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Felix Stehle - TU Dortmund

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Plant Biotechnology
Methoden und pharmazeutische Arzneimittel
Felix Stehle
felix.stehle@bci.tu-dortmund.de
Transgene Pflanzen
Vorurteile und Ängste
2
Genfood_2 fotocommunity.de - www.pfalz-express.de - sueddeutsche.de - studierendenwerk-kaiserslautern.de
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Transgene Pflanzen
Was für „Gen“-Pflanzen gibt es hauptsächlich?
Bt-Mais – mit Insekten- und herbizidresistenz
wie der „Genmais 1507“
3
gensuisse.ch
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Transgene Pflanzen
Was ist sonst noch möglich?
Verbesserter Pflanzenschutz gegen Fraßfeinde und
Pflanzenerkrankungen
Erhöhte Konzentrationen an Naturstoffen in Pflanzen
Neuartige Naturstoffe/ -strukturen (Biosimilars) mit
veränderter biologischer Aktivität
Neue Blüten- und Lebensmittelfarbstoffe
Neue Geschmacks- und Parfümstoffe
Vermeidung unerwünschter Nebeneffekte (Toxizität,
Allergien)
Verbesserter kalorischer und ernährungsphysiologischer Wert von Nahrungsmittel
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„Versteckter Hunger“
Vitamin-A-Mangel in Entwicklungsländern
140 Mio Kinder betroffen
500 000 erblinden jedes Jahr
250 000 sterben jedes Jahr
5
userpage.fu-berlin.de
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Golden rice
Das Vorzeigeprojekt
Erhöhung der Provitamin A Menge um den
Faktor 23
Anbau auf den Philippinen ab 2016
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allowgoldenricenow.org
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Transformationsmethoden
Wie kommt das „Gen“ in die Pflanze
Infektion mit Agrobakterium
Infektion mit viralen Vektoren
Biolistischer Gentransfer
Transformation von Protoplasten
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
A. tumefaciens
Wurzelhals-Gallen
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A. rhizogenes
Hairy roots
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
A. tumefaciens und A. rhizogenes
Gram-negativ
Induktion von Pflanzen-Tumoren nach Verletzung
Transfer von Bakterien DNA in Pflanzenzelle
Auslöser sind Plasmide
Ti (tumor inducing)-Plasmind
Ri (root inducing)-Plasmind
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
vir-Gene (Virulenz-)
Tumorentstehung
DNA-Transfer
Wirtsspezifität
induzierbar durch phenolische Moleküle
(z.B. Acetosyringon) und Monosaccharide
Produktion im Wundbereich verletzter
Pflanzen
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
T-DNA (Transfer-)
LB- , RB-Region
Transfer und Einbau in
Pflanzengenom
Pathogenitätsgene (onc)
Auslösung des Tumor-ähnlichen Wachstums
(Gene des Auxin und Cytokinin Stoffwechels)
Gene für Synthese von Opinen
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
Opin Katabolsimus
Opine =
α-Ketosäure + Aminosäure
Pflanzenzelle kann diese
nicht metabolisierten
werden sezerniert
Gene für Opinkatabolismus auf Ti-Plasmid
N2-, C-, Energiequelle für A. tumefaciens
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
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Current Opinion in Biotechnology (2006) 17:147-154
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
 Agrobacterium erkennt Wirtszelle und
docked an
 Verwundete Pflanzenzelle scheidet
penolische Signale aus
 Weiterleitung der pflanzen-spez. Signale
durch VirA–VirG. VirG-vermittelte
Signaltransduktion aktiviert vir-Gene
 Erstellung einer Kopie der T-DNA und
Hydrolyse des sense-Stranges durch VirD
(T-strand, ssDNA)

15
Bildung des VirB–VirD4 TransportKomplexes, Transport odes T-strands
und der Vir Proteine
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Sense-, Antisense-Nukleinsäurestränge
16
www.pharmazeutische-zeitung.de
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium

Bildung des mature T-Komplexes

Import des T-Komplexes in den Nukleus
durch die pflanzeneignen Proteine
AtKAP α , VIP1, Ran
-
Intranuklearer Transport des
T-Komplexes zu Chromosomen, Einbau
der T-DNA in das Genom durch VirD2
und/oder VirE2 und wirtspez. Faktoren
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
Was benötigt man für biotechnologische Nutzung?
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
Aufspaltung in 2 Plasmide, binäres Vektorsystem
natürliches Ti-Plasmid zu groß
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
vir-Gene
LB-, RB-Regionen
ori für E. coli
Resistenz für E. coli
Resistenz für Pflanze
Transgen mit pflanzenspez. Promotor und
Terminator
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium
Transiente Expression
keine dauerhafte Expression
(Plasmid oder nicht in Keimzellen vorhanden)
Stabile Expression
dauerhafte Expression
(Transgen wird auf Nachkommen übertragen)
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium - transient expression
Nicotiana benthamiana - syringe
22
Nature Protocols 9, 1010–1027 (2014) - bio.tu-darmstadt.de
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium - transient expression
Nicotiana benthamiana - vaccum
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium - stabile Expression
Arabidopsis thaliana
„floral dip“
24
Agricultural and Biological Sciences "Transgenic Plants - Advances and Limitations“ - pbrc.org - science.leidenuniv.nl - sites.google.com - Nature Comm. 4, 2875
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium - stabile Expression
leaf disc-Transformation
25
Molecular Biology of the Cell, 4th edition
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Transformationsmethoden
Infektion mit Agrobakterium - stabile Expression
leaf disc-Transformation
SI- shoot induction ; RI - root induction
26
agron-www.agron.iastate.edu
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Zellkulturmethoden
Überblick
Suspensionkultur
(Einzelzellen)
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scq.ubc.ca
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Kallus Kulturen
Definition
undifferenzierte, totipotente Zellen
Wachstum auf Nährboden
Induktion durch Phytohormone
Totipotent:
Fähigkeit einen vollständigen bzw.
eigenständigen Organismus zu bilden
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dsmz.de
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Kallus Kulturen
Herstellung
Pflanzenmaterial
(Blätter, Wurzel …)
Oberflächensterilisierung
Überführen von Pflanzenorganen auf
Nährstoffagar mit Phytohormonen
Kallusformation (Proliferation)
Konzentrationsverhältnisse
von Pyhtohormonen
entscheidend für Kallus-,
Spross- und Wurzelbildung
Besonders wichtig:
Auxin und Cytokinine
Überführen des Kallusgewebe auf
Nährstoffagar mit Phytohormonen
Kalluskultur
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Kallus Kulturen
Verwendung
Produktion von sekundären Pflanzenstoffen
Synthese von Vorläufermolekülen, die
chemisch modifiziert werden können
Ausgangsmaterial für die vegetative
Vermehrung von Pflanzen
Stamm-Material für Hochleistungssorten
(Erhaltungszucht)
30
dsmz.de
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Transformationsmethoden
Biolistischer Gentransfer
gene gun
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Transformationsmethoden
Biolistischer Gentransfer
geeignet für Pflanzen, Tiere, Mikroben
transiente und stabile Expression möglich
benötigt nur geringe Mengen an DNA
keine carrier-DNA notwendig
mehrere Plasmide können gleichzeitig
eingebracht werden
für sehr große DNA-Fragmente geeignet
in situ, in vitro, in vivo und ex vivo
Transformation möglich
37
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Transformationsmethoden
Biolistischer Gentransfer
DNA-Partikel werden auf Wolfram- oder GoldPartikel geladen
Beim Durchtritt durch Gewebe wird DNA vom
Partikel abgestreift
Fremd-DNA kann so auch in Mitochondrien
oder Chloroplasten eingebracht werden
Transformationseffizienz: 1-5 %
38
Trends Biotechnol. (2007) 25(11):530-4
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Transformationsmethoden
Biolistischer Gentransfer
Helios (Bio-Rad) gene gun-Prinzip
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Trends Biotechnol. (2007) 25(11):530-4 - http://imgarcade.com
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Transformationsmethoden
Biolistischer Gentransfer - workflow
transgenic tomato plant
40
learn.genetics.utah.edu
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Biotechnologische Nutzung
Medizinische Anwendungen
Metabolic engineering
Therapeutische Proteine
Enzyme
Antikörper
46
sciencemag.org - northeastern.edu
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Metabolic engineering
Atropa belladonna – Schwarze Tollkirsche
Überexpression der H6H
aus Hyoscyamus niger
(Bilsenkraut)
H6H - Hyoscyamin-6β-hydroxylase
47
Gentechnik-Biotechnik, Kap. 4, S. 162 - de.honatur.com
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Metabolic engineering
Atropa belladonna – Schwarze Tollkirsche
48
Gentechnik-Biotechnik, Kap. 4, S. 162
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Metabolic engineering
Atropa belladonna – Schwarze Tollkirsche
Scopolamin
Giftstoff, Wahrheitsdroge
Vorkommen in Solanaceae-Arten
Grundstoff für Buscopan®
Scopoderm® TTS Pflaster
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Therapeutische Proteine
β-Glucocerebrosidase
Imiglucerase = humane β-Glucocerebrosidase
Produktion in CHO Zellen und
Glycan-Modelling
„Orphan Drug“ bei Morbus Gaucher
Therapiekosten: 140.000 € pro Jahr
Orphan Drug: Arzneimittel für seltene Leiden
50
Gentechnik-Biotechnik, Kap. II.19, S. 801
© Felix Stehle - 2015
Therapeutische Proteine
β-Glucocerebrosidase
Morbus Gaucher
Störung des Fettstoffwechsels
verringerte Aktivität der Glucocerebrosidase in
Lysosomen aufgrund von Mutationen
Glucocerebroside (zuckerhaltige Fettstoffe)
werden nicht gespalten
Anreicherung in Makrophagen und in Monozyten
Freisetzung von Zytokinen
entzündliche Zerstörung innerer Organe und Skelett
51
Gentechnik-Biotechnik, Kap. II.19, S. 801
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Therapeutische Proteine
β-Glucocerebrosidase
Glycan-remodeling
Freilegen der Mannose-Reste ()
Bindung an Mannose-Rezeptor auf
Makrophagen
Effektivere Aufnahme
52
Gentechnik-Biotechnik, Kap. II.19, S. 801
© Felix Stehle - 2015
Therapeutische Proteine
β-Glucocerebrosidase
Daucus carota
53
Gentechnik-Biotechnik, Kap. II.19, S. 801 - Nature Biotechnology 30, 472 (2012)
© Felix Stehle - 2015
Therapeutische Proteine
β-Glucocerebrosidase
Glykanstruktur nach
Produktion durch
Daucus carota macht
Modifikation unnötig
54
Plant Biotechnology Journal (2007) 5, 579–590
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Therapeutische Proteine
β-Glucocerebrosidase
Absolute Aufnahme
Kinetik
Erhöhte Aufnahmeraten in die Makrophagen
ohne nachträgliche Modifikation
55
Plant Biotechnology Journal (2007) 5, 579–590
© Felix Stehle - 2015
Therapeutische Proteine
β-Glucocerebrosidase
seit 2012 von der FDA zugelassen
seit 2014 auch für Kinder
noch keine Zulassung in Europa
erstes plant-made Arzneimittel mit FDAZulassung
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