 3.2.6
existiert in der Regel für jedes Enzym ein primärer CLOG und eine kleine Menge an
sekundären CLOGs.
Bei einer detaillierteren Analyse der jeweiligen metabolischen Funktion ist festzustellen, dass zunächst alle wichtigen Enzyme des Calvin-Benson-Zyklus, welcher die
Fixierung von Kohlenstoffdioxid (CO2 ) ermöglicht, in allen 16 Stämmen annotiert ist
(siehe Tabelle 3.4). Ebenso sind für alle Enzyme des oxidativen Pentosephosphatweges (OPP) CLOGs für jeden der 16 Stämme assoziiert (siehe Tabelle 3.5). Für andere
wichtige Stoffwechselwege ergibt sich jedoch ein differenzierteres Bild. Hier ist die
Fructose-1,6-Bisphosphatase (EC 3.1.3.11) (FBP) zu nennen, die nicht für alle Stämme annotiert ist und in allen α-Cyanobakterien, einschließlich der ProchlorococcusStämme, fehlt. Jedoch zeigten schon die ersten Ergebnissen aus der Rekonstruktion
des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis (Knoop et al. [93, 94]) und deren
Analyse mithilfe der Flussbilanzanalyse (Flux Balance Analysis), dass dieses Enzym
für die Synthese von Biomasse nicht benötigt wird (siehe Kapitel 2.2).
Zum Teil kann auch dessen Funktion durch die bifunktionale Fructose-1,6-Bisphosphatase/ Sedoheptulose-1,7-Bisphosphatase (EC 3.1.3.37) (SBP) ersetzt werden, welche für alle 16 Stämme annotiert ist. Desgleichen ist die Phosphofructokinase (EC
2.7.1.11) (PFK) nicht für alle Stämme annotiert, sondern fehlt bei mehreren Stämmen,
erneut vor allem bei Prochlorococcus. Zu erwähnen sei hier, dass die PFK essentiell
für die Funktion der Glykolyse ist und bei einem Fehlen dieses Enzyms, die Verwendung von Glykogen als Kohlenstoff- und Energiequelle ausschließlich über den OPP
möglich ist. Andere Enzyme der Glykolyse wie die Fructose-1,6-Bisphosphat-Aldolase (EC 4.1.213) (FBPA), Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.12/59)
(GAPDH), Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.1) (PGM), und Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40)
(PYK) sind für alle 16 Stämme vorhanden (siehe Tabelle 3.4). Eine graphische Dar-
82
3.2. Ergebnisse und Diskussion
stellung des zentralen Stoffwechsels mit allen annotierten Stoffwechselwegen ist in
Abbildung 3.8 zu sehen.
Im Unterschied zum Calvin-Benson-Zyklus ist der Pyruvatstoffwechsel, dessen Enzyme in Tabelle 3.5 zusammengefasst wurden, eher lückenhaft konserviert. Während
CLOGs, welche mit der PEP-Carboxylase (EC 4.1.1.31) (PEPC) annotiert sind, bei allen 16 Stämmen vorhanden sind, ist hingegen die Rückreaktion über die PEP-Carboxykinase (EC 4.1.1.49) (PEPK) eher selten und nur für drei Stämme annotiert. Die
PEPC katalysiert die Umwandlung von anaplerotischen PEP zu Oxalacetat und anorganischem Phosphat (Pi ) und ist essentiell für die Regeneration des TCA-Zyklus.
Die Enzyme, die die Umwandlung von Oxalacetat zusammen mit Acetyl-CoA zu
2-Oxogluterat katalysieren, sind bei allen 16 Cyanobakterienstämmen zu finden. Dieser Sachverhalt ist nicht sonderlich verwunderlich, da 2-Oxogluterat ein Ausgangsstoff für die Synthese mehrerer Aminosäuren und Nukleotide ist und zudem als ein
wichtiger Sensor für den Stickstoffhaushalt bei Cyanobakterien fungiert [218].
Jedoch sind die weiterführenden Schritte innerhalb des TCA-Zyklus hochgradig
fragmentiert (siehe Tabelle 3.5 als Überblick). Es existieren keine CLOGs, die mit Genen des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase (OGDH)-Komplexes annotiert sind,
welcher die Umwandlung von 2-Oxogluterat zu Succinyl-CoA katalysiert. Das Fehlen eines OGDH stimmt mit dem schon seit Jahren bekannten Sachverhalt überein,
dass Cyanobakterien keinen herkömmlichen TCA-Zyklus besitzen. Im Allgemeinen
wird dennoch angenommen, dass der TCA-Zyklus bei Cyanobakterien einen zyklischen Fluss besitzen kann, um die Zellrespiration bei Abwesenheit von Licht zu gewährleisten (siehe Kapitel 2.2.9). Innerhalb der Rekonstruktion des metabolischen
Netzwerkes von Synechocystis (siehe Kapitel 2) ist der zyklische Fluss durch den
TCA-Zyklus durch zwei metabolische Nebenwege (Bypass) realisiert, die den fehlenden OGDH-Komplex ersetzen.
Tabelle 3.4.: Eine Zusammenfassung der Enzyme, die im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel auftreten:
Glykolyse und Calvin-Benson-Zyklus. Punkte repräsentieren die Anzahl der Gene, die in den CLOGs mit
der jeweiligen metabolischen Funktion vorkommen. Hierbei wird nicht für einzelne CLOGs mit derselben
enzymatischen Funktion unterschieden, sondern diese zusammen als ein CLOG aufgeführt (Tabelle aus
Beck et al. (2012) [130]).
Glykolyse
Aca11017
Cyn51142
Cyn8801
Glo7421
Mic843
Nos7120
ProMed4
Pro9211
Pro9215
SycJA23
Syc7002
Syc7803
Syc7942
Syn6803
ThermoBP1
Trich101
GPI
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FBP
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SBP
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FBPA
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TPI
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PFK
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GAPDH
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Calvin-Benson-Zyklus
PGM
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ENO
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PYK
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PGK
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RPI
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TKT
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TALDO
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PRK
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RPE
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RuBisCO
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83
3.2. Ergebnisse und Diskussion
Eine Möglichkeit besteht darin, dass der Fluss über die drei Reaktionsschritte der
Glutamat-Decarboxylase (EC 4.1.1.15), γ-Aminobutyrat-Transaminase (EC 2.6.1.19)
und der Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.16) (SSADH) fließen kann.
Die zweite Möglichkeit beruht darauf, dass seit kurzem auch ein alternativer Nebenweg von Zhang und Bryant (2011) [142] identifiziert wurde. Hierbei handelt es
sich um eine neuartige 2-Oxoglutarat-Decarboxylase (EC 4.1.1.71) (2OGDC), die zusammen mit der letztgenannten SSADH, die Konvertierung von 2-Oxoglutarat zu
Succinat ermöglicht und damit den TCA-Zyklus schließt [142] (siehe Kapitel 2.2.9).
Die zugehörigen metabolischen CLOGs für den zweiten Nebenweg werden von allen
Stämmen geteilt außer den drei Prochlorococus-Stämmen sowie Synechococcus und
Syc7803. Die Existenz eines solchen Nebenweges über Succinat-Semialdehyd erklärt
auch, dass die Succinat-Thiokinase (EC 6.2.1.5) (STK), welche sonst ein essentielles
Enzym innerhalb des TCA-Zyklus darstellt, nur für eine kleine Anzahl von Stämmen
annotiert ist. Es wird angenommen, dass in diesen wenigen Fällen die STK dazu dient,
vor allem Succinyl-CoA für die Nutzung als Cofaktor im weiteren Stoffwechsel bereitzustellen.
Interessanterweise fehlt in verschiedenen Cyanobakterienstämmen die SuccinatDehydrogenase (EC 1.3.99.1) (SDH), was die Fähigkeit und Kapazität der zellulären
Respiration über den TCA-Zyklus in diesen Stämmen signifikant beeinträchtigt. Hingegen sind CLOGs, welche mit der Fumarat-Hydratase (EC 4.2.1.2) (FH) assoziiert
sind, in allen 16 Stämmen vorhanden. Jedoch sind die Gene für Syc7002 und Glo7421
nicht als FH annotiert und besitzen keine so hohe Ähnlichkeit mit den Genen wie
andere Stämme untereinander, was darauf schließen lässt, dass es sich vielleicht um
bifunktionale Enzyme handelt oder die Annotation fehlerhaft ist. An den Ergebnissen
aus den FBA (siehe Kapitel 2) ist ersichtlich, dass die FH essentiell für das Recycling
Tabelle 3.5.: Eine Zusammenfassung der Enzyme, die im zentralen Kohlenstoffstoffwechsel beteiligt sind:
Der Pentose-Phosphat-Weg (PPP), der Pyruvat-Stoffwechsel und der TCA-Zyklus. Punkte repräsentieren
die Anzahl der Gene, die in den CLOGs mit der jeweiligen metabolischen Funktion vorkommen. Hierbei
wird nicht für einzelne CLOGs mit derselben enzymatischen Funktion unterschieden, sondern diese zusammen als ein CLOG aufgeführt. Punkte in Klammern entsprechen Gene, die eine andere Annotation
besitzen als der zugehörige CLOG, in dem sie aufgeführt sind (Tabelle aus Beck et al. (2012) [130]).
PPP
Aca11017
Cyn51142
Cyn8801
Glo7421
Mic843
Nos7120
ProMed4
Pro9211
Pro9215
SycJA23
Syc7002
Syc7803
Syc7942
Syn6803
ThermoBP1
Trich101
GPD
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6PGD
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Pyruvat-Stoffwechsel
6PGL
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PEPC
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ME
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PPS
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PEPK
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PDH
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TCA-Zyklus
CS
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ACO
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ICD
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STK
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SDH
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• • (•)
• • (•)
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• • (•)
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•••
• • (•)
•••
• • •(•)
•••
•••
FH
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(•)
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(•)
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MDH
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MQO
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-
85
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
von Fumarat ist, welches als ein obligates Nebenprodukt während des Wachstums
entsteht.
Darüber hinaus sind noch weitere Enzyme nur für eine Untergruppe der 16 Stämme annotiert. Insbesondere fehlen das Malatenzym (EC 1.1.1.38) (ME) und die MalatDehydrogenase (EC 1.1.1.37) (MDH) in allen α-Cyanobakterien. Bei diesen Stämmen
wird die Funktion des Letzteren durch eine Malat:Chinon-Oxidoreduktase (EC 1.1.5.4)
(MQO) kompensiert, welche aber nur die irreversible Oxidation von Malat zu Oxalacetat katalysieren kann.
86
3.3. Schlussfolgerungen
3.3. Schlussfolgerungen
ie rasch wachsende Zahl von vollständig sequenzierten mikrobiellen Genomen
bietet neue Möglichkeiten, die mikrobielle Vielfalt in komplexen Umgebungen
zu verstehen. In diesem Teil der Arbeit wurde ein besonderer Fokus auf mehrere phototrophe Cyanobakterien gelegt, mit dem Ziel, Erkenntnisse über die Vielfalt
des cyanobakteriellen Stoffwechsels zu gewinnen. Cyanobakterien besitzen eine enorme metabolische Diversität und treten in fast allen Umgebungen, wo Licht verfügbar
ist, auf. Sie sind daher besonders für eine vergleichende Analyse der genetischen Diversität geeignet.
D
Die Basis für die vergleichende Analyse war die Definition von Clustern von vermutlich orthologen Genen (Cluster of Likely Ortholog Genes) und wie diese in den 16
analysierten Cyanobakterienstämmen verteilt sind. Insgesamt wurden 21.238 unterschiedliche CLOGs in den Cyanobakterienstämmen identifiziert, von denen die Mehrheit (ungefähr 65 %) aus einzelnen Genen besteht und keine vermutlichen Orthologen
in einem der anderen analysierten Stämme besitzt. Etwa 3 % der CLOGs sind allen
Stämmen zugeordnet und machen somit das Kern-Genom aus, welches von allen 16
Stämmen geteilt wird. Zu beachten ist jedoch, dass dieses Kern-Genom nicht das minimale Set an Genen repräsentiert, welches die Zelle autark lebensfähig macht. Die
übrigen CLOGs sind mehreren unterschiedlichen Stämmen zugeordnet, aber nicht in
allen 16 Stämmen zu finden. Die Ergebnisse aus dieser Vergleichsanalyse lassen mehrere Schlussfolgerungen zu:
Es gibt keine Hinweise darauf, dass das Pan-Genom der Cyanobakterien beschränkt
ist. Vielmehr steigt die Anzahl der gesamten CLOGs mit der Einbeziehung weiterer
Cyanobakterienstämme und zeigt, dass es nicht ausreicht, nur wenige Stämme zu sequenzieren, um die ganze Vielfalt des cyanobakteriellen Genoms zu ergründen und
zu erfassen. Während Extrapolationen mit Vorsicht zu betrachten sind [196], geben
jedoch die Ergebnisse einen starken Anreiz für neue Sequenzierungsprojekte von weiteren Cyanobakterienstämmen.
Weiterhin unterscheidet sich die Menge der Kern- und einzigartigen CLOGs in Bezug auf die Anreicherung von unterschiedlichen Genannotationen. Kern-CLOGs zeigen eine deutliche Anreicherung von Genen, die gemeinhin mit einer HousekeepingFunktion assoziiert sind. Dazu gehören unter anderem die Bereiche „Translation“,
„DNA-Reparatur“, „Genexpression“, „RNA-Prozessierung und Modifikation“, diverse
Transportprozesse sowie zahlreiche Stoffwechsel- und biosynthetische Prozesse. Hingegen umfasst die Annotation von Genen aus den einzigartigen CLOGs eher die Begriffe von näher bestimmbaren Funktionen, wie beispielsweise verschiedene regulatorische Prozesse. Bei einer genaueren Betrachtung der Diversität des cyanobakteriellen
Stoffwechsels auf Genomebene ist zu erkennen, dass CLOGs, denen eine Stoffwechselfunktion zugewiesen werden kann, innerhalb der Menge der Kern-CLOGs stark
überrepräsentiert sind.
Bei einer genaueren Untersuchung der Verteilung dieser metabolischen CLOGs
zeigt die Analyse ein sehr vielfältiges Bild in Bezug auf das Vorhandensein von Kern-
87
Kapitel 3. Die Diversität des cyanobakteriellen Stoffwechsels
Stoffwechselwegen. Mehrere wichtige Stoffwechselwege des zentralen Stoffwechsels
sind hoch konserviert, wie der Pentosephosphatweg und der Calvin-Benson-Zyklus.
Jedoch sind andere Teile des metabolischen Netzwerkes, insbesondere der Pyruvatstoffwechsel und der TCA-Zyklus, stark fragmentiert.
Im Gegensatz zur herkömmlichen funktionellen Annotation bietet die Annotation
von enzymatischen Funktionen den Vorteil, dass der funktionale Kontext des jeweiligen CLOGs, im Hinblick auf den Stoffwechselweg und die benachbarten Reaktionen, mit berücksichtigt werden kann. Deshalb ermöglicht es diese Analyse, die Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten Enzymen in Bezug auf die metabolische
Funktion zu bewerten und liefert dadurch stärkere Kriterien, um fehlerhafte Annotationen oder die Verlässlichkeit der CLOG-Assoziation zu beurteilen. Zum Beispiel
schränkt der unvollständig annotierte TCA-Zyklus von Cyanobakterien ihre Fähigkeit, Vorstufenmetaboliten für die Zellatmung zu liefern, stark ein. Dieses Defizit hat
Konsequenzen für die funktionale Rolle der anderen Reaktionen, wie unter anderem
die der Succinat-Thiokinase (EC 6.2.1.5). Es ist deswegen unwahrscheinlich, dass diese ihre übliche Rolle im TCA-Zyklus übernimmt und sie ist dementsprechend nur für
eine geringe Anzahl von Stämmen annotiert.
In diesem Zusammenhang kann auch die Vergleichsanalyse als ersten Schritt der
automatisierten Netzwerkrekonstruktion gesehen werden. Genomskalige Modelle des
Zellstoffwechsels werden immer wichtiger für eine Vielzahl von biotechnologischen
Anwendungen, sind aber derzeit oft auf eine kleine Anzahl von Modellstämmen beschränkt [112]. Die Rekonstruktionen von multiplen Stämmen können erheblich von
einer gründlichen Analyse der metabolischen Diversität profitieren, die unter der Menge von bereits sequenzierten Cyanobakterien existiert. Ein integrativer Prozess von
der Genomanalyse bis zur Modellrekonstruktion wird schließlich zu einem besseren
Verständnis der metabolischen und ökologischen Funktionen von Bakterienspezies
führen.
88
KAPITEL
4
Das metabolische Netzwerk von
Synechococcus elongatus PCC 7942
89
Kapitel 4. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
Vorwort
it den gewonnen Erkenntnissen über die Diversität des cyanobakteriellen
Stoffwechsels aus Kapitel 3, ergibt sich die Frage, wie das komplette metabolische Netzwerk eines zweiten Cyanobakteriums aufgebaut wäre und
welche Resultate eine Modellierung im Vergleich zum Netzwerk von Synechocystis sp.
PCC 6803 liefern würde.
Mit dieser Motivation wird im nachfolgenden Kapitel die Rekonstruktion und Modellierung eines genomskaligen metabolischen Netzwerkes von Synechococcus elongatus PCC 7942 beschrieben, eines weiteren Modellorganismus unter den Cyanobakterien. Das vorgestellte Netzwerk besitzt im Vergleich zum Netzwerk von Synechocystis
sp. PCC 6803 einen etwas geringeren Umfang und damit einhergehend eine geringere
metabolische Kapazität und Variabilität. Insbesondere werden die Unterschiede im
Zentralstoffwechsel hervorgehoben, erläutert und deren Auswirkungen auf die maximale Wachstumsrate und die optimale Flussverteilung im Detail untersucht.
Am Ende des Kapitels wird abschließend eine Verifikation des Netzwerkes von Synechococcus elongatus PCC 7942 mithilfe von Proteomikdaten vorgestellt, die von der
Arbeitsgruppe von Ilka Maria Axmann zur Verfügung gestellt wurden. Demnach konnten die Translationsprodukte von ungefähr 89 % der im metabolischen Netzwerk assoziierten Gen-Protein-Verknüpfungen detektiert werden.
M
90
4.1. Material und Methoden
4.1. Material und Methoden
4.1.1. Rekonstruktion des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus
elongatus PCC 7942
Für die Rekonstruktion des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus elongatus
PCC 7942 (Synechococcus) wurden zunächst alle Gene, die im vorher rekonstruierten
Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis) vorhanden sind, in eine
Liste übertragen. Anschließend wurde für jedes Gen in dieser Liste geprüft, ob ein korrespondierendes Gen im Genom von Synechococcus existiert. Zu diesem Zweck wurde
untersucht, ob in dem jeweiligen CLOG (siehe Kapitel 3), in dem das SynechocystisGen vorkommt, ein Gen für Synechococcus vorhanden ist. War dies der Fall, wurde das entsprechende Synechococcus-Gen mit den zugehörigen Reaktionen aus dem
Synechocystis-Netzwerk in das Synechococcus-Netzwerk übertragen. Für alle übrigen
Synechococcus-Gene, die in CLOGs vorhanden waren, denen eine enzymatische Funktion zugewiesen wurde, wurde geprüft, ob deren entsprechenden metabolischen Reaktionen mit schon vorhanden Metaboliten aus dem Synechococcus-Netzwerk interagierten und dann anschließend in das Netzwerk übernommen. Sofern dies nicht der
Fall war, wurde untersucht, ob durch mehrere annotierte Enzyme beziehungsweise
deren Reaktionsschritte, die spezifische Lücke im Netzwerk geschlossen werden konnte. Falls dies möglich war, wurden alle entsprechenden Gene und deren assoziierten
Reaktionen ins Netzwerk integriert.
Schlussendlich wurden noch alle nicht durch Enzyme katalysierten Reaktionen aus
dem Synechocystis-Netzwerk in das Synechococcus-Netzwerk transferiert. Ferner wurden die Kompartimentierungen und die Zuweisung der Reaktionen zu diesen Kompartimenten für die Rekonstruktion des Synechococcus-Netzwerkes übernommen. Als
finalen Schritt wurde die Biomassezielfunktion aus dem Synechocystis-Netzwerk an
die Gegebenheiten des Stoffwechsels von Synechococcus angepasst: Da Synechococcus
nicht in der Lage ist, irgendeine Variante von Tocopherol zu bilden, wurde dieses vollständig aus der Biomasseformel entfernt und deren Anteil zu den anderen Bestandteilen der Pigmentkomponente addiert. Desgleichen sind noch weitere Pigmente in
Synechococcus nicht abundant [219]. So wurde auch der Anteil von Echinenon zum Anteil von Zeaxathin addiert. Der Anteil von Succinyl-CoA in der Biomasseformel wurde
durch Acetyl-CoA ersetzt. Aufgrund der fehlenden ∆6 - und ∆15 -Fettsäuredesaturasen
im Genom von Synechococcus [212] wurden die mehrfach ungesättigten Membranlipide mit mehr als zwei Doppelbindungen nicht berücksichtigt und deren prozentualer
Faktor zu dem von Linolsäure addiert.
91
Kapitel 4. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
4.1.2. Flussbilanzanalyse des metabolischen Netzwerkes von
Synechococcus elongatus PCC 7942
Für die Simulation des phototrophen Wachstums und des Wachstums bei Abwesenheit
von Licht von Synechococcus wurden die gleichen Bedingungen und Parameter wie
beim Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 festgelegt. Alle Eingangsparameter
der FBA des Synechococcus-Modells für das phototrophe Wachstum sowie das Wachstum bei Abwesenheit von Licht, sind in der Tabelle 4.1 aufgeführt.
Tabelle 4.1.: Eingangsparamter für die FBA des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus elongatus PCC 7942. Aufgeführt sind die festgelegten Flussraten [mmol gDW-1 h-1 ] für die entsprechenden
Reaktionen im Netzwerk für das phototrophe Wachstum (Licht) und bei Abwesenheit von Licht (Dunkel).
Reaktion
Lichteingang
Dunkel
PR0001
18,7
0
TR0006
TR0008
TR0009
TR0011
TR0014
TR0014_2
TR0034
TR0035
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
basaler ATP-Verbrauch
GE0001
0,13
0,07
Cytochrom-c-Oxidase
Mehler-ähnliche Reaktion
PR0010
PR0033
0,2263
0,2263
0
0
Sauerstoffradikale am PS II
Mehler-Reaktion
PR0034
PR0032
0,0477
0,0473
0
0
GLYC
0
0,01
BM0009
max.
max.
Diverse Kohlenstofftransporter
Glykogenmobilisierung
Biomassezielfunktion
92
Reaktionsnummer Licht
4.2. Ergebnisse und Diskussion
4.2. Ergebnisse und Diskussion
4.2.1. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
Neben Synechocystis sp. PCC 6803 zählt auch Synechococcus elongatus PCC 7942 zu
den Modellorganismen unter den Cyanobakterien. Insbesondere für den Bereich der
Erforschung der circadianen Uhr in Prokaryoten inklusive deren Mechanismus existieren viele Studien und Analysen [29, 220–222]. Einen sehr guten Ausgangspunkt für
die Rekonstruktion eines metabolischen Netzwerkes von Synechococcus liefert die Vergleichsanalyse aus Kapitel 3. Unter Miteinbeziehung des metabolischen Netzwerkes
von Synechocystis, welches als Basis diente, wurde eine genomskalige Netzwerkrekonstruktion des Stoffwechsels für Synechococcus erstellt. Fördernd für diesen Prozess
der Rekonstruktion wirkten hierbei die Erfahrungen und Gegebenheiten, die aus der
schon weit fortgeschrittenen Rekonstruktion des Synechocystis-Netzwerkes übertragen werden konnten.
Für die Rekonstruktion von Synechococcus wurden die gleichen Stoffwechselwege
entsprechend dem Synechocystis-Netzwerk betrachtet und in ein Kernnetzwerk integriert. Entsprechend dem Synechocystis-Netzwerk wurde für diesen Prozess beachtet,
dass eine Synthese aller Biomassekomponenten, Cofaktoren und Metaboliten im Netzwerk ermöglicht wurde. Die aktuelle Netzwerkrekonstruktion von Synechococcus umfasst zurzeit 581 Gene, die für 468 Enzyme oder Enzymkomplexe kodieren. Diese resultieren in 666 zusammenhängenden Stoffwechselreaktionen, welche 574 Stoffwechselmetaboliten umsetzen. Somit sind es 94 Reaktionen weniger als im SynechocystisNetzwerk. Die Reaktionen sind sieben unterschiedlichen Kompartimenten zugeteilt,
welche analog zum Synechocystis-Netzwerk spezifiziert wurden. Da Synechococcus
phototroph wächst, beschränkten sich die Simulationen ausschließlich auf das phototrophe Wachstum und die Nutzung von Glykogen als Nachtspeicher bei Abwesenheit
von Licht. Entsprechend dem vorher rekonstruierten und analysierten Netzwerk von
Synechocystis wurde die Aufnahme und die Verwertung von zusätzlichen komplexeren
organischen Kohlenstoffquellen nicht mit in Betracht gezogen. Die Rekonstruktion des
Synechococcus-Netzwerkes ist im elektronischen Anhang dieser Arbeit als SBML- und
Excel-Datei verfügbar.
4.2.2. Der Zentralstoffwechsel von Synechococcus elongatus PCC 7942 im
Vergleich zu Synechocystis sp. PCC 6803
Synechococcus elongatus PCC 7942 und Synechocystis sp. PCC 6803 gehören beide
zu den β-Cyanobakterien und wurden zuerst aus Süßwasserhabitaten isoliert. Beide
Stämme leben als Einzelzellen und sind nicht in der Lage, elementaren Stickstoff zu
fixieren (siehe Tabelle 3.1). Betrachtet man die Genomgröße, ausgenommen der Plasmide, ist hingegen auszumachen, dass das Genom von Synechocystis um mehr als
25 % größer ist im Vergleich zu Synechococcus (3,57 Mb zu 2,8 Mb, siehe Tabelle 3.1).
Dieser Sachverhalt spiegelt sich auch auf der Ebene der metabolischen Kapazität
wieder. Während Synechocystis sehr variabel ist und auf mindestens drei verschiede-
93
Kapitel 4. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
ne Speicherverbindungen zurückgreifen kann, dazu gehören unter anderem Glykogen,
Poly-β-Hydroxybutyrat (PHB) und Cyanophycin, sind im Genom von Synechococcus
nur Gene für die Glykogen-Synthese und –Mobilisierung zu finden. Gene für die Synthese von PHB oder Cyanophycin sind nicht vorhanden (siehe Kapitel 3.2.6). Außerdem ist Synechococcus nicht in der Lage, die verschiedenen Tocopheroltypen zu bilden,
welche von Synechocystis zum Schutz gegen oxidativen Stress synthetisiert werden
können [223]. Zudem kann das Carotinoid Echinenon nicht von Synechococcus gebildet werden [219].
Bei genauerer Betrachtung des Fettstoffwechsels fällt auf, dass im Genom von
Synechococcus keine ∆6 - und ∆15 -Fettsäuredesaturasen annotiert sind [212] und mehrfach ungesättigte Membranlipide mit mehr als zwei Doppelbindungen im Stoffwechselnetzwerk nicht synthetisiert werden können. Darunter fallen vor allem γ-LinoleoylACP, α-Linoleoyl-ACP und Stearidonoyl-ACP. Ergänzend fehlt in Synechococcus der
gesamte Harnstoffmetabolismus, was zur Folge hat, dass jegliches Enzym, welches in
irgendeiner Weise Harnstoff bildet oder umsetzt, nicht in Synechococcus vorkommt.
Dies betrifft unter anderem die Synthese von Putrescin und folglich auch die von Spermidin. Putrescin wird in Synechocystis über eine Arginin-Decarboxylase (EC 4.1.1.19)
(slr0662 und slr1312) und eine Agmatinase (EC 3.5.3.11) (sll0228 oder sll1077) synthetisiert. Die Arginin-Decarboxylase decarboxyliert Arginin zu Agmatin, welches wiederum durch die Agmatinase zu Putrescin und zu Harnstoff hydrolysiert wird. Da bei
Synechococcus keine Umsetzung von Harnstoff im Stoffwechsel möglich ist, wird der
letzte Schritt der Putrescin-Synthese, also die Agmatinase, durch Kombination einer
Agmatin-Deiminase (EC 3.5.3.12) (Synpcc7942_2402 oder Synpcc7942_2461, durch eine BLAST-Suche identifiziert), welche Agmatine zu N-Carbamoylputrescin und Ammonium hydrolysiert, mit einer N-Carbamoylputrescin-Amidohydrolase (EC 3.5.1.53)
(Synpcc7942_2145), die anschließend aus dem N-Carbamoylputrescin Putrescin bildet,
kompensiert.
Bei der Synthese der verzweigtkettigen Aminosäuren ist auszumachen, dass Synechococcus im Gegensatz zu Synechocystis nur die Möglichkeit aufweist, 2-Oxobutyrat
über dessen alternativen Syntheseweg herzustellen, der von Wu et al. (2010) [224] beschrieben wurde. Synechocystis besitzt hingegen zusätzlich noch den weitverbreiteten
Syntheseweg über eine Threonin-Deaminase (EC 4.3.1.19) (slr2072), die in Synechococcus fehlt. Des Weiteren ist es in Synechococcus nicht möglich, Glycerat, welches
unter anderem als Produkt der Photorespiration entstehen kann [119], über Glycerol
zu Glycerol-1-Phosphat abzubauen, um es von dort weiter im Stoffwechsel wiederzuverwerten. Bei Synechococcus existiert nur der Stoffwechselweg über die direkte Konversion von Glycerat zu Glycerat-3-Phosphat.
Ein gravierender Unterschied im Stoffwechsel von Synechococcus zu Synechocystis
wird bei einer näheren Betrachtung des TCA-Zyklus inklusive der angrenzenden Reaktionen erkennbar (siehe Abbildung 4.1). Von den konventionellen Enzymen des
TCA-Zyklus sind im Vergleich zu Synechocystis (Abbildung 4.1 A) keine Gene, die für
eine Succinat-Thiokinase (EC 6.2.1.5) (STK) oder Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37)
(MDH) kodieren, zu finden. Insbesondere letztere, welche bei den α-Cyanobakterien
94
4.2. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.1.: Unterschiede auf Ebene des TCA-Zyklus zwischen A) Synechocystis sp. PCC 6803 und
B) Synechococcus elongatus PCC 7942. Während es bei A) Synechocystis möglich ist, auf zwei Weisen
einen zyklischen Fluss zu gewährleisten, ist laut Genannotation bei B) Synechococcus ein zyklischer
Fluss durch den TCA-Zyklus nicht möglich. Zudem fehlt eine Malat-Dehydrogenase, wodurch nur ein
Fluss über das CO2 -freisetzende Malatenzym möglich ist.
durch eine Malat:Chinon-Oxidoreduktase (EC 1.1.5.4) (MQO) kompensiert wird (siehe Kapitel 3.2.7), wird durch keine entsprechende Reaktion ausgeglichen. Demzufolge
ist ein Recycling von Malat beziehungsweise Fumarat, welches während unterschiedlicher Synthesewege als Nebenprodukt entstehen kann, nur über das Kohlenstoffdioxid-freisetzende Malatenzym (EC 1.1.1.38) (ME) möglich. Der resultierende NettoEnergiegewinn mittels eines zyklischen Flusses durch den TCA-Zyklus ist dadurch
stark eingeschränkt.
Das Szenario eines zyklischen Flusses durch den TCA-Zyklus ist jedoch laut Genomannotation ohnehin nicht realisierbar, da in Synechococcus weder Enzyme für den
GABA-Shunt [93] noch für eine 2-Oxoglutarat-Decarboxylase (EC 4.1.1.71) [142] zu finden sind (siehe Abbildung 4.1 B). Beide Stoffwechselwege würden gewährleisten, dass
der fehlende 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex bei Cyanobakterien kompensiert
werden könnte. Auch ist kein Gen im Genom von Synechococcus für eine GlutamatDehydrogenase (EC 1.4.1.4) (GDH) annotiert, welche direkt an den TCA-Zyklus an-
95
Kapitel 4. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
und beträgt (0,0287 h-1 für Synechococcus zu 0,0288 h-1 für Synechocystis). Die optimale Flussverteilung für die Simulation des phototrophen Wachstums von Synechococcus
ist in Abbildung 4.3 gezeigt.
Bei der Simulation des Wachstums bei Nacht beziehungsweise Abwesenheit von
Licht gibt es eine wesentlichere Umverteilung der optimalen Flusslösung im Gegensatz zu Synechocystis. Bei Abwesenheit von Licht existiert kein zyklischer Fluss durch
den TCA-Zyklus, da wie schon im vorangegangenen Kapitel erwähnt, dieser nicht
durch einen der bekannten Wege (Bypass) geschlossen werden kann.
Die Reduktionsäquivalente, welche hauptsächlich in Form von NADPH gebraucht
werden, werden über den oxidativen Pentosephosphatweg (OPP) bereitgestellt. Diese
Lösung ist nicht so effektiv wie der zyklische Fluss durch den TCA-Zyklus und resultiert dementsprechend in einer geringeren Kapazität beziehungsweise Biomasseproduktion im Vergleich zum Netzwerk von Synechocystis (siehe Tabelle 4.2). Auch die
Fähigkeit Energie in Form von ATP, welches für die Erhaltung der Zellfunktionen benötigt wird, kann prinzipiell nicht in dem Maße und so effektiv synthetisiert werden,
wie es im Synechocystis-Netzwerk der Fall ist. Die optimale Flussverteilung für das
Wachstum bei Abwesenheit von Licht ist in Abbildung 4.4 dargestellt.
Abbildung 4.4.: Ausschnitt des Zentralstoffwechsels von der optimalen Flussverteilung für Synechococcus elongatus PCC 7942 bei Abwesenheit von Licht. Die Flüsse sind in 10-2 mmol gDW-1 h-1 gegeben. Die
Erklärung der Abkürzungen für die verwendeten Metaboliten sind im Anhang in der Tabelle A.3 aufgeführt.
98
4.2. Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4.2.: Kernmerkmale des metabolischen Netzwerkes von Synechocystis sp. PCC 6803 im Vergleich zum Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942.
Synechocystis
sp. PCC 6803
Synechococcus
elongatus PCC 7942
Anzahl der Reaktionen
759
666
Anzahl der Metaboliten
601
574
Anzahl der Gene
677
589
0,0288
0,0287
max. Restwachstumsrate
bei Abwesenheit von Licht [h-1 ]
0,585· 10-3
0,573· 10-3
zyklischer Fluss über den TCAZyklus bei Abwesenheit von
Licht
•
-
Fluss über den OPP bei Abwesenheit von Licht
-
•
max. phototrophe
Wachstumsrate [h-1 ]
4.2.4. Verifizierung des metabolischen Netzwerkes von Synechococcus
elongatus PCC 7942
Einer der wichtigsten Schritte, um die Glaubwürdigkeit eines metabolischen Modells
zu unterstützen, besteht darin, den Sachverhalt zu überprüfen, ob wirklich alle Reaktionsschritte, die in der jeweiligen Rekonstruktion des Stoffwechsels aufgeführt sind,
auch in vivo in der Zelle existieren. Ein Augenmerk liegt dabei natürlich auf der Verifizierung jedes einzelnen Enzyms, ob dieses zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle
exprimiert wird und aktiv ist und somit die gewünschte Reaktion katalysieren kann.
Leider sind solche Daten in der Praxis meist nicht verfügbar und wenn, dann nur für
einzelne Reaktionsschritte vorhanden. Eine grobe Annäherung hierfür liefert die Tatsache, ob überhaupt zu irgendeinem Zeitpunkt oder unter irgendeiner Bedingung die
Translation der entsprechenden Gene zu Proteinen erfolgt. Solche entsprechenden Daten werden durch Proteomik-Analysen unter Verwendung eines Massenspektrometers
erzeugt. Im Laufe dieser Arbeit war es möglich, einen solchen Datensatz für das Cyanobakterium Synechococcus von der Arbeitsgruppe von Ilka Maria Axmann auszuwerten
(unveröffentlichte Daten [225]). Dieser Datensatz beschreibt unterschiedliche Proteinkonzentrationen über den Verlauf mehrerer Tagesperioden. Für den Abgleich mit dem
Modell des Stoffwechselnetzwerkes von Synechococcus wurden alle Proteinstrukturen
und -fragmente, die jemals zu einem der unterschiedlichen Zeitpunkte gemessen werden konnten, ermittelt und überprüft, ob diese mit metabolischen Enzymen aus dem
Netzwerk übereinstimmen.
99
Kapitel 4. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
Das metabolische Netzwerk von Synechococcus beinhaltet 589 unterschiedliche Gene (siehe Tabelle 4.2). Von diesen 589 metabolischen Genen konnte die Expression
von 526 durch die Detektion des jeweiligen Proteinproduktes bestätigt werden. Dies
entspricht mehr als 89 % aller Gene im Netzwerk. Demgegenüber stehen 63 verbleibende Gene, die entweder unter den Bedingungen der Probenentnahme für die Proteinmessungen nicht exprimiert und translatiert wurden oder deren Proteinprodukte
nicht durch die Analysemethode detektierbar waren. Von diesen 63 verbleibenden
Genen sind neun Gene als Isoenzyme zu identifizieren, das heißt, ihre assoziierte
enzymatische Reaktion ist im metabolischen Netzwerk mindestens zweimal vorhanden. Ein Beispiel für diesen Fall sind die beiden gap1-Gene (Synpcc7942_0245 und
Synpcc7942_1939), von denen aber nur das Translationsprodukt eines Gens (Synpcc7942_0245) in den Proteindaten identifiziert werden konnte. Die übrigen 54 nicht
detektierten Proteine umfassen 17 Proteine beziehungsweise Proteinkomponenten,
die als Transportproteine fungieren, 17 Proteine oder Untereinheiten sind direkt in
der Atmungskette beziehungsweise am Photosyntheseapparat involviert, sechs in den
Synthesen der Fettsäuren, vier in den Pigmentsynthesen und zwei bei der Peptidoglycansynthese. Die restlichen acht Proteine sind über unterschiedliche Stoffwechselwege verteilt.
100
4.3. Schlussfolgerungen
4.3. Schlussfolgerungen
er Vergleich unterschiedlicher Organismen in Hinsicht auf ihre metabolische
Kapazität ist ein wichtiger Aspekt, um profunde Aussagen über die Eignung
des Organismus zum Beispiel für die Anwendung in der Biotechnologie, zu
treffen. Unter diesem Gesichtspunkt ist auch die Stammauswahl bei den unterschiedlichen Cyanobakterienstämmen, die für eine Produktion verschiedenster Biokraftstoffe in Frage kommen können, zu sehen.
D
In dieser Hinsicht wurde im Laufe dieser Arbeit ein genomskaliges Netzwerk des
Stoffwechsels von Synechococcus elongatus PCC 7942 rekonstruiert. Unter Berücksichtigung des schon vorhanden Netzwerkes des Cyanobakteriums Synechocystis sp.
PCC 6803 und der vergleichenden Genomanalyse der 16 verschiedenen Cyanobakterienstämme auf Ebene des Stoffwechsels, konnten diese Informationen mit in die
Rekonstruktion einfließen. Das resultierende Netzwerk besitzt, auf die Anzahl der unterschiedlichen Stoffwechselwege bezogen, nahezu den gleichen Umfang wie das zuvor
rekonstruierte Synechocystis-Netzwerk (siehe Kapitel 2). Jedoch ist die Gesamtanzahl
der involvierten Stoffwechselreaktionen und –schritte im Vergleich zu Synechocystis
geringer, welches im Einklang mit der geringeren Genomgröße von Synechococcus
(3,57 Mb zu 2,8 Mb) steht.
In der Tat hat das Nichtvorhandensein einiger Stoffwechselreaktionen wesentlichen Einfluss auf die maximale Wachstumsrate beziehungsweise die Kapazität und
Effektivität, bestimmte Biomassekomponenten zu synthetisieren. Beim phototrophen
Wachstum hat das Fehlen der Threonin-Deaminase (4.3.1.19) und der Fluss über das
kohlenstoffdioxidfreisetzende Malatenzym minimale Auswirkungen auf die maximale
Wachstumsrate. Zwar hat die Defizienz, das durch die Photorespiration zwangsweise
auftretende Glyoxylate nicht über Glycerat und Glycerol zu sn-Glycerol-1-Phosphat
abbauen zu können sowie das Nichtvorhandensein eines Harnstoffwechsels, keinen
direkten Einfluss auf die durch die FBA errechnete optimale Flussverteilung. Jedoch
hat dieser Sachverhalt eine nicht so hohe metabolische Variabilität und Anpassungsfähigkeit zur Folge, welche unter anderen oder nicht optimalen Wachstumsbedingungen,
signifikanteren Einfluss auf das Wachstums nehmen könnte.
Bei einer genaueren Betrachtung der metabolischen Kapazitäten des zentralen
Stoffwechsels von den beiden Cyanobakterien ist zu erkennen, dass Synechococcus
in einigen Schlüsselreaktionen nicht die metabolischen Charakteristika aufweist, die
vor allem für ein optimales Wachstum bei Abwesenheit von Licht beziehungsweise
beim heterotrophen Wachstum benötigt werden. Zweifelsohne wird vorwiegend die
Stoffwechselkapazität in größerem Maße dadurch beschränkt, dass die Mobilisierung
von Glykogen, welches als Kohlenstoffspeicherverbindung für Zeiten bei Abwesenheit
von Licht dient, nicht über einen zyklischen Fluss durch den TCA-Zyklus laufen kann,
sondern die Gewinnung von Reduktionsäquivalenten ausnahmslos über den Pentosephosphatweg ablaufen muss. Dieser Befund ist zum Teil kontrovers zu Aussagen von
Zhang und Bryant (2011) [142], die proklamieren, dass bei allen β-Cyanobakterien der
TCA-Zyklus durch deren neu identifizierte 2-Oxogluterat-Decarboxylase geschlossen
101
Kapitel 4. Das metabolische Netzwerk von Synechococcus elongatus PCC 7942
werden kann und somit einen zyklischen Fluss ermöglicht. Da jedoch für Synechococcus weder eine 2-Oxogluterat-Decarboxylase noch eine Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase und eine Malat-Dehydrogenase im Genom identifiziert werden können,
bleibt der TCA-Zyklus sehr fragmentär.
Unter diesem Gesichtspunkt kann auch der Sachverhalt betrachtet werden, dass
Synechococcus nur eine der drei untersuchten Hauptspeicherverbindungen bei Cyanobakterien, nämlich Glykogen, aufweist. Zudem gibt dieser Aspekt Anhaltspunkte
darauf, dass Synechococcus nicht die große Variabilität und Kompetenz des heterotrophen Wachstums von anderen Cyanobakterien, wie zum Beispiel Synechocystis, besitzt. Da jedoch in der Analyse dieser Arbeit andere Speicherstoffverbindungen außer
Glykogen beim Wachstum unter Abwesenheit von Licht nicht berücksichtigt wurden,
können sich keine konkreten oder direkten Aussagen daraus formulieren lassen.
Die reale Situation in der Zelle, also in vivo, überschneidet sich nicht immer im vollen Maße mit den Ergebnissen, die die mathematischen Modellierungen biologischer
Probleme liefern. Um die Aussagekraft des mathematischen genomskaligen Modells
zu festigen, ist die Verknüpfung einer systematischen Analyse mit Hochdurchsatzdaten essentiell. In Fall des Stoffwechselmodells von Synechococcus wurde die resultierende Rekonstruktion des Stoffwechsels mit Proteomdatensätzen von in vivo Messungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten eines Tagesablaufs abgeglichen [225]. Die
Detektion aller Proteine beziehungsweise Proteinfragmente zu jedem beliebigen Zeitpunkt wurde mit den im metabolischen Netzwerk auftretenden Stoffwechselenzymen
verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass ca. 89 % aller im Netzwerk agierenden Enzyme und Enzymuntereinheiten und somit fast das gesamte Netzwerk, durch die Proteinmessungen abgedeckt werden. Unter den fehlenden Proteinen befinden sich zum
größten Teil membranassoziierte Proteine, wie Transportproteine und Transporteruntereinheiten oder Enzyme der Atmungs- und Elektronentransportkette. Dieser Typ
von Proteinen besitzt in der Regel eine Transmembrandomäne als Teil ihrer Aminosäuresequenz, mit der sie in den unterschiedlichen Membranen der Zelle verankert oder
eingebettet sind. Die Detektion solcher Proteinsequenzen ist jedoch, bedingt durch
die Extraktions- und Detektionsmethode, mit der die Daten gewonnen wurden, nicht
möglich.
Bei Betrachtung der übrigen, nicht erfassten Proteine des Netzwerkes, ist festzustellen, dass circa ein Drittel dieser Proteine beziehungsweise deren Funktionen,
mehrfach im metabolischen Netzwerk vorhanden sind (Isoenzyme). Dies hat zur Folge,
dass die Aktivität dieser Enzyme beziehungsweise deren Reaktionen für das Netzwerk
und die Simulationen nicht relevant sind. Die Existenz solcher Gene kann dadurch erklärt werden, dass es sich um Pseudogene handelt, die niemals transkribiert werden
oder deren Transkription nur unter sehr speziellen Bedingungen erfolgt, diese aber
nicht bei der Gewinnung der Daten zugegen waren.
Es ist zu beachten, dass trotz der Detektion des Genprodukts der meisten metabolischen Enzyme durch die Auswertung der Proteindaten und deren Verknüpfung mit
dem metabolischen Netzwerk, keine direkte Aussage über die Aktivität dieser Enzyme möglich ist. Posttranslationale Modifikationen, welche die Aktivität dieser Enzy-
102
4.3. Schlussfolgerungen
me stark beeinflussen, können anhand einer solchen Analyse nicht aufgeschlüsselt
werden. Zudem enthalten die Proteindaten keine Information über die Aktivität einer
spezifischen Reaktion beziehungsweise ob über den beteiligten Stoffwechselweg ein
Fluss in vivo läuft.
Nichtsdestotrotz ist es ein erster Schritt, um genomskalige Netzwerke zu verifizieren und um deren Aussagekraft bezüglich der Simulationen höher einzuschätzen.
Ferner erlauben die Schlüsse aus solch einem systematischen Ansatz der Netzwerkanalyse mit der Verknüpfung von experimentell gewonnenen Daten, ein konkreteres
Bild über den Zustand des Zellstoffwechsels in vivo.
103
KAPITEL
5
Modellierung verschiedener
Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
105
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Vorwort
as 5. Kapitel dieser Arbeit befasst sich mit einer biotechnologischen Anwendung des metabolischen Modells aus dem Bereich des Metabolic Engineering.
Konkret wird die Synthese von neun unterschiedlichen Biokraftstoffen analysiert, deren jeweiliger Syntheseweg in das metabolische Netzwerk von Synechocystis
sp. PCC 6803 integriert wurde. Die entsprechenden metabolischen Reaktionen wurden zu diesem Zweck aus der Literatur entnommen. Zu den untersuchten Biokraftstoffen gehören Ethanol, Ethylen, Propan, Butanol, Isopren, Pentadecan, Heptadecan,
Octadecansäure und Octadecanol.
Unter Verwendung der Flussbilanzanalyse wurden die jeweiligen Synthesewege
charakterisiert und der zugehörige theoretische maximale Energiegewinn für jeden
Biokraftstoff berechnet. Zudem werden auftretende synergetische Wechselwirkungen
zwischen dem Biokraftstoff und dem Zellwachstum analysiert. Abschließend wird eine
Methode zur Identifizierung von Zielgenen (Gene Targets) beziehungsweise Schlüsselreaktionen, die sich für eine genetische Manipulation in Form eines Gen-Knockouts
oder einer Genüberexpression zur Steigerung der Produktausbeute eignen, am Beispiel von Ethylen kurz vorgestellt.
D
106
5.1. Material und Methoden
5.1. Material und Methoden
5.1.1. Integration von Biokraftstoffsynthesen in das metabolische Netzwerk
von Synechocystis sp. PCC 6803
Für die Analyse der Biokraftstoffsynthesen wurde die Netzwerkrekonstruktion von
Synechocystis sp. PCC 6803 mit spezifischen Genen und deren Reaktionen zur Erzeugung von neun unterschiedlichen Biokraftstoffen erweitert. Zu den untersuchten Biokraftstoffen gehören Ethanol, Ethylen, Propan, Butanol, Isopren, Pentadecan, Heptadecan, Octadecansäure und Octadecanol. Die zugehörigen Reaktionen wurden aus der
Literatur entnommen und das metabolische Netzwerk von Synechocystis um diese Reaktionen erweitert. Zusätzlich wurde für jeden Biokraftstoff eine Transportfunktion
integriert, die das jeweilige Produkt aus der Zelle exportieren kann. Die zusätzlichen
Synthesereaktionen der einzelnen Biokraftstoffe sind in Tabelle 5.1 aufgeführt.
In Abbildung 5.1 ist zudem gezeigt, in welchem Bereich des Stoffwechsels die jeweiligen Synthesereaktionen liegen und welche direkte Vorläufermetaboliten aus dem
Zellstoffwechsel benötigt werden. Da bei der Synthese von Ethylen Guanidin entsteht,
welches nicht weiter über das Netzwerk verstoffwechselt werden kann, wurde für diesen Metabolit ein Ausfluss aus dem System zusätzlich in das Netzwerk eingefügt.
Abbildung 5.1.: Lage der Synthesereaktionen der neun Biokraftstoffe im Zentralstoffwechsel von Synechocystis sp. PCC 6803. Die eingefügten Reaktionen sind dabei im Detail mit den jeweiligen Cofaktoren
aufgeführt, während die restlichen Reaktionen des Stoffwechsels vereinfacht wurden. Die Erklärung der
Abkürzungen für die verwendeten Metaboliten sind im Anhang in der Tabelle A.3 aufgeführt.
107
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Tabelle 5.1.: Synthesereaktionen der neun Biokraftstoffe, die in das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803 integriert wurden. Falls vorhanden, sind jeweils die zugehörigen Gene, Enzyme und
die entsprechende Referenz zu der Literatur angegeben.
Biokraftstoff Enzym
Reaktion
Ethanol
PyruvateDecarboxylase
Pyruvat ⇒ Acetaldehyd + CO2
Alkoholdehydrogenase
Acetaldehyd + NAD(P)H + H+ ⇒ Ethanol + NAD(P)+
Ethylen
Propan,
Butanol
Gen
Referenz
slr0090,
[226]
slr1192
3 2-Oxoglutarat + 3 O2 + L-Arginin ⇒ 2 Ethylen + 7 CO2 +
Succinat + Guanidin + 1-Pyrrolin-5-Carboxylat
[91]
3-HydroxyButyryl-CoADehydratase
Hydroxy-Butyryl-CoA ⇒ Crotonoyl-CoA + H2 O
[82]
Trans-2Enoyl-CoAReduktase
Crotonoyl-CoA + NADH + H+ ⇒ Butyryl-CoA + NAD+
[82]
Ethylenbildendes
Enzym (EFE)
Butyryl-CoATransferase
Butyryl-CoA + Acetat ⇒ Butansäure + Acetyl-CoA
[82]
Butansäure + NADPH + H+ + ATP ⇒ Butyraldehyd +
NADP+ + AMP + PPi + H2 O
Butyraldehyd + O2 + 2 NADPH + 2 H+ ⇒ Propan + Methansäure + H2 O + 2 NADP+
Isopren
Heptadecan,
Octadecanol,
Pentadecan
IsoprenSynthase
Acyl-ACPReduktase
AldehydDecarbonylase
AldehydDecarbonylase
Butyraldehyd + NADPH + H+ ⇒ Butanol + NADP+
Dimethylallylpyrophosphat ⇒ Isopren + PPi
Hexadecanoyl-[acp] + NADPH + H+ ⇒ Hexadecanal + ACP
+ NADP+
[10]
sll0209 [74]
Octadecanoyl-[acp] + NADPH + H+ ⇒ Octadecanal + ACP
+ NADPH+
sll0209 [74]
Hexadecanal + O2 + 2 NADPH + 2 H+ ⇒ Pentadecan +
Methansäure + H2 O + 2 NADP+
sll0208 [227]
Octadecanal + O2 + 2 NADPH + 2 H+ ⇒ Heptadecan +
Methansäure + H2 O + 2 NADP+
sll0208 [227]
Octadecanal + NADPH + H+ ⇒ Octadecanol + NADP+
Octadecansäure
108
Acyl-ACPThioesterase
Octadecanoyl-[acp] + H2 O ⇒ ACP + Octadecansäure
slr1609 [83]
5.1. Material und Methoden
5.1.2. Parameter und Berechnung der stöchiometrischen Eigenschaften für
die Biokraftstoffsynthesen
Für die Berechnung der stöchiometrischen Eigenschaften, der Trade-off-Bestimmung
und des synergetischen Effektes der einzelnen Biokraftstoffe wurde die RuBisCOCarboxylierungsreaktion von der Oxygenierungsreaktion entkoppelt, so dass diese separat und unabhängig voneinander ablaufen können.
Als Ausgangsszenario wurden ähnliche Parameter für das metabolische Netzwerk
festgelegt, wie die in Kapitel 2.1.8 beschriebenen (unter anderem eine Verdopplungszeit von 24 h und keine Aufnahme von komplexeren Kohlenstoffverbindungen), allerdings mit einigen Ausnahmen: Synechocystis ist in der Lage, Hydrogencarbonat über
verschiedene Transporter aufzunehmen, unter anderem über einen ATP-abhängigen
Transport und über einen Na+ -abhängigen Transport. Im folgenden wird davon ausgegangen, dass Hydrogencarbonat über den Na+ - abhängigen Transport aufgenommen wird und CO2 , welches im Laufe der unterschiedlichen Synthesewege frei wird,
über die Zellmembran ins Medium diffundiert. Ein alternatives Szenario ist ein ATPabhängiger Transport. Hierbei wird das freigewordene CO2 nicht aus dem System
exportiert. Stattdessen findet ein internes Recycling zu Hydrogencarbonat unter Verwendung des NADPH-Dehydrogenase-Komplexes (NDH-1) statt. Außerdem wurden
alle zusätzlichen energieverbrauchenden Reaktionen, wie die Reaktion für den basalen ATP-Verbrauch (Maintenance), die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, die
Tabelle 5.2.: Eingangsparameter für die Simulationen des metabolischen Netzwerkes zur Biokraftstoffsynthese. Aufgeführt sind die festgelegten Flussraten [mmol gDW-1 h-1 ] für die entsprechenden Reaktionen
im Netzwerk. Als zu maximierende Zielfunktion wird entweder die jeweilige Biokraftstoffsynthesereaktion
definiert oder die Biomassebildung (R147).
Reaktion
Reaktion
Wert
Lichteingang
R443
15,57
Diverse Kohlenstofftransporter
R676
R677
R678
R679
R680
R681
R682
R685
R686
R687
R712
R713
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Biokraftstoff bzw.
Biomasse
max.
Zielfunktion
109
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Mehler-ähnliche-Reaktion oder die Respiration, nicht festgelegt. Die gesetzten Reaktionsbegrenzungen des metabolischen Netzwerkes für die Simulationen zu den Biokraftstoffsynthesen sind in der Tabelle 5.2 aufgeführt.
Die optimale Flussverteilung wurde anschließend mithilfe der FBA (siehe Kapitel 2.1.2) berechnet und lieferte die jeweilige maximale, theoretische Biokraftstoffausbeute und die stöchiometrische Anzahl der Photonen, von Sauerstoff, NADPH, ATP
sowie der Kohlenstoffatome in Millimol, die über die Reaktion der RuBisCO fixiert werden, um ein Millimol des spezifischen Biokraftstoffes zu synthetisieren. Zudem ist die
Gesamtanzahl der aktiven Reaktionen im Netzwerk pro Biokraftstoff gezeigt. Die jeweiligen Heizwerte der einzelnen Biokraftstoffe bei Raumtemperatur (Hi ) wurden aus
dem NIST Chemie-Webbuch [228] entnommen. Mithilfe der maximalen Syntheserate
des Biokraftstoffes und des zugehörigen Heizwertes wurde der maximale theoretische
Ertrag durch Multiplikation beider Werte errechnet.
5.1.3. Trade-off und Variabilitätsanalyse der Biokraftstoffsynthesen
Um den Energie Trade-off bei den verschiedenen prozentualen Biomassesyntheseanteilen zu berechnen, wurde die Synthese der Biomasse zwischen 0 % und 100 % der
maximalen Biomassesynthese festgelegt. Startend mit der maximalen Biomassesynthese wurde diese bei jedem Rechenschritt schrittweise verringert. Anschließend wurde das System auf die Synthese des gewünschten Biokraftstoffes optimiert, so dass
alle verbleibenden Ressourcen auf dessen Produktion gerichtet wurden. Dabei wurde
für jede einzelne Reaktion die Flussvariabilität berechnet, die möglich ist, um die Maximierung der Zielfunktion zu gewährleisten. Ausgewählt wurden abschließend die
Reaktionen, bei denen entweder der absolute Flusswert, in diesem Fall der Durchschnitt der Variabilität, mit ansteigender Biokraftstoffsynthese um mindestens 5 %
über den gesamten Verlauf ansteigt beziehungsweise abfällt und bei 100 %iger Biokraftstoffsynthese mindestens 0,001 mmol gDW-1 h-1 absolut beträgt.
5.1.4. Synergetische Effekte der Biokraftstoffsynthesen
Neben der alleinigen Synthese des Biokraftstoffes wurde auch die Ausbeute analysiert,
wenn die Bildung von Biomasse und die Synthese des Biokraftstoffes gleichzeitig in
der Zelle ablaufen. Der bei den unterschiedlichen Prozentschritten der Biokraftstoffsynthese (siehe Kapitel 5.1.3) resultierende Synthesefluss wurde mit dem maximalen
Synthesefluss ohne Biomassebildung bei der gleichen Lichtintensität verglichen und
der prozentuale Anteil errechnet. Anhand dieses Vergleiches lassen sich synergetische
Effekte des jeweiligen Biokraftstoffes ableiten. Ein synergetischer Effekt soll in diesem Zusammenhang bedeuten, dass der restliche prozentuale Anteil an Ressourcen,
der nicht in die Synthese von Biomasse eingeht, einen höheren prozentualen Synthesefluss des Biokraftstoffes erlaubt, als zu erwarten wäre.
110
5.1. Material und Methoden
Für die Berechnung des optimalen Verhältnisses mit den maximalen synergetischen Effekten zwischen Biomasseproduktion und Kraftstoffsynthese wurde die folgende Funktion maximiert:
max
vmax
f uel
vmax
bio
vbio + v f uel ,
wobei v f uel und vbio die Syntheserate des jeweiligen Biokraftstoffs bzw. der Biomasse
darstellen. Somit wird gleichzeitig die Biomassebildung als auch die Biokraftstoffsynthese optimiert.
111
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
5.2. Ergebnisse und Diskussion
5.2.1. Stöchiometrische Modellierung von verschiedenen
Biokraftstoffsynthesen
Die Eignung eines potenziellen Biokraftstoffes wird neben der Toxizität und anderen
Faktoren hauptsächlich durch die maximale stöchiometrische Ausbeute im Verhältnis
zu dem jeweiligen Heizwert beschrieben. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die
maximale stöchiometrische Ausbeute anhand von genomskaligen Stoffwechselrekonstruktionen, zum Beispiel von Cyanobakterien [145], berechnet werden kann. Mithilfe
dieser Stoffwechselrekonstruktionen können relevante Faktoren für die Biosynthese,
wie stöchiometrisch optimale Synthesewege, identifiziert werden. Die Flussbilanzanalyse (Flux Balance Analysis) (FBA) ermöglicht es, durch die Anwendung der linearen
Programmierung auf biologische Probleme, optimale Flussverteilungen anhand von
Stöchiometrie und anderen Kriterien, die den Lösungsraum einschränken, zu berechnen [229].
Unter Verwendung der Rekonstruktion und dem stöchiometrischen Modell des Stoffwechsels von Synechocystis sp. PCC 6803 (siehe Kapitel 2) und der FBA konnten für
neun Biokraftstoffe mehrere stöchiometrische Eigenschaften berechnet werden (siehe
Tabelle 5.3). Der Fokus lag dabei auf den Biokraftstoffen Ethanol, Ethylen, Propan,
Butanol, Isopren, Pentadecan, Heptadecan, Octadecansäure und Octadecanol.
Die untersuchten Produkte unterscheiden sich in Bezug auf die Anzahl an Kohlenstoffatomen und deren Heizwert (Hi ). Zuerst wurden die metabolischen Anforderungen berechnet, um ein Molekül des jeweiligen Biokraftstoffes zu synthetisieren,
ohne dabei ein Zellwachstum zu berücksichtigen. Von besonderem Interesse sind hierbei die Anzahl der involvierten Reaktionen, die Photonenanzahl, die Freisetzung von
molekularem Sauerstoff, der Bedarf an NADPH und ATP sowie der Fluss durch die
RuBisCO-Carboxylase-Reaktion.
Tabelle 5.3.: Stöchiometrische Eigenschaften der neun analysierten Biokraftstoffe jeweils pro Molekül
Biokraftstoff. Aufgeführt sind dabei die Anzahl der Kohlenstoffatome (C-Atome), der Heizwert (Hi ), die
Anzahl der Reaktionen im Netzwerk, die bei 100-prozentiger Biokraftstoffsynthese einen Fluss tragen,
der Bedarf an Photonen, NADPH und ATP, die Anzahl der produzierten Sauerstoffmoleküle (O2 ) und der
fixierten CO2 -Moleküle durch RuBisCO sowie die maximal mögliche Biokraftstoffsyntheserate und der
jeweilige Energiegewinn.
Biokraftstoff
CAtome
Ethanol
2
Ethylen
2
Propan
3
Butanol
4
Isopren
5
Pentadecan
15
Heptadecan
17
Octadecansäure 18
Octadecanol
18
112
Hi
[kJ mol-1 ]
Reaktionen
Photonen
NADPH
1370
1410
2220
2670
3200
10000
11400
11300
11820
51
82
66
62
66
92
96
92
93
24
61
52
48
56
196
220
208
216
6
9,5
13
12
13
49
55
52
54
ATP
ATP:
NADPH
O2
5
19,5
12
12
17
55
62
62
62
0,83
2,05
0,92
1,00
1,31
1,12
1,13
1,19
1,15
3
6
5,5
6
7
23,5
26,5
26
27
RuBisCO
max
Synthesefluss
[mol gDW-1 h-1 ]
Energiegewinn
[J gDW-1 h-1 ]
2
6
4
4
6
16
18
18
18
6,49E-04
2,55E-04
2,99E-04
3,24E-04
2,78E-04
7,21E-05
7,49E-05
7,08E-05
7,94E-05
888,79
359,90
664,72
866,08
889,71
720,83
853,36
799,73
938,97
5.2. Ergebnisse und Diskussion
Der Wert der RuBisCO-Carboxylase-Reaktion kann sich von der Anzahl der Kohlenstoffmoleküle pro Einheit des Biokraftstoffes unterscheiden, da oft CO2 oder andere
Nebenprodukte während der Biosynthese des Produktes frei werden und der Kohlenstoff neu fixiert wird. Um die theoretische Ausbeute der untersuchten Biokraftstoffe
direkt zu vergleichen, ist zudem die maximale Syntheserate und der theoretische Energiegewinn in der Tabelle 5.3 aufgeführt.
Für einen definierten Lichteinfall besitzt Ethanol die höchste Syntheserate, gefolgt
von Butanol, Propan und Isopren. Anschließend folgen Pentadecan, Octadecansäure,
Octadecanol und Heptadecan. Es ist zu erkennen, dass eine klare Korrelation zwischen der Länge des Syntheseweges, der Photonen-Aufnahme, des NADPH- und ATPBedarfs, der O2 -Freisetzung und der maximalen Syntheserate existiert. Allerdings
zeigt die Länge des Syntheseweges keine Korrelation zu dem Verhältnis von ATP zu
NADPH. Bei einer genaueren Betrachtung des Verhältnis zwischen ATP und NADPH
ist zu erkennen, dass dieses zwischen 0,86 und 2,05 variieren kann. Die meisten der
betrachteten Biokraftstoffe weisen ein ähnliches Verhältnis auf (zwischen 0,86 und
1,31) mit Ausnahme von Ethylen, bei dessen Synthese mehr als doppelt soviel ATP
wie NADPH benötigt wird. Das optimale Verhältnis, welches durch den linearen Elektronenfluss an der Thylakoidmembran vorgesehen ist, liegt bei Simulationen im Modell bei 1,29. Bei den berechneten Werten aus Tabelle 5.3, welche dem maximalen
stöchiometrischen Potential entsprechen, ist zu beachten, dass diese in Abwesenheit
von konkurrierenden Stoffwechselwegen, eines basalen Energieverbrauchs (Maintenance) oder energieverschwendenden Zyklen erzielt wurden, welche natürlich diese
optimalen Werte beeinflussen können.
Der theoretische Energiegewinn ergibt sich aus dem maximalen Synthesefluss und
dem jeweiligen Heizwert des Biokraftstoffes. Aufgrund des hohen Heizwertes verfügt
Octadecanol über den höchsten Wert. Darauf folgen Isopren, Ethanol, Butanol, Heptadecan, Octadecansäure, Pentadecan, Propan und Ethylen. Es ist auszumachen, dass
die Alkane im Vergleich zu den Alkoholen, einen niedrigeren Energiegewinn aufweisen. Dieser Sachverhalt korreliert mit der Anzahl der freigesetzten Kohlenstoffatome
während der Synthese. Diese Tatsache lässt sich dadurch erklären, dass bei der Alkansynthese die Aldehyd-Decarbonylase (sll0208) [227] Methansäure freisetzt (siehe
Kapitel 5.1.1), wodurch vorher fixierter Kohlenstoff verloren geht und dadurch der
maximalen Synthesefluss verringert wird.
5.2.2. Trade-off zwischen Wachstum und Biokraftstoffsynthese
Für die Herstellung von Biokraftstoffen in großem Maßstab ist es wichtig, dass die produzierenden Zellen auch weiterhin lebensfähig bleiben. Eine vollkommene Biokraftstoffsynthese, bei der jegliche Ressourcen in die Kraftstoffsynthese fließen, wird in
vivo in der Zelle nicht durchführbar sein. Für ein Überleben der Zelle ist es notwendig,
dass die zellulären Funktionen, wie unter anderem ein minimales Zellwachstum und
ein zellulärer basaler Energieverbrauch (Maintenance), erhalten bleiben. Die Aufrechterhaltung dieser Funktionen kostet Energie und reduziert zwangsweise den Anteil,
113
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Abbildung 5.2.: Trade-off zwischen Wachstum und Biokraftstoffsynthese. Gezeigt ist die maximale Syntheserate der neun untersuchten Biokraftstoffe in Abhängigkeit zur Wachstumsrate beziehungsweise Biomassesynthese. Der lineare Verlauf zwischen maximaler Biokraftstoffsynthese und Biomassensynthese
ist als gestrichelte Hilfslinie eingezeichnet.
der in die Synthese des gewünschten Kraftstoffproduktes fließen kann. Ein reduzierter Ertrag des Zielprodukts ist die Folge.
Beginnend mit der optimalen Flussverteilung des Wildtyp-Wachstums, kann der
Fluss schrittweise zur Synthese des gewünschten Biokraftstoffes gelenkt werden. Die
maximale Wachstumsrate wird reduziert, bis alle zellulären Ressourcen in die Synthese des Biokraftstoffes fließen. Dabei ist es von Interesse, ob ein Optimum existiert, bei
dem ausreichend Biomasse gebildet werden kann, bei gleichzeitiger Maximierung der
Produktion des Biokraftstoffes. Bei Miteinbeziehung des Zellwachstums in die stöchiometrische Analyse ist zu erkennen, dass generell ein Trade-off zwischen der Synthese
der gewünschten Endprodukte und der Bildung von Biomasse besteht (dargestellt in
Abbildung 5.2).
Biokraftstoffe, bei denen wenig oder gar kein Kohlenstoff während der Synthese verloren geht, zeigen ein gutes Energie -Trade-off- Profil. Andere Biokraftstoffe, die einen
114
5.2. Ergebnisse und Diskussion
hohen Verlust von Kohlenstoffatomen während des Syntheseprozesses, im Vergleich
zu deren ursprünglicher Anzahl an Kohlenstoffatomen, aufweisen, wie zum Beispiel
Ethylen, besitzen ein sehr schlechtes Profil. Wenn Kohlenstoff verloren geht, ist der
Trade-off besser, wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome im jeweiligen Biokraftstoff
beziehungsweise das Verhältnis zwischen diesen und dem freigewordenen Kohlenstoff
hoch ist. Aber auch der hohe Bedarf an ATP und NADPH spielt eine wichtige Rolle, wodurch sich der maximale Synthesefluss stark verringert und somit auch der maximale
theoretische Energiegewinn niedrig bleibt.
Bei einer genauen Betrachtung der Trade-off-Profile (Abbildung 5.2) ist zu erkennen, dass der errechnete Biokraftstoffsynthesefluss (durchgezogene Linie) nicht exakt einem linearen Anstieg von der maximalen Biomassesynthese (Wachstumsrate)
gleicht, sondern dieser in den meisten Fällen etwas höher liegt. Der lineare Verlauf
(gestrichelte Linie) repräsentiert den zu erwartenden Synthesefluss. Dies bedeutet,
dass der prozentuale Anteil der Ressourcen, der nicht in das Wachstum fließt, zur Synthese des Kraftstoffes zum gleichen Anteil der maximalen Synthese zur Verfügung
steht. Bei einer 100-prozentigen Biomassesynthese würde dies beispielsweise 0 % der
maximalen Biokraftstoffsynthese bedeuten, bei 75 % Biomassesynthese dürften 25 %
der maximalen Kraftstoffsynthese erwartet werden. Die Simulationen ergeben jedoch,
dass eine höhere Biokraftstoffsynthese möglich ist, als zu erwarten wäre (siehe Abbildung 5.2). Ausschlaggebend für diesen Sachverhalt sind synergetische Effekte, die
zwischen der Synthese des Biokraftstoffes und der Biomasse auftreten. Diese Effekte
variieren in ihrem Ausmaß für die unterschiedlichen Biokraftstoffe bei unterschiedlichen prozentualen Syntheseraten. So sind zum Beispiel bei der Ethanolsynthese größere synergetische Effekte zu erkennen als bei der Ethylen- oder Isoprensynthese. Eine
genauere Analyse dieser Effekte wird im nächsten Abschnitt beschrieben.
5.2.3. Synergetische Effekte bei der Biokraftstoffsynthese
Bei der Analyse verschiedener Biokraftstoffe gibt es zweifelsohne einen Unterschied,
je nachdem ob die Synthese eines Kraftstoffes für sich separat betrachtet wird (wie in
Tabelle 5.3) oder sich diese in einem bereits etablierten biologischen System abspielt.
Bei Letzterem ist es von großem Interesse, welchen Einfluss die Synthese des Biokraftstoffes auf das System hat und welche Wechselwirkungen wiederum dabei existieren.
Insbesondere können Nebenprodukte, die während der Synthese des Biokraftstoffes
auftreten, bei einer simultanen Betrachtung des Zellwachstums zurück in den Stoffwechsel kanalisiert und dort für das Wachstum recycelt werden. Bei der Betrachtung
der Synthese des Biokraftstoffes ohne das Zellwachstum stellen diese Nebenprodukte,
wie zum Beispiel Methansäure, die während der Alkan-Synthese frei wird, eher eine
metabolische Belastung dar.
Für eine Untersuchung der synergetischen Wechselwirkung zwischen der Bildung
von Biomasse und Biosynthese des Biokraftstoffes wurde der Synthesefluss unter alleiniger Bildung des Biokraftstoffes mit dem Fluss, wenn das Zellwachstum auf einen
prozentualen Anteil des maximalen Wachstums festgelegt wird, verglichen. Der pro-
115
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Abbildung 5.3.: Analyse des Synergieeffekts der unterschiedlichen Biokraftstoffe. Für die neun Biokraftstoffe wurde jeweils die Biomassesynthese prozentual erhöht und simultan auf die Synthese des Biokraftstoffes optimiert. Die Synergie entspricht hierbei dem prozentualen Anteil der Biokraftstoffsynthese, der
über dem zu erwartenden Anteil liegt.
zentuale Anteil, der über dem restlichen, zu erwartenden Anteil des maximalen Flusses liegt, wird als Synergie ausgedrückt.
Um Rückschlüsse zu erhalten, bei welchem Verhältnis zwischen Biomasse und
Kraftstoffsynthese die größte Synergie herrscht, wurden beide Synthesen, also die von
Biomasse und Biokraftstoff, gleichzeitig optimiert und für jeden Biokraftstoff das Optimum berechnet. Dieses ermöglicht einen direkten Vergleich, welche Biokraftstoffe
die besten metabolischen und energetischen Vorteile im Idealfall und in einem der
Realität beziehungsweise des in vivo-Zustands nachempfundenen Fall besitzen. In Abbildung 5.3 sind die Synergiewerte für alle neun Biokraftstoffe in Abhängigkeit zum
Anteil der Biomassesynthese aufgetragen.
In Abbildung 5.3 ist zu erkennen, dass Ethanol, Propan und Butanol das Maximum
der Synergie bei einer prozentual höheren Biomasseproduktion (60-75 %) erreichen,
während zum Beispiel die Alkane wie Penta- und Hexadecan, die über eine AldehydDecarbonylase synthetisiert werden, eher im Bereich um 40-50 % ihr Maximum besitzen. Für die restlichen Kraftstoffe liegt das Maximum bei noch niedrigeren prozentualen Biomasseraten und auch der maximale Synergiewert an sich ist bei diesen
geringer.
Ein entscheidender Faktor, der in diese Analyse mit einfließt, ist das Verhältnis
zwischen ATP und NADPH, welches für die Synthese des jeweiligen Kraftstoffes benötigt wird. Ethanol, Propan und Butanol benötigen eher ein niedriges Verhältnis
von ≤ 1, wohingegen die restlichen Kraftstoffe mehr Moleküle ATP als NADPH benötigen. Im metabolischen Modell liefern die Photosysteme inklusive der Elektronentransportkette im optimalen Fall ein Verhältnis von 1,29:1. Dies hat zur Folge, dass
116
5.2. Ergebnisse und Diskussion
bei einer 100-prozentigen Biokraftstoffsynthese, die Elektronentransportkette nicht
optimal genutzt wird. Wenn jedoch zu einem bestimmten Anteil Biomasse simultan
synthetisiert wird - die Synthese von Biomasse besitzt ein ATP-NADPH-Verhältnis
von 2,13:1 - gewährleistet dies eine optimale Ausnutzung der Elektronentransportkette, wodurch der prozentuale Anteil der Biokraftstoffausbeute steigt und dementsprechend ein synergetischer Effekt im Modell erzielt wird.
Neben dem Verhältnis zwischen ATP zu NADPH spielen auch Nebenprodukte, die
während der Biokraftstoffsynthese entstehen und für das Wachstums genutzt werden
können, eine Rolle. Bei der Synthese der Alkane, also Propan, Pentadecan und Heptadecan, entsteht durch die Reaktion der Aldehyd-Decarbonylase (sll0208) [227] Methansäure. Bei einer 100-prozentigen Biokraftstoffsynthese, kann diese Methansäure nicht
weiter im Stoffwechsel genutzt werden und wird über die Reaktion der Formatdehydrogenase (sll1359) [119] zu CO2 oxidiert. Treten andererseits Biokraftstoff- und Biomassesynthese gleichzeitig auf, kann die während der Kraftstoffsynthese freigesetzte Methansäure durch die Reaktion der Phosphoribosylglycinamid-Transformylase 2
(EC 2.1.2.-) (purT, slr0861) für die Purinsynthese und daran anschließende Stoffwechselwege weiterverwendet werden, um effektiver Biomasse zu produzieren.
Bei der Analyse der Synergie ist zu beachten, dass für die Simulation alle zusätzlichen energieverbrauchenden Reaktionen, wie der basale ATP-Verbrauch (Maintenance), die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, die Mehler-ähnliche-Reaktion
oder die Zellrespiration, nicht festgelegt wurden und somit gleich null waren. Werden jedoch diese Prozesse bei der Simulation berücksichtigt und die Parameter für
die jeweiligen Reaktionen im Modell festgelegt, sind die synergetischen Effekte aller
Biokraftstoffe nur noch sehr gering.
5.2.4. Variabilitätsanalyse zur Identifikation von Schlüsselreaktionen bei der
Biokraftstoffsynthese
Neben der Betrachtung der einzelnen Biokraftstoffe auf Ebene des gesamten Netzwerkes (Systems) und dem Zusammenspiel zwischen deren Synthese und dem Zellwachstum, ist das Verhalten von einzelnen Reaktionen des metabolischen Netzwerkes von großem Interesse. Für eine gesteigerte Kraftstoffsynthese birgt die genetische
Manipulation des Organismus ein großes Potenzial. Dabei können Genüberexpression, Gen-Stilllegung (Gene Silencing) oder ganze Gen-Knockouts von metabolischen
Enzymen, durch das Umleiten des metabolischen Fluss hin zum gewünschten Produkt, helfen, den Ertrag des Biokraftstoffes zu erhöhen. Zur Identifikation solcher Zielgene beziehungsweise Schlüsselreaktionen (Gene Targets), deren Manipulation Auswirkungen auf die Kraftstoffsynthese haben, gewährt eine erneute Betrachtung der
Trade-off-Analyse zwischen der Biomasse- und der Biokraftstoffsynthese ein detaillierteres Bild.
Bei der Optimierung von bestimmten Zielfunktionen im Netzwerk birgt jede Reaktion eine gewisse Flussvariabilität in sich, das heißt es existieren eine obere und
eine untere Flussgrenze, die bei einer Optimierung der metabolischen Flüsse das Maximum der Zielfunktion gewähren. Mit einer Analyse dieser Variabilität erhält man
117
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Abbildung 5.4.: Variabilitätsanalyse von Reaktionen mit einer abfallenden Flussaktivität für die Synthese
von Ethylen. Gezeigt sind Reaktionen, deren Mittelwerte der Flussvariabilität mit prozentual zunehmender
Biokraftstoffsynthese abnehmen und bei maximaler Biokraftstoffsynthese noch einen Fluss tragen. Die
Beschreibungen der Reaktionsnummern beziehungsweise welche Reaktionen abgebildet sind, sind im
Anhang in der Tabelle A.4 aufgeführt.
Hinweise, welche Reaktionen im Netzwerk essentiell sind und welche Reaktionen verändert werden können, um die Biokraftstoffsynthese zu erhöhen.
Für das metabolische Netzwerkmodell von Synechocystis sp. PCC 6803 wurde die
Variabilitätsanalyse beim Übergang von der Biomassesynthese hin zur Biokraftstoffsynthese für alle neun analysierten Biokraftstoffe durchgeführt. Im Folgenden werden
stellvertretend für alle neun Biokraftstoffe die Ergebnisse am Beispiel der Synthese
von Ethylene aufgeführt und diskutiert.
Alle Reaktionen, die mit prozentual ansteigender Ethylensynthese an Aktivität verlieren beziehungsweise deren Mittelwerte der Flussvariabilität sich verringern und
die bei maximaler Biokraftstoffsynthese noch einen Fluss tragen, sind in Abbildung 5.4
gezeigt. Insgesamt sind dies für die Synthese von Ethylen acht Reaktionen, bei denen bei maximaler Biokraftstoffsynthese noch ein Fluss vorhanden ist. Davon sind
sechs Reaktionen (R464-R469) mit dem Cytochrom-b6 f -Komplex assoziiert, die Reaktion R492 steht für die Reaktion der ATPase und die Reaktion R670 repräsentiert die
Sauerstoffaufnahme im System. Diese Reaktionen beziehungsweise deren zugehörigen Gene stellen potenzielle Kandidaten für eine genetische Modifikation am Organismus dar, zum Beispiel in Form von Gen-Knockdown-Manipulationen, um den Fluss in
Richtung des gewünschten Produktes zu leiten und dessen Ausbeute zu steigern.
118
5.2. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 5.5.: Variabilitätsanalyse des Ethylen-bildenden Enzyms (EFE), der PEP-Carboxylase (PEPC)
und der Succinat-Dehydrogenase (SDH) für die Synthese von Ethylen. Bei allen drei Reaktionen steigt
der Mittelwert der Flussvariabilität mit prozentual zunehmender Ethylensynthese.
Die Anzahl der Reaktionen, die mit ansteigender Ethylensynthese an Aktivität gewinnen, ist mit 89 um ein vielfaches höher als die Reaktionen, die an Aktivität verlieren und bei maximaler Biokraftstoffsynthese noch einen Fluss tragen. Darunter sind
vor allem Reaktionen, die den metabolischen Fluss in Richtung des Produktes führen und Reaktionen, die Nebenprodukte, die bei einer erhöhten Biokraftstoffsynthese
auftreten, weiter im Stoffwechsel verarbeiten.
Bei einer genaueren Betrachtung der Reaktionen mit einem ansteigenden Fluss ist
es möglich, gezielt Schlüsselreaktionen zu identifizieren, die für eine gesteigerte Produktsynthese essentiell sind, beziehungsweise einen höheren Fluss tragen müssten,
als bei der Wildtyp-Flussverteilung (100 % Biomassesynthese). Für das Beispiel Ethylen sind hier kurz drei Reaktionen ausgewählt und dargestellt (siehe Abbildung 5.5).
Zum einen die Biokraftstoff-produzierende Reaktion an sich, im Fall von Ethylen das
Ethylen-bildende Enzym (EC 1.14.11.34) (EFE), aber auch unter anderem die Reaktion der PEP-Carboxylase (EC 4.1.1.31) (PEPC) und der Succinat-Dehydrogenase (EC
1.3.99.1) (SDH)
Für das EFE ergibt sich aus den Simulationen selbstredend ein linearer Zusammenhang zwischen Aktivität und Biokraftstoffsynthese. Je höher die Flussrate durch diese
Reaktion verläuft, desto mehr Ethylen wird produziert. Da dies die einzig Ethylenproduzierende Reaktion im Netzwerk symbolisiert, ergibt sich auch keine Variabilität
innerhalb des Flusses dieser Reaktion.
Die PEPC carboxyliert Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat, welches ein essentielles
Ausgangsprodukt für den TCA-Zyklus in vielen Organismen darstellt. Ohne die PEPC
ist kein Fluss über den TCA-Zyklus bei Synechocystis möglich und wichtige Komponenten des Stoffwechsels, wie Aminosäuren oder Cofaktoren, könnten nicht synthetisiert werden. Für das Ethylen-bildende Enzym sind 2-Oxoglutarat und Arginin die
Hauptsubstrate. Die Synthese von Arginin verläuft von 2-Oxoglutarat über Glutamat
zu Arginin. Somit stellt 2-Oxoglutarat den wichtigsten Ausgangsmetaboliten für die
Synthese von Ethylen im Stoffwechsel dar. Demzufolge ist eine erhöhte Aktivität des
TCA-Zyklus inklusive der PEPC notwendig, um den Fluss über das EFE zu erhöhen.
Die Reaktion des EFE produziert nicht nur ausschließlich Ethylen, sondern auch
zu einem gewissen Anteil Succinat (siehe Abbildung 5.1 oder Tabelle 5.1). Um dieses
119
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Nebenprodukt wieder zurück in den Stoffwechsel zu kanalisieren, müssen die entsprechenden Reaktionen auch einen erhöhten Fluss führen. Für den Fall von Succinat ist
daran unter anderem die SDH beteiligt. Sie katalysiert die Oxidation von Succinat
zu Fumarat mit FAD als Elektronenakzeptor und stellt somit den ersten Schritt beim
Wiederverwerten von Succinat dar. Am Beispiel der SDH wird deutlich, dass nicht
nur eine erhöhte Aktivität der zum Biokraftstoff hinführenden Reaktionen von Bedeutung ist, sondern auch Reaktionen, die obligatorische Nebenprodukte, die bei einer
gesteigerten Biokraftstoffsynthese unausweichlich auftreten, weiterverarbeiten, eine
essentielle Aufgabe übernehmen.
Beide Enzyme, die PEPC und die SDH repräsentieren potenzielle Ziele für zum
Beispiel eine Genüberexpression, damit genügend Ausgangsstoffe für die Ethylensynthese bereitgestellt werden, aber auch vermehrt auftretende Nebenprodukte abgebaut
werden können.
120
5.3. Schlussfolgerungen
5.3. Schlussfolgerungen
hototrophe Mikroorganismen bergen das große Potenzial als eine Ressource zur
Gewinnung und Erzeugung von hochwertigen Produkten und Biokraftstoffen,
einfach nur mit der Hilfe von atmosphärischem Kohlenstoffdioxid, Sonnenlicht
und einigen Nährstoffen, zu dienen. In dieser Hinsicht haben Cyanobakterien als ein
möglicher Ausgangspunkt zur Erzeugung von Biokraftstoffen (der vierten Generation),
in jüngster Zeit auf sich aufmerksam gemacht.
P
Cyanobakterien- und Mikroalgen-Systeme haben viele Vorteile gegenüber den herkömmlichen und traditionellen Nutzpflanzen und ihre Etablierung könnte in naher
Zukunft auch aus wirtschaftlicher Sicht möglich sein, wenn die letzten biotechnischen,
umwelttechnischen und wirtschaftlichen Hürden überwunden werden. Letztendlich
zeigen die Ergebnisse, dass Cyanobakterien das Potenzial aufweisen, als ein nachhaltiger Faktor im System von erneuerbaren Energien aufzutreten, um somit bei der
Suche nach alternativen Energiequellen zur Eindämmung der globalen Erwärmung
dienlich zu sein.
Für die Etablierung eines Cyanobakteriensystems kann eine theoretische Modellierung zur Eignung und Verbesserung des produzierenden Organismus von großem
Interesse sein. Um reale Vorhersagen für die Produktivität einzelner Organismen zu
treffen, wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass durch die Rekonstruktion metabolischer
Netzwerke und deren Analyse unter Nutzung zum Beispiel der Flussbilanzanalyse
(Flux Balance Analysis), welches ein kraftvolles Werkzeug zur Analyse metabolischer
Prozesse und deren Optimierung darstellt, konkrete Aussagen und Vorhersagen getroffen werden können. Zwischen der maximalen theoretischen Ausbeute der flüssigen
Brennstoffe oder Chemikalien, die anhand des stöchiometrischen Potenzials berechnet
wurden und der experimentell beobachteten Ausbeute, existieren nur geringe Unterschiede [230].
Neben der Vorhersage über die theoretische Ausbeute des gewünschten Biokraftstoffes, ermöglicht die stöchiometrische Modellierung, die Eignung eines Organismus,
in Bezug auf Integration in den vorherrschenden Stoffwechsel, zu analysieren (Stammauswahl). Dies beinhaltet zum Beispiel, ob synergetische Effekte zwischen der Produktsynthese und dem Zellwachstum beziehungsweise dem Zellstoffwechsel des Wildtyps existieren. Natürlich sollte dies nicht ausschließlich als ausschlaggebendes Kriterium bei der Wahl für den Organismus und für den Biokraftstoff gesehen werden,
jedoch ist der Informationsgehalt einer solchen Analyse nicht unwichtig. Schließlich
stellen neu integrierte Stoffwechselwege, die in ein bestehendes System eingebracht
werden, eine biologische Belastung für den Organismus dar und je entfernter der gewünschte Zustand des Stoffwechsels zum Wildtyp-Stoffwechsel liegt, um so unwahrscheinlicher ist eine erfolgreiche Integration inklusive einer hohen Ausbeute.
Abgesehen von der Betrachtung des gesamtheitlichen Systems besteht außerdem
die Option, eine detaillierte Analyse bis hinunter zur Ebene der einzelnen Enzyme
und Reaktionen durchzuführen, um zentrale Punkte und potenzielle Bottlenecks, die
bei der Biokraftstoffsynthese relevant sind, zu identifizieren. Unter Verwendung der
121
Kapitel 5. Modellierung verschiedener Biokraftstoffsynthesen in Cyanobakterien
Variabilitätsanalyse konnte am Beispiel von Ethylen gezeigt werden, welche spezifischen Reaktionen für eine Kraftstoffsynthese von Bedeutung sind, um diese als Kandidaten oder Ziele für eine mögliche genetische Manipulation auszumachen (siehe Abbildung 5.5). Eine solche Manipulation umfasst für Reaktionen, die einen erhöhten
Fluss für die Biokraftstoffsynthese aufweisen, eine Überexpression des entsprechenden Gens oder die Reaktionen, die für eine optimale Produktsynthese eine verringerte
Flussrate ausweisen sollten, ein Kockout oder Knockdown des zugehörigen Gens.
Es stellte sich heraus, dass nicht nur Reaktionen, die offensichtlich zum gewünschten Zielprodukt führen oder in direkter Nachbarschaft als relevant angesehen wurden,
sondern auch nicht offensichtliche Reaktionen, die nicht direkt mit der Kraftstoffsynthese verbunden sind und in anderen Bereichen des Stoffwechsels agieren, in Betracht
gezogen werden müssen.
Durch eine Modellierung des gesamten Syntheseprozesses innerhalb eines genomskaligen metabolischen Netzwerkes rücken auch Reaktionen in den Fokus, die nicht
unmittelbar an der Synthese des Biokraftstoffes beteiligt sind und deren Aktivität
auf den ersten Blick nicht direkt ersichtlich ist. Zum Beispiel solche Reaktionen, die
obligat auftretende Nebenprodukte des Syntheseweges verwenden, um sie in den Zentralstoffwechsel des Organismus zurückführen, wo sie noch von Nutzen sind und zum
Beispiel das Zellwachstum fördern können.
Natürlich dient ein gut kuratiertes metabolisches Netzwerk nicht nur als Ausgangspunkt zu einer Modellierung mittels der Flussbilanzanalyse. Es hilft besonders bei
der Sichtung und Auswahl eines optimalen Produktionsstammes für die Synthese des
gewünschten Biokraftstoffes, da für die Rekonstruktion nur die annotierte Genomsequenz als Ausgangspunkt dient und diese bereits für viele phototrophe Organismen
vorhanden ist.
122
KAPITEL
6
Resümee und Ausblick
123
Kapitel 6. Resümee und Ausblick
Resümee und Ausblick
is zu einem detaillierten Verständnis des Stoffwechsels von Cyanobakterien
steht aufgrund der Komplexität dieser Thematik noch ein sehr langer Weg bevor. Eine sehr wichtige Fragestellung besteht dabei in der Klärung des grundlegenden phototrophen Wachstums dieser Organismen, aber auch die Verknüpfung
des Übergangs von einem phototrophen Wachstum am Tage hin zu einem Stoffwechsel
bei Abwesenheit von Licht. Dabei ist vor allem interessant, welche zeitlichen Prozesse
im Stoffwechsel ablaufen und wie diese koordiniert werden.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine genomskalige Modellierung des
Stoffwechsels dazu beitragen kann, das grundlegende Verständnis zu fördern und
wichtige Erkenntnisse in Bezug auf den cyanobakteriellen Stoffwechsel zu gewinnen.
Für die Analyse eines genomskaligen metabolischen Netzwerkes hat sich hierbei die
Flussbilanzanalyse als sehr hilfreiche Methode herausgestellt.
Sie ermöglicht die Vorhersage von konkreten Wachstumsraten sowie die Untersuchung der Einflüsse diverser Netzwerktopologien auf die optimale Verteilung der internen Stoffwechselflüsse. Zudem können auch komplexere Stoffwechselszenarien mit
unterschiedlichen Eingangsparametern analysiert werden, wie unter anderem bei einer Simulation des Überganges vom Stoffwechsel bei Abwesenheit von Licht hin zum
phototrophen Wachstum oder die Modellierung eines kompletten Tagesverlaufs.
Zudem kann ein genomskaliges Modell des Stoffwechsels eines Organismus als ein
Sammelwerk für jegliches Wissen über den Stoffwechsel dienen und somit zum allgemeinen Verständnis des Stoffwechsels beitragen. Dabei können die Erkenntnisse aus
der Rekonstruktion und die Ergebnisse der Modellierung aus der Flussbilanzanalyse
dazu beitragen, biologische Fragen in einem systematischen Kontext zu sehen und
die Einflüsse einzelner Änderungen, zum Beispiel durch eine genetische Manipulation, auf den gesamten Stoffwechsel zu betrachten. Unstimmigkeiten und Widersprüche, die sich innerhalb des Rekonstruktions- und Analyseprozesses ergeben, können
tiefgreifende Diskussionen anregen und in Kombination mit den Informationen aus
dem metabolischen Modell als Wissensbasis und gleichsam als Ausgangspunkt für
weitere Forschungsansätze dienen, um durch weitere Analysen oder experimentelle
Ansätze das Wissen über den Stoffwechsel der Cyanobakterien zu vermehren und zu
verfeinern. Eine der Stärken der genomskaligen Rekonstruktion und der Flussbilanzanalyse liegt darin, dass im Vorfeld sehr wenige bis gar keine experimentellen Daten
benötigt werden und nur die annotierte Genomsequenz als Ausgangsbasis dient.
Ein weiterer interessanter Punkt zu einem verbesserten Verständnis des Stoffwechsels von Cyanobakterien liegt in der Betrachtung der Diversität dieses Phylums. Denn
trotz des engen Verwandtschaftsgrades innerhalb der Cyanobakterien, herrscht selbst
in den zentralen Teilen des Stoffwechsels ein hohes Maß an Vielfalt und metabolischem Potenzial.
Unter diesem Aspekt könnte eine Modellierung von mehreren Cyanobakterienstämmen, in Kombination mit Daten über die Zusammensetzung der Biomasse und des
Zellwachstums der unterschiedlichen Stämme, weitere Aufschlüsse über den Stoff-
B
124
wechsel der Cyanobakterien liefern. Natürlich weisen die unterschiedlichen Cyanobakterienstämme unterschiedliche Lebensrhythmen, ökologische Lebensräume und Zellformen auf. In dieser Hinsicht ist zu nennen, dass zum Beispiel diazotrophe, einzellige
Cyanobakterien, wie die Gattung Cyanothece, andere Kriterien für ihren Tagesrhythmus beziehungsweise die zeitliche Koordinierung des Stoffwechsels aufweisen als filamentöse Cyanobakterien, die verschiedene Zelltypen ausbilden, wie unter anderem
die Heterocysten bei der Gattung Anabaena. Aus diesen Gründen scheinen auf den
ersten Blick die unterschiedlichen Stämme schwer miteinander vergleichbar zu sein,
doch es ist zu bedenken, dass die meisten Cyanobakterien eine annähernd gleiche
Lebensweise aufweisen. Es wäre somit eine annehmbare Herausforderung, die unterschiedlichsten Stämme auf Ebene der Stoffwechselmodellierung gegenüberzustellen
und die metabolischen Abläufe innerhalb der Zelle zu vergleichen.
Eine solche umfassende Modellierung von verschiedenen Stämmen gewährt zudem
einen wichtigen Ausgangspunkt für die Stammwahl bei der cynaobakteriellen Produktsynthese. In diesen Zusammenhang unterstützt eine Analyse des metabolischen
Potenzials eines Stammes, zum Beispiel wie in dieser Arbeit anhand der Flussbilanzanalyse zur Untersuchung der Biokraftstoffsynthese gezeigt, dabei, die geeignete
Organismus-Produkt-Kombination im Vorfeld auszuwählen und die Synthese des gewünschten Produktes zu optimieren, um zusammen eine erhöhte Produktausbeute zu
erzielen. Ein solcher Schritt bietet einen großen Vorteil für die industrielle Produktion
dieser Stoffe mithilfe von Cyanobaktieren.
125
ANHANG
A
Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
127
Anhang A. Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Tabelle A.1.: Stoffwechselreaktionen für das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803,
die zur Zeit der Rekonstruktion in Datenbanken oder der Literatur nicht verfügbar waren. Für die jeweiligen
Reaktionen konnten keine spezifischen Gene im Genom von Synechocystis sp. PCC 6803 identifiziert
werden. Die Integration dieser Reaktionen in das metabolische Netzwerk erfolgte, um die entsprechenden
Stoffwechselwege zu vervollständigen.
ECNummer
Reaktion
Stoffwechselweg
Bemerkung
-
ATP + L-Aspartat + L-Glutamin + H2 O => AMP + Diphosphat +
L-Asparagin + L-Glutamat
Phosphatidylglycerophosphat + H2 O => Phosphatidylglycerol + Orthophosphat
3-D-Glucosyl-1,2-Diacylglycerol <=> 1,2-Diacyl-3-β-D-Galactosylsn-Glycerol
3-D-Glucosyl-1,2-Diacylglycerol <=> 1,2-Diacyl-3-β-D-Galactosylsn-Glycerol
Acetyl-CoA + L-Homoserin => CoA + O-Acetyl-L-Homoserin
Asparagin
Es konnt kein Enzym identifiziert werden
Glycerolipid
Es konnte kein Enzym identifiziert werden
Glycerolipid
unbekannte Epimerase [231]
Glycerolipid
unbekannte Epimerase [231]
Methionin
2.5.1.49
O-Acetyl-L-Homoserin + Hydrogen sulfid => L-Homocystein + Acetat
Methionin
4.1.1.50
2.7.7.9
S-Adenosyl-L-Methionin + H+ => S-Adenosylmethioninamin + CO2
UTP + D-Glucose-1-Phosphat <=> Diphosphat + UDP-Glucose
Methionin
Glucose
3.6.1.54
UDP-2,3-Bis(3-Hydroxytetradecanoyl)glucosamin + H2 O => UMP +
Lipid X
5’-Deoxyadenosin + H2 O => 5-Deoxy-D-Ribose + Adenin
Lipid
ADisaccharid
Purin
Es konnte kein Stoffwechselweg für die Methioninsynthese identifiziert werden, für das Modell wurde der
Stoffwechselweg von Microcystis aeruginosa NIES-843
übernommen
Es konnte kein Stoffwechselweg für die Methioninsynthese identifiziert werden, für das Modell wurde der
Stoffwechselweg von Microcystis aeruginosa NIES-843
übernommen
Es konnte kein Enzym identifiziert werden [232]
Es konnte keine UDP-Glucose-Phosphorylase (2.7.7.9.)
identifiziert werden
Es konnte kein Enzym identifiziert werden
3.1.3.27
2.3.1.31
-
S-Adenosylmethioninamin + Putrescin => 5’-Methylthioadenosin +
Spermidin + H+
2.5.1.16
S-Adenosylmethioninamin + Spermidin => 5’-Methylthioadenosin
+ Spermin + H+
ATP + 4-Amino-2-Methyl-5-Phosphomethylpyrimidin => ADP + 2Methyl-4-Amino-5-Hydroxymethylpyrimidin diphosphat
1.2.1.72
D-Erythrose-4-Phosphat + NAD+ + H2 O => 4-Phospho-DErythronat + NADH + H+
1.1.1.290 4-Phospho-D-Erythronat + NAD+
=> 2-Oxo-3-Hydroxy-4Phosphobutanoat + NADH + H+
2.6.1.52
O-Phospho-4-Hydroxy-L-Threonin + 2-Oxoglutarat <=> 2-Oxo-3Hydroxy-4-Phosphobutanoat + L-Glutamat
1.14.13.83 Precorrin 3A + Oxygen + NADH + H+ => Precorrin 3B + NAD+ +
H2 O
2.5.1.16
128
Spermidin
unbekannte Nukleosidase; wird im Modell für den Abbau von 5’-Deoxyadenosin benötigt
Es konnte kein Enzym identifiziert werden [232]
Spermidin
Es konnte kein Enzym identifiziert werden [232]
ThiaminPyrophosphat
Vitamin B6
Es konnte kein Enzym identifiziert werden
Vitamin B6
Es konnte kein Enzym identifiziert werden [233]
Vitamin B6
Es konnte kein Enzym identifiziert werden [233]
Vitamin B12
Es konnte kein Enzym für eine Precorrin-3B-Synthase
identifiziert werden [234]
Es konnte kein Enzym identifiziert werden [233]
Tabelle A.2.: Stoffwechselreaktionen für das metabolische Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803,
die zur Zeit der Rekonstruktion in Datenbanken nicht verfügbar waren. Die Identifizierung dieser Reaktionen erfolgte über die entsprechende Literatur oder über eine BLAST-Suche. Die Beleg-Spalte gibt jeweils
die Art der Informationsquelle an: B) Beleg direkt in der Primärliteratur, C) das entsprechende Gen konnte mittels einer BLAST-Suche identifiziert werden, D) ungeklärtes Enzym mit potenzieller metabolischer
Funktion oder Funktion von einem anderen Organismus übertragen.
Gen
ECReaktion
Nummer
Stoffwechselweg
Beleg Bemerkung
sll1336
slr1022
3.5.3.6
2.6.1.13
Arginin
Arginin
B
B
[235]
[235]
slr0782
1.4.3.4
Arginin
B
Arginin-Dehydrogenase [236]
slr0782
1.4.3.4
Arginin
B
Arginin-Dehydrogenase [236]
-
-
Arginin
B
spontan [235]
sll1077
oder
sll0228
sll0428
oder
sll0191
3.5.3.7
Arginin
B
[235]
Prolin
C
sll1713
4.1.1.81
L-Threonin O-3-Phosphat => D-1-Aminopropan-2-ol OPhosphat + CO2
Threonin
C
sll1237
1.3.3.4
2 Protoporphyrinogen IX + 3 Oxygen <=> 2 Protoporphyrin + 6 H2 O
Chlorophyll
C
slr1923
1.3.1.75
Chlorophyll
B
slr1979
2.6.1.85
Divinylprotochlorophyllid + NADPH + H+ => Protochlorophyllid + NADP+
Chorismat
+
L-Glutamin
=>
4-Amino-4Deoxychorismat + L-Glutamat
BLAST: sll0428 57 % Ident., 257 Score, E-Wert
8 e-70 und sll0191 48 % Ident., 197 Score, EWert 8 e-52 Prolyl-Hydroxylase von Trichodesmium erythraeum IMS101
BLAST: Ident., 57.5 %, Score, 414, E-Wert e-117
zu Threonin-Phosphat-Decarboxylase von Anabaena variabilis ATCC 29413
BLAST: Ident., 54%, Score, 308, E-Wert 4e-85
zu Protoporphyrinogen-Oxidase von Anabaena
sp. PCC 7120
[237], [238]
Folat
C
slr2141
1.5.1.20
5-Methyltetrahydrofolat
+
NADP+
<=
Methylenetetrahydrofolat + NADPH + H+
5,10-
Folat
C
slr0091
1.2.1.3
Folat
D
slr2026
1.5.1.3
Glycolaldehyd + NAD+ + H2 O => Glycolat + NADH +
H+
Tetrahydrofolat + NADP+ <= Dihydrofolat + NADPH +
H+
Folat
D
slr2141
1.5.1.20
5-Methyltetrahydrofolat
+
NAD+
Methylenetetrahydrofolat + NADH + H+
Folat
C
2 Glutathion + NADP+ <=> Glutathion disulfid +
NADPH + H+
Allgemein
B
BLAST: 63.5 % Ident., 574 Score, E-Wert e-165
zu Para-Aminobenzoat-Synthase-Komponente
I von Cyanothece sp. PCC 8801
BLAST: 75 % Ident., 450 Score, E-Wert e-128 zu
Methylenetetrahydrofolat-Reduktase von Cyanothece sp. PCC 8801
könnte durch eine Aldehyd-Dehydrogenase
1.2.1.21 katalysiert werden
slr2026 kodiert für FoIP (2.5.1.15 ), welche als
eine Dihydropteroat-Reduktase (1.5.1.3) fungieren kann (in H. Pylori) [239]
BLAST: 75 % Ident., 450 Score, E-Wert e-128 zu
Methylenetetrahydrofolat-Reduktase von Cyanothece sp. PCC 8801
[240]
1.2759 sn-Glycerol 3-Phosphat + 1.3302 Hexadecanoyl[acp] + 0.0774 Hexadecenoyl-[acp] + 0.0034
Octadecanoyl-[acp] + 0.0635 Oleoyl-[acyl-carrierProtein + 0.4236 Linoleoyl-[acp] + 0.6315 gammaLinolenoyl-[acp] + 0.0032 alpha-Linolenoyl-[acp] +
0.0190 Stearidonoyl-[acp] => Phosphatidat + 2.5518
Acyl-carrier-Protein
1.2954 sn-Glycerol 3-Phosphat + 1.3061 Hexadecanoyl[acp] + 0.0965 Hexadecenoyl-[acp] + 0.0223
Octadecanoyl-[acp] + 0.0584 Oleoyl-[acyl-carrierProtein + 0.3334 Linoleoyl-[acp] + 0.7253 gammaLinolenoyl-[acp] + 0.0095 alpha-Linolenoyl-[acp] +
0.0393 Stearidonoyl-[acp] => Phosphatidat + 2.5908
Acyl-carrier-Protein
1.3747 sn-Glycerol 3-Phosphat + 1.5612 Hexadecanoyl[acp] + 0.1804 Hexadecenoyl-[acp] + 0.0434
Octadecanoyl-[acp] + 0.4011 Oleoyl-[acyl-carrierProtein + 0.5331 Linoleoyl-[acp] + 0.0228 gammaLinolenoyl-[acp] + 0.0165 alpha-Linolenoyl-[acp] =>
Phosphatidat + 2.7494 Acyl-carrier-Protein
1.32535
sn-Glycerol
3-Phosphat
+
1.3327
Hexadecanoyl-[acp] + 0.0227 Hexadecenoyl-[acp] +
0.0457 Octadecanoyl-[acp] + 0.1701 Oleoyl-[acylcarrier-Protein + 0.8637 Linoleoyl-[acp] + 0.2158
gamma-Linolenoyl-[acp] => Phosphatidat + 2.6507
Acyl-carrier-Protein
Phosphatidat + H2 O => 1,2-Diacyl-sn-Glycerol + Orthophosphat
Glycerolipid
-
kombinierte Reaktion von 2.3.1.15 und 2.3.1.51
Glycerolipid
-
kombinierte Reaktion von 2.3.1.15 und 2.3.1.51
Glycerolipid
-
kombinierte Reaktion von 2.3.1.15 und 2.3.1.51
Glycerolipid
-
kombinierte Reaktion von 2.3.1.15 und 2.3.1.51
Glycerolipid
B
[241]
1.14.11.2 L-Prolin + 2-Oxoglutarat + Oxygen => trans-4Hydroxy-L-Prolin + Succinat + CO2
slr0600, slr1562,
ssr2061
sll1973, slr1510,
sll1848
sll1973, slr1510,
sll1848
sll1973, slr1510,
sll1848
sll1973, slr1510,
sll1848
sll0545
L-Arginin + H2 O => L-Citrullin + NH3
L-Ornithin + 2-Oxoglutarat <=> L-Glutamat 5Semialdehyd + L-Glutamat
L-Arginin + PQ + H2 O => 5-Guanidino-2Oxopentanoat + NH3 + PQH2
L-Arginin + PQ + H2 O => 5-Guanidino-2Oxopentanoat + NH3 + PQH2
5-Guanidino-2-Oxopentanoat
+
H2 O2
=>
4Guanidinobutanoat + CO2 + H2 O
4-Guanidinobutanoat + H2 O => 4-Aminobutanoat +
Urea
3.1.3.4
<=
5,10-
129
Anhang A. Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
sll0545
3.1.3.4
Phosphatidat + H2 O => 1,2-Diacyl-sn-Glycerol + Orthophosphat
Phosphatidat + H2 O => 1,2-Diacyl-sn-Glycerol + Orthophosphat
2.4.1.UDP-6-Sulfoquinovosdiacylglycerol + 1,2-Diacyl-snGlycerol => Sulfoquinovosyldiacylglycerol + UDP
2.4.1.157 UDP-Glucose + 1,2-Diacyl-sn-Glycerol => UDP + 3-DGlucosyl-1,2-Diacylglycerol
2.4.1.157 UDP-Glucose + 1,2-Diacyl-sn-Glycerol => UDP + 3-DGlucosyl-1,2-Diacylglycerol
2.1.1.152 Precorrin 6X + Acetat + S-Adenosyl-L-Homocystein <=
Precorrin 5 + S-Adenosyl-L-Methionin + H2 O
Glycerolipid
B
[241]
3.1.3.4
Glycerolipid
B
[241]
Glycerolipid
B
[242]
Glycerolipid
B
[231]
Glycerolipid
B
[231]
Vitamin B12
C
sll0895
3.1.3.7
D
1.1.1.81
Glyoxylat
B
slr0229
1.1.1.60
Glyoxylat
B
[119]
sll1981
sll1556
sll0006
slr0633
4.1.1.47
1.2.3.5
2.6.1.4
1.4.3.19
Adenosin 3’,5’-Bisphosphat + H2 O => AMP + Orthophosphat
D-Glycerat + NADP+ <=> Hydroxypyruvat + NADPH
+ H+
D-Glycerat + NADP+ <= Tartronat-Semialdehyd +
NADPH + H+
2 Glyoxylat => Tartronat-Semialdehyd + CO2
Glyoxylat + Oxygen + H2 O => Oxalat + H2 O2
Glycin + 2-Oxoglutarat <=> Glyoxylat + L-Glutamat
Glycin + H2 O + Oxygen => Glyoxylat + NH3 + H2 O2
Sulfat
sll1908
BLAST: Ident., 57.1 %, Score, 356, E-Wert e-104
zu Cobalt-Precorrin-6A-Synthase von Trichodesmium erythraeum IMS101
sll0895 kodiert für CysQ, welches in vielen Organismen als 3.1.3.7 fungiert
[119]
Glyoxylat
Glyoxylat
Glyoxylat
Glyoxylat
B
B
B
C
sll0895
3.1.3.7
D
6.3.2.2
3’-Phosphoadenylyl sulfat + H2 O => Adenylyl sulfat +
Orthophosphat
ATP + L-Glutamat + L-Cystein => ADP + Orthophosphat + gamma-L-Glutamyl-L-Cystein
Sulfat
slr0990
Glutathion
C
slr1124
3.1.3.3
O-Phospho-L-Serin + H2 O => L-Serin + Orthophosphat
Serin
B
slr1211
6.6.1.2
Hydrogenobyrinat a,c diamid + Cobalt ion + ATP +
H2 O => Cob(II)yrinat a,c diamid + Orthophosphat +
ADP + H+
3.1.3.24 Sucrose-6’-Phosphat + H2 O => Sucrose + Orthophosphat
3.1.3.15 L-Histidinol-Phosphat + H2 O => L-Histidinol + Orthophosphat
2.3.1.182 Acetyl-CoA + Pyruvat + H2 O => (R)-2-Methylmalat +
CoA
Vitamin B12
D
Zucker
B
[119]
[119]
[119]
BLAST: Ident., 70.6 %, Score, 936, E-Wert
0.0 zu Glycin-Oxidase von Cyanothece sp. PCC
8801
sll0895 kodiert für CysQ, welches in vielen Organismen als 3.1.3.7 fungiert
BLAST Search: 68 % Ident., 540 Score„ E-Wert
e-155 zu Glutamat-Cystein-Ligase von Cyanothece sp. PCC 8801
BLAST: Ident., 31 %, Score, 102, E-Wert 2e-23
zu PspA von Hydrogenobacter thermophilus
[131]
slr2026 kodiert für FoIP (2.5.1.15 ), welche als
eine Dihydropteroat-Reduktase (1.5.1.3) fungieren kann (in H. Pylori) [239]
[243]
Histidin
C
Pyruvat
B
BLAST: 56 % Ident., 189 Score, E-Wert e-49 zu
hisB vonCyanothece sp. ATCC 51142
[224]
5.5.1.4
5.5.1.4
3.1.3.25
Inositol
Hem
Inositol
B
B
B
[244]
[245]
[246]
Lipid
B
desC, ∆9 -Desaturase [247, 248]
Lipid
B
desC, ∆9 -Desaturase [247, 248]
sll0545
slr0384
sll1377
sll1377
slr1538
slr0953
sll0084
sll1564
oder
slr0186
sll1722
sll1981
sll1959
sll0541
1.14.19.1
sll0541
1.14.19.1
slr1508
2.4.1.184
sll0262
1.14.19.3
sll1441
1.14.19.-
sll0262
1.14.19.3
sll1363
1.1.1.86
sll1833
D-Glucose-6-Phosphat => 1D-Myo-Inositol 3-Phosphat
D-Glucose-6-Phosphat => 1D-Myo-Inositol 3-Phosphat
1D-Myo-Inositol 3-Phosphat + H2 O => myo-Inositol +
Orthophosphat
Hexadecanoyl-[acp] + NADPH + H+ + Oxygen <=>
Hexadecenoyl-[acp] + NADP+ + 2 H2 O
Octadecanoyl-[acp] + NADPH + H+ + Oxygen <=>
Oleoyl-[acp] + NADP+ + 2 H2 O
2
1,2-Diacyl-3-β-D-Galactosyl-sn-Glycerol
=>
Digalactosyl-Diacylglycerol + 1,2-Diacyl-sn-Glycerol
Linoleoyl-[acp] + NADPH + H+ + Oxygen <=> gammaLinolenoyl-[acp] + NADP+ + 2 H2 O
Linoleoyl-[acp] + NADPH + H+ + Oxygen <=> alphaLinolenoyl-[acp] + NADP+ + 2 H2 O
alpha-Linolenoyl-[acp] + NADPH + H+ + Oxygen <=>
Stearidonoyl-[acp] + NADP+ + 2 H2 O
(R)-Pantoat + NADP+ <=> 2-Dehydropantoat +
NADPH + H+
Glycerolipid
B
[249]
Lipid
B
desD, ∆6 -Desaturase [247, 248]
Lipid
B
desB, ∆15 -Desaturase [247, 248]
Lipid
B
desD, ∆6 -Desaturase [247, 248]
Pantothenat
D
2.4.1.129 Undecaprenyl-Diphospho-N-Acetylmuramoyl-(NAcetylglucosamine)-L-Alanyl-D-Glutamyl-Meso-2,6Diaminopimeloyl-D-Alanyl-D-Alanin + H2 O =>
di-Trans,poly-cis-Undecaprenyl diphosphat + [GlcNAc(1->4)-Mur2Ac(oyl-L-Ala-G-D-Glu-A2pm-D-Ala-D-Ala)
4.1.2.22 D-Fructose-6-Phosphat + Orthophosphat => AcetylPhosphat + D-Erythrose-4-Phosphat + H2 O
Peptidoglycan
C
sll1363 kodiert for IlvC (1.1.1.86), welches auch
als 2-Dehydropantoat-2-Reduktase fungieren
kann (in C. glutamicum) [250]
BLAST: Ident., 56%, Score, 670, E-Wert 0.0 zu
Peptidoglycan-Glycosyltransferase von Cyanothece sp. PCC 7424
OPP
C
slr0453
4.1.2.22
D-Fructose-6-Phosphat + Orthophosphat => AcetylPhosphat + D-Erythrose-4-Phosphat + H2 O
OPP
C
sll0529
4.1.2.22
D-Xylulose-5-Phosphat + Orthophosphat => AcetylPhosphat + D-Glyceraldehyd 3-Phosphat + H2 O
OPP
C
slr0453
4.1.2.22
D-Xylulose-5-Phosphat + Orthophosphat => AcetylPhosphat + D-Glyceraldehyd 3-Phosphat + H2 O
OPP
C
sll0529
130
BLAST: Ident., 80.4 %, Score, 1203, E-Wert
0.0 zu D-Xylulose-5-Phosphat/D-Fructose-6Phosphat-Phosphoketolase von Cyanothec sp.
PCC 8801
BLAST: Ident., 67 %, Score, 1163, E-Wert
0.0 zu D-Xylulose-5-Phosphat/D-Fructose-6Phosphat-Phosphoketolase von Acaryochloris
marina MBIC11017
BLAST: Ident., 80.4 %, Score, 1203, E-Wert
0.0 zu D-Xylulose-5-Phosphat/D-Fructose-6Phosphat-Phosphoketolase von Cyanothec sp.
PCC 8801
BLAST: Ident., 67 %, Score, 1163, E-Wert
0.0 zu D-Xylulose-5-Phosphat/D-Fructose-6Phosphat-Phosphoketolase von Acaryochloris
marina MBIC11017
1.14.19.- Oleoyl-[acp] + NADPH + H+ + Oxygen <=> Linoleoyl[acp] + NADP+ + 2 H2 O
1 Photon + 1 P700 + 1 Oxygen => 1 P700p + 1 Superoxid anion
sll0550, 2 NADPH + 2 H+ + Oxygen => 2 NADP+ + 2 H2 O
sll1521
1 Oxygen + 1 QAn => 1 Superoxid anion + 1 QA
sll0741 1.2.7.1
2 Reduced ferredoxin + Acetyl-CoA + CO2 + 2 H+ <= 2
Oxidized ferredoxin + Pyruvat + CoA
Lipid
B
desA, ∆12 -Desaturase [247, 248]
Algemein
-
Mehler-Reaktion am PSI
Algemein
-
Mehler-ähnliche-Reaktion [150]
Algemein
Pyruvat und
TCA
C
Methansäure + 2 Ferricytochrom b1 => CO2 + 2 Ferrocytochrom b1 + 2 H+
2-Oxoglutarat => Succinat semialdehyd + CO2
Glyoxylat
B
ROS-Entwicklung am PSII
BLAST: 77 % Ident., 1940 Score, E-Wert
0,00 zu Pyruvat-Flavodoxin-Oxidoreduktase
von Micorystis aeruginosa
[119]
sll1359
1.2.2.1
sll1981
4.1.1.71
Pyruvat und
TCA
C
4-Aminobutanoat + 2-Oxoglutarat <=> Succinat semialdehyd + L-Glutamat
5’-Phosphoribosylglycinamid + Format + ATP => 5’Phosphoribosyl-N-Formylglycinamid + ADP + Orthophsophat
4-Hydroxybenzoat + Pyruvat <= Chorismat
Pyruvat und
TCA
Purin
B
BLAST Search: Ident., 80%, Score, 911, E-Wert
0.0 zu 2-Oxoglutarat-Decarboxylase von Synechococcus sp. PCC 7002 (SYNPCC7002_A2770)
[142]
[235]
slr1022
2.6.1.19
slr0861
2.1.2.2
B
PurT-Reaktion von GAR-Transformylase [251]
sll1797
4.1.3.40
Chinon und
Tocopherol
B
all-Trans-Nonaprenyl diphosphat + 4-Hydroxybenzoat
=> Diphosphat + 3-Nonaprenyl-4-Hydroxybenzoat
3-Nonaprenyl-4-Hydroxybenzoat + 4 H+ => 2-Methyl6-Solanyl-1,4-benzoquinol + H2 O
Chinon und
Tocopherol
Chinon und
Tocopherol
B
BLAST: Ident., 46 %, Score, 162, E-Wert 6e-42
zu 4-Hydroxybenzoat-Synthetase von Prochlorococcus marinus str. MIT 9303 [129]
PlqA [129]
D
Unbekannte Reaktion, kombinierte Schritte
aus der Plastochinonsynthese [129]
5-Amino-6-(5’-Phosphoribitylamino)uracil + H2 O <=>
5-Amino-6-(1-D-ribitylamino)uracil + Orthophosphat
Reduced FMN + NADP+ <=> FMN + NADPH + H+
Riboflavin
D
unklar, sll0400 Kandidaten-Gen
Riboflavin
C
BLAST: Ident., 87.6 %, Score, 363, E-Wert
e-102 zu NADPH-abhängige-FMN-Reduktase
von Cyanothece sp. ATCC 51142
[252]
slr1350
slr0926
2.5.1.39
sll0936
oder
slr1099
oder
slr1300
sll0400
-
slr0945
1.5.1.38
slr1790
1.3.3.4
2 Protoporphyrinogen IX + 3 Oxygen <=> 2 Protoporphyrin + 6 H2 O
Aminoimidazol-Ribotid + S-Adenosyl-L-Methionin
<=> 4-Amino-2-Methyl-5-Phosphomethylpyrimidin +
L-Methionin + 5’-Deoxyadenosin + Methansäure +
Kohlenmonoxid
ssr0102, L-Cystein + ATP + 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat +
slr0633
L-Tyrosin + S-Adenosyl-L-Methionin + NADPH + 3 H+
=> 4-Methyl-5-(2-Phosphoethyl)-Thiazol + Diphosphat
+ L-Methionin + L-Alanin + 4slr0401 ATP + H2 O + Putrescin => ADP + Orthophosphat +
Putrescin
slr0401 ATP + H2 O + Spermidin => ADP + Orthophosphat +
Spermidin
slr1719 1.14.99.40 Reduced FMN + Oxygen + NADH + H+ => Dimeoder
thylbenzimidazol + D-Erythrose-4-Phosphat + H2 O +
slr0001
NAD+
NADPH + 5 H+ + PQ => NADP+ + PQH2 + 4 H+
slr0001 1.16.8.1 2 Cob(II)yrinat a,c diamid + Reduced FMN <=> 2
Cob(I)yrinat a,c diamid + FMN + 2 H+
Chlorophyll
B
slr0118
-
ThiaminPyrophosphat
D
ThiC, ThiD nicht annotiert, kombinierte Reaktion
ThiaminPyrophosphat
D
BLAST: ssr0102 Ident., 68 %, Score, 98, E-Wert
2e-22 zu ThiS von Nostoc Punctiforme ATCC
29133, kombinierte Reaktion mit ThiG
Transport
B
[253, 254]
sll1500
2.4.2.21
slr1124
3.1.3.73
3.1.3.-
Transport
B
[253, 254]
Riboflavin
D
Algemein
Vitamin B12
C
Nicotinat D-ribonucleotid + Dimethylbenzimidazol
=> Nicotinat + N1-(5-Phospho-Alpha-D-ribosyl)-5,6Dimethylbenzimidazol + H+
Vitamin B12
C
N1-(5-Phospho-Alpha-D-ribosyl)-5,6Dimethylbenzimidazol + H2 O => alpha-Ribazol +
Orthophosphat
Vitamin B12
C
BLAST: slr1719 Ident., 67 %, Score, 278, EWert 3e-76 zu Nitro-Reduktase von Trichodesmium erythraeum IMS101
Zyklischer Elektronenfluss am PS [255–257]
BLAST: Ident., 31 %, Score, 57, E-Wert 4e-10 zu
4-Hydroxyphenylacetat-3-Monooxygenase von
B. melitensis, welches als Corrin-Reduktase
fungieren kann [258]
BLAST: Ident., 61 %, Score, 439, E-Wert e-124
zu Nicotinat-Nucleotid-DimethylbenzimidazolPhosphoribosyltransferase von Cyanothece sp.
PCC 8801
BLAST: Ident., 46 %, Score, 397, E-Wert e-112
zu Ribazol-5’-Phosphatase von Synechococcus
sp. CC9902
131
Anhang A. Netzwerk von Synechocystis sp. PCC 6803
Tabelle A.3.: Erläuterung der zusätzlichen Abkürzungen, die in den Stoffwechselabbildungen in dieser
Arbeit verwendet werden.
zusätzliche Abkürzungen
2OG
2Oiv
2PGL
3HbCoA
3PG
3P-HP
4AB
5PrPP
6PG
A4Sa
AcAh
AcCoA
Ace
AceP
ACP
ADP
ADPG
AIR
Ala
Arg
Asn
Asp
ATP
ATPase
BCoA
ButAc
ButAh
bCaro
Chlp
Chor
Cit
COX
CrCoA
Cys
Cyt b6f
DGDG
DHAP
DmPP
DX5P
E4P
Echi
F6P
FAD
FBP
FNR
Fum
G1P
G6P
GAP
132
2-Oxogluterat
2-Oxoisovalerat
2-Phosphoglycolat
Hydroxy-Butyryl-CoA
3-Phospho-Glycerol-Phosphat
3-Phospho-Hydroxypyruvat
4-Aminobutanoat
5-Phospho-Ribose-1-Diphosphat
6-Phospho-Gluconat
Aspartat-4-Semialdehyd
Acetaldehyd
Acetyl-CoA
Acetat
Acetyl-Phosphat
Acyl-Carrier-Protein
Adenosin-5’-Diphosphat
ADP-Glucose
Aminoimidazol-Ribotid
Alanin
Arginin
Asparagin
Aspartat
Adenosin-5’-Triphosphat
ATP-Synthase
Buyryl-CoA
Butansäure
Butyraldehyd
β-Carotin
Chlorophyll a
Chorismat
Citrat
Cytochrom-c-Oxidase
Crotonoyl-CoA
Cystein
Cytochrom-b6 f -Komplex
Digalactosyl-Diacyl-Glycerol
Dihydroxyaceton-Phosphat
Dimethylallyl-Diphosphat
1-Deoxy-Xylulose-5-Phosphat
Erythrose-4-Phosphat
Echinenon
Fructose-6-Phosphat
Flavin-Adenin-Dinukleotid
Fructose-1,6-Bisphosphat
Ferredoxin-NADP-Reduktase
Fumarat
Glucose-1-Phosphat
Glucose-6-Phosphat
Glyceraldehyd-3-Phosphat
Leu
LpAD
Lys
MaCoA
Mal
mDom
Met
MGDG
MTH
NAD
NADP
NDH
OA
P5C
PC
PEP
PepGlc
PG
PG2
PG3
Phe
Pho
Phyq
Ppg
PPP
PQ
Prep
Pro
PS I
PS II
Ptd
Ptsn
Pyr
R5P
Rbfv
Ru5P
RuBP
S7P
SAM
SBP
ScCoA
SDH
Ser
Spmd
SPP
SQDG
Ssa
Suc
Sul
Leucin
Lipid A-Disaccharid
Lysin
Malonyl-CoA
Malat
meso-2,6-Diaminopimelat
Methionin
Monogalactosyl-Diacyl-Glycerol
Methyltetrahydrofolat
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NADPH-Dehydrogenase
Oxalactet
Pyrrolin-5-Carboxylat
Plastocyanin
Phosphoenolpyruvat
Peptidoglycan
Phosphatidyl-Glycerol
Glycerat-2-Phosphat
Glycerat-3-Phosphat
Phenylalanin
Phosphat
Phyllochinon
Protoporphyrinogen
Phytyl-Diphosphat
Plastochinon
Prephenat
Prolin
Photosystem I
Photosystem II
Phosphatidat
Putrescin
Pyruvat
Ribose-5-Phosphat
Riboflavin
Ribulose-5-Phosphat
Ribulose-1,5-Bisphosphat
Sedoheptulose-7-Phosphat
S-Adenosylmethioninamin
Sedoheptulose-1,7-Bisphosphat
Succinyl-CoA
Succinat-Dehydrogenase
Serin
Spermidin
Solanyl-Diphosphat
Sulfoquinovosyldiacyl-Glycerol
Succinat-Semialdehyd
Succinat
Sulfur
gCaro
GgPP
GL
GL6P
Gln
Glu
GLX
Gly
GSH
His
HP
Hser
Icit
Ile
IpPP
γ-Carotin
Geranylgeranyl-Diphosphat
Glycolat
6-Phospho-Gluconolacton
Glutamin
Glutamat
Glyxoylat
Glycin
Glutathion
Histidin
Hydroxypyruvat
Homoserin
Isocitrat
Isoleucin
Isopentenyl-Diphosphat
THF
ThPP
Thr
Toco
Trp
TSDH
Tyr
Upg III
UpPP
Val
Vit B6
Vit B12
X5P
Zea
Tetrahydrofolat
Thiamin-Diphosphat
Threonin
Tocopherol
Tryptophan
Tartronat-Semialdehyd
Tyrosin
Uroporphyrinogen III
Undecaprenyl-Diphosphat
Valin
Vitamin B6
Vitamin B12
Xylulose-5-Phosphat
Zeaxanthin
Tabelle A.4.: Beschreibung der Reaktionen, die eine abfallenden Flussaktivität bei der Variabilitätsanalyse
für die Synthese von Ethylen aufweisen (Abbildung 5.4).
Reaktionsnummer
Gen
ECNummer
Reaktion
Stoffwechselweg
R464
sll1182, sll1316,
sll1317, slr0342,
slr0343, slr1185,
sml0004,
smr0003,
smr0010
sll1182, sll1316,
sll1317, slr0342,
slr0343, slr1185,
sml0004,
smr0003,
smr0010
sll1182, sll1316,
sll1317, slr0342,
slr0343, slr1185,
sml0004,
smr0003,
smr0010
sll1182, sll1316,
sll1317, slr0342,
slr0343, slr1185,
sml0004,
smr0003,
smr0010
sll1182, sll1316,
sll1317, slr0342,
slr0343, slr1185,
sml0004,
smr0003,
smr0010
sll1182, sll1316,
sll1317, slr0342,
slr0343, slr1185,
sml0004,
smr0003,
smr0010
sll1327, sll1323,
sll1322, ssl2615,
sll1324, sll1325,
sll1326, slr1329,
slr1330
-
1.10.99.1
PQH2 + 1 Oxidized rieske_B6 => PQH_B6_L + 1 Reduced rieske_B6 + 1 H+
Cyt b6f (Q-Zyklus)
1.10.99.1
1 Reduced rieske_B6 + 1 Oxidized plastocyanin => 1 Oxidized rieske_B6 +
1 Reduced plastocyanin
Cyt b6f (Q-Zyklus)
1.10.99.1
PQH_B6_L + 1 HB3p_B6 => PQ_B6_S + 1 HB2p_B6 + 1 H+
Cyt b6f (Q-Zyklus)
1.10.99.1
PQ_B6_S => PQ
Cyt b6f (Q-Zyklus)
1.10.99.1
PQ_B6_S + 1 HB2p_B6 + 1 H+ => PQH_B6_S + 1 HB3p_B6
Cyt b6f (Q-Zyklus)
1.10.99.1
PQH_B6_S + 1 HB2p_B6 + 1 H+ => PQH2 + 1 HB3p_B6
Cyt b6f (Q-Zyklus)
3.6.3.14
14 H+ + 3 ADP + 3 Orthophosphat => 3 ATP + 3 H2 O + 14 H+
ATPase
-
1 O2 _ext <=> 1 O2 _cyt
Transport
R465
R466
R467
R468
R469
R492
R670
%recalctypearea
133
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Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Wolfgang
Lockau und bei Prof. Dr. Hanspeter Herzel bedanken, für die Möglichkeit, am Institut für Theoretische Biologie meine Dissertation anfertigen zu dürfen und die Bereitschaft, meiner Promotionskommission beizuwohnen.
Mein ganz besonderer Dank geht an Dr. Ralf Steuer, für seine allumfassende, unermüdliche Hilfe, für die allzeitige Unterstützung und die kompetente wissenschaftliche
Betreuung. Vielen Dank für all die Ratschläge und die vielen Anregungen während
meiner Arbeit!
Ein großer Dank geht auch an Sabrina Hoffmann, Robert Lehmann, Neil Swainston und besonders Christian Beck für viele fruchtbare Diskussionen und die gute
Zusammenarbeit.
Besonderer Dank geht an Dr. Yvonne Zilliges und Dr. Marianne Gründel und den
Rest der Arbeitsgruppe ’Biochemie der Pflanzen’ für die Durchführung der Experimente und Analysen, die im Laufe meiner Arbeit im Labor anfielen sowie die kompetente
Beratung.
Auch herzlichen Dank an Prof. Dr. Martin Hagemann und Dr. Marion Eisenhut für
den fachlichen Beistand und die vielen Antworten zu meinen Fragen rund um die Cyanobakterien und speziell zur Photorespiration und den Phosphoserin-Weg.
151
Den ehemaligen Mitglieder des FORSYS-Partner-Projekts: Systembiologie der Produktion von Biokraftstoffen durch Cyanobakterien und den Mitgliedern des DirectFuelProjekts, besonders Dr. Patrik Jones gilt mein Dank für die Unterstützung und fachlichen Diskussionen vor allem bei der Netzwerkrekonstruktion und der Analyse der
Biokraftstoffsynthesen.
Natürlich möchte ich mich auch bei der DFG und der Europäischen Kommission
bedanken, die es mir überhaupt ermöglichten, ohne finanzielle Not an diesem Projekt
zu arbeiten und nebenbei die verschiedensten Orte der Welt im Rahmen des wissenschaftlichen Austausches zu besuchen und dabei neue Leute kennenzulernen.
Was nützt die interessanteste Arbeit ohne die freundschaftliche Atmosphäre am
Arbeitsplatz? Deswegen will ich mich ganz herzlich bei meinen Bürokollegen und der
Arbeitsgruppe ’Metabolic Network Analysis’ bedanken, ganz besonders Ilka, Stefanie,
Nils und erneut Christian für die schöne Zeit auch außerhalb des ITBs, wie zum Beispiel bei hart umkämpften Matches auf dem Badmintonplatz.
Ein besonders lieber Dank geht an Jasmin Weisemann und Alexander Ahlert, die
mich tatkräftig bei dieser Arbeit unterstützten und immer wieder neu motivierten.
Vielen Dank für Eure Unterstützung und für die schöne Zeit neben der Arbeit.
Zum Abschluss gilt mein aller größter Dank meinen Eltern, die mich bis zum heutigen Zeitpunkt in jeder Hinsicht unterstützt haben, an mich glaubten und mir alles
ermöglicht haben. Ich danke Euch von ganzem Herzen!
152
Selbständigkeitserklärung
Hiermit versichere ich, die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt und keine weiteren als die angegebenen Hilfsmittel und Quellen verwendet zu haben.
Berlin, 9. Februar 2014
.............................
Henning Knoop
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Seele and Geist
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