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In vitro-Hauttestsysteme zur Untersuchung

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W I S S ENS CHAFT · S PECIA L : 3 D- ZE LLKULT UR
Gewebemodelle
In vitro-Hauttestsysteme zur Untersuchung lichtassoziierter Hautschädigung
SIBYLLE THUDE 1 , PETRA J. KLUGER 1, 2 , KATJA SCHENKE-LAYLAND 1, 3
1 FRAUNHOFER-INSTITUT FÜR GRENZFLÄCHEN- UND BIOVERFAHRENSTECHNIK,
STUTTGART
2 HOCHSCHULE REUTLINGEN
3 UNIVERSITÄT TÜBINGEN UND UNIVERSITY OF CALIFORNIA, LOS ANGELES, USA
Sunlight has various effects on human health. Several important metabolic processes are only enabled by sunlight. But longtime sun bathing
and extended outdoor activities can cause skin irritation, inflammation or
even skin cancer due to high radiation dose. We developed in vitro skin
models of different complexity to investigate UV-light associated skin
damage. Substances and their phototoxic, sun protective or photo-sensitizing potential can be analyzed to prevent white skin cancer.
DOI: 10.1007/s12268-015-0557-z
© Springer-Verlag 2015
Humanes in vitro-Hauttestsystem zur
Beurteilung phototoxischer
Substanzen
ó Hautirritationen und Hautschädigungen
werden durch übermäßige Lichtexposition
hervorgerufen. Bei gleichzeitiger Einwirkung
bestimmter chemischer Substanzen reichen
jedoch geringe Mengen an Licht – insbeson-
A
dere UV-Licht – aus, um eine phototoxische
Reaktion auszulösen. Dabei ist es bedeutungslos, ob diese phototoxischen Substanzen durch Auftragung auf die Haut, Einnahme über den Magen-Darm-Trakt oder intravenös verabreicht werden. Der zugrunde liegende Mechanismus beruht auf der Veränderung der chemischen Substanz durch die
C
Aufnahme von Lichtenergie, sodass die Haut
mit Schwellung, Rötung und Entzündung,
ähnlich wie bei einem Sonnenbrand, reagiert.
Zur Bestimmung des phototoxischen Potenzials von Substanzen haben wir ein akkreditiertes in vitro-Testverfahren aufgebaut, für
das ein humanes dreidimensionales Epidermismodell eingesetzt wird. Der Aufbau des
Epidermismodells erfolgt mit primären Keratinozyten, die aus humaner Haut isoliert werden. Durch spezielle Kultivierungsbedingungen entwickelt sich während einer zweiwöchigen Aufbauphase ein Hautmodell mit mehreren Schichten vitaler epidermaler Zellen
(Stratum basale, Stratum spinosum und Stratum granulosum) unter einer gut ausgebildeten Hornschicht, dem Stratum corneum.
Der Nachweis einer ausreichenden Barrierefunktion wie auch die histologische Kontrolle des Aufbaus sind wichtige Qualitätsmerkmale des Epidermismodells, die vor dem Einsatz zu prüfen sind. Die Testsubstanz wird
auf das Hautmodell appliziert und mit einer
definierten, jedoch nicht toxischen UV-Strahlung behandelt (Abb. 1A, B). Im Anschluss
ist die Vitalität des bestrahlten und behandelten Hautmodells im Vergleich zu mitgeführten Positiv- und Negativkontrollen zu
bestimmen. Ist die Vitalität um mehr als
30 Prozent im Vergleich zum behandelten,
nicht-bestrahlten Epidermismodell reduziert,
wird die Testsubstanz als phototoxisch beurteilt (Abb. 1C, [1]).
Untersuchung neuartiger Substanzen
zur Modulation der Hautpigmentierung
B
˚ Abb. 1: Vergleich von Epidermismodellen, die mit UV-A-Licht (5 J/cm2) bestrahlt wurden.
A, Modell mit vorheriger topischer Applikation einer phototoxischen Substanz. B, Kontrollmodell
ohne Substanzauftrag. C, Die Berechnung der Vitalität und Bestimmung des phototoxischen
Potenzials erfolgt anhand mitgeführter Kontrollen. Maßstab: 50 μm.
Melanozyten übernehmen in unserer Haut
eine wichtige Schutzfunktion. Sie sind in
Haarfollikeln und in der Basalschicht der
Epidermis zu finden. Bei Sonneneinwirkung
bilden sie ein wichtiges, UV-absorbierendes
Pigment, das Melanin. Dieses geben sie über
ihre dendritischen Fortsätze an umliegende
Keratinozyten weiter, deren Erbgut vor der
schädlichen UV-Strahlung geschützt wird
[2]. Neben der Entwicklung von Sonnenschutzmitteln beschäftigt sich die Kosmetikindustrie auch mit der Entwicklung von
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melanogenen Substanzen, die als Selbstbräuner Anwendung finden sollen. Im Gegensatz zu konventionellen Selbstbräunern,
die lediglich die Hornschicht durch eine chemische Reaktion tönen [3], jedoch keinen
UV-Schutz bieten, steigern die melanogenen
Substanzen die Melaninproduktion, wodurch
der endogene Sonnenschutz erhöht wird. Bei
Untersuchungen an einfachen Melanozytenoder zweidimensionalen Ko-Kulturen mit
Keratinozyten sind die zwischen den Hautzellen ablaufenden Interaktionen limitiert,
da der dreidimensionale Gewebeaufbau die
Eigenschaften der Zellen wesentlich beeinflusst [4]. Die Integration von Melanozyten
in die in vitro-Hautmodelle eröffnet somit
neue Möglichkeiten, die Pigmentbildung
unter Berücksichtigung der Zell-Zell-Interaktionen an einem dreidimensionalen
Modell zu untersuchen (Abb. 2). Mit immunhistologischen Färbungen lassen sich Melanozyten in den pigmentierten Hautmodellen spezifisch nachweisen. Durch Bestrah-
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lung mit UV-Licht definierter Wellenlänge
konnten wir die Melaninproduktion in den
in vitro-Hautmodellen steigern und durch
Quantifizierung des Melaningehalts nachweisen. Auch die Behandlung mit L-Dihydroxyphenylalanin (DOPA), eine Vorstufe des
Melanins und als melanogene Substanz
bekannt, resultierte in einer gesteigerten
Melaninsynthese. Unser pigmentiertes Hautmodell soll zukünftig zur Entwicklung von
neuartigen UV-protektiven Substanzen und
Formulierungen beitragen.
In vitro-Hautmodelle für
unterschiedliche Stadien des hellen
Hautkrebses
Allein in Deutschland erkranken jährlich
mehr als 300.000 Menschen an hellen Hautkrebsformen, Tendenz steigend. Diese treten
bevorzugt an sonnenexponierten Stellen auf
[5], den Sonnenterassen des Körpers, wie
Stirn, Nase, Lippen, unbehaarte Kopfhaut,
Hände und Unterarme. Die aktinische Kera-
tose ist die häufigste Form. Als Präkanzerose
(Vorstufe) führt sie unbehandelt oft zu einem
invasiven Plattenepithelkarzinom, das aufgrund seiner Herkunft auch spinozelluläres
Karzinom (SCC) genannt wird [6]. Entartete
Keratinozyten dringen durch die Basallamina
und infiltrieren die Dermis, wobei es auch
zur Metastasierung kommen kann [7]. Neben
chirurgischen Verfahren stehen auch zahlreiche nicht-chirurgische Verfahren, darunter die photodynamische Therapie (PDT) zur
Verfügung. Die betroffenen Hautstellen werden mit einem Photosensitizer behandelt. Die
Krebszellen nehmen diesen schneller als
gesunde Hautzellen auf, wodurch sie lichtempfindlicher sind. Bei der anschließenden
Bestrahlung mit Rotlicht werden die nun lichtempfindlichen Krebszellen geschädigt und
gehen selektiv zugrunde.
Durch die Integration einer SCC-Zelllinie
in unsere in vitro-Hautmodelle lassen sich
unterschiedliche Stadien des hellen Hautkrebses nachstellen. In frühen Stadien wird
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¯ Abb. 2: In vitro-Hautmodelle zur Untersuchung lichtassoziierter Hautschädigungen.
Links: Basismodell für die
Phototoxizität. Mitte: mit
Melanozyten erweitertes
Modell für Untersuchungen
von UV-protektiven Substanzen. Rechts: heller Hautkrebs
in unterschiedlichen Stadien
für die Entwicklung von Photosensitizern.
eine Mischung aus Keratinozyten und der
SCC-Zelllinie zum Aufbau der Epidermis verwendet. Im Vollhautmodell sind zusätzlich
SCC-Zellen in die Dermis integriert. Hingegen besteht die Epidermis bei den späten Stadien nur aus SCC-Zellen (Abb. 2). Mithilfe
der Raman-Spektroskopie konnten wir gesunde und entartete Keratinozyten in unseren
in vitro-Modellen eindeutig voneinander
unterscheiden [8], was durch klassische
immunhistologische Färbungen nicht möglich ist [9]. Die topische Applikation eines
Photosensitizers und anschließende Rotlichtbestrahlung resultierte in einer selektiven Schädigung der SCC-Zelllinie, wie sie
in vivo bei der PDT zu beobachten ist. Zukünftig können die in vitro-Modelle des hellen
Hautkrebses helfen, das Fortschreiten des
Krebsstadiums besser zu verstehen und die
Entwicklung neuer therapeutischer Strategien erleichtern.
ó
Literatur
[1] OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4,
Health Effects. Test No. 432: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity
Test (2004), doi: 10.1787/9789264071162-en
[2] Gratzl M (2005) Haut. In: Junqueira L, Carneiro J, Gratzl
M. Histologie. 6. Aufl. Springer Medizin, Heidelberg, 305–318
[3] Hölzle E (2003) Selbstbräuner und Lichtschutzmittel:
Möglichkeiten und Gefahren. In: Plewig G, Thomas P.
Fortschritte der praktischen Dermatologie und Venerologie.
Springer, Berlin, S 395–404
[4] Boelsma E, Ponec M (2000) Basics (Guidelines) on Cell
Culture Testing for Topical/Dermatological Drugs/Products
and Cosmetics With Regard to Efficacy and Safety of the
Preparations. In: Gabard B, Surber C, Elsner P et al.
Dermatopharmacology of Topical Preparations. Springer,
Berlin, 37–57
[5] Weedon D (2010) Tumors of the epidermis. In: Weedon D
(Hrsg) Weedon’s skin pathology. 3. Aufl. Churchill
Livingstone, Edinburgh, 667–708
[6] Glogau R (2000) The risk of progression to invasive disease. J Am Acad Dermatol 42:23–24
[7] Boukamp P (2005) Non-melanoma skin cancer: what
drives tumor development and progression? Carcinogenesis
26:1657–1667
[8] Brauchle E, Johannsen H, Nolan S et al. (2013) Design and
analysis of a squamous cell carcinoma in vitro model system.
Biomaterials 34:7401–7407
[9] Commandeur S, De Gruijl FR, Willemze R et al. (2009) An
in vitro three-dimensional model of primary human cutaneous
squamous cell carcinoma. Exp Dermatol 18:849–856
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Petra Kluger
Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und
Bioverfahrenstechnik (IGB)
Abteilungsleitung Zellsysteme
Gruppenleiterin Biomaterialien und Testsysteme
Nobelstraße 12
D-70569 Stuttgart
Tel.: 0711-970-4072
petra.kluger@igb.fraunhofer.de
www.igb.fraunhofer.de
AUTORINNEN
Sibylle Thude
1991–1998 Studium der Technischen Biologie an der Universität Stuttgart. Seit 1998
wissenschaftliche Mitarbeiterin der Abteilung Zellsysteme (ZS) am Fraunhofer-Institut
für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Stuttgart. Seit 2008 Prüfleiterin des
Akkreditierten Prüfbereichs ZS und verantwortlich für standardisierte Prüfverfahren.
Petra Kluger
2000–2006 Studium der Technischen Biologie an der Universität Stuttgart, dort 2009
Promotion. 2009–2013 Arbeitsgruppenleiterin am Fraunhofer-Institut für Grenzflächenund Bioverfahrenstechnik (IGB), Stuttgart. Seit 2013 Abteilungsleiterin am FraunhoferIGB, Stuttgart, und Professorin an der Hochschule Reutlingen.
Katja Schenke-Layland
Biologiestudium, 2004 Promotion an der Universität Jena. 2005–2008 Postdoc, University of California Los Angeles (UCLA), USA. 2008–2009 Assistant Research Professor, UCLA. 2010–2013 stellvertretende Abteilungsleiterin Fraunhofer-Institut für
Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Stuttgart. Seit 2013 Abteilungsleiterin
am Fraunhofer-IGB, Professorin an der Universitätsfrauenklinik Tübingen und Adjunct
Associate Professor, UCLA.
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